人脐带间充质干细胞裂解液在体外对食管癌EC9706细胞增殖与迁移的抑制作用

目的探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)裂解液在体外对食管癌EC9706细胞增殖、迁移的抑制作用。方法用组织块培养法体外培养hUCMSCs,流式细胞仪检测细胞表型;收集hUCMSCs,并用反复冻融法制备hUCMSCs裂解液;不同浓度hUCMSCs裂解液作用于食管癌EC9706细胞一定时间,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖状况,倒置显微镜观察细胞形态。通过Tranwell迁移实验观察hUCMSCs裂解液对食管癌EC9706细胞迁移能力的影响。结果人脐带组织块培养7¹2 d后可见贴壁的成纤维样细胞,流式细胞仪分析显示第5代细胞均表达CD29、CD90和CD166,不表达CD34、CD45和人类白细胞抗原-DR。MTT法显示加入hUCMSCs数等于或大于食管癌细胞数的裂解液时,与对照组比较明显抑制食管癌细胞的生长(P<0.05),且实验组各组抑制食管癌细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05)。Tranwell迁移实验显示,实验组EC9706细胞的迁移较对照组明显受到抑制(P<0.05)。结论 hUCMSCs裂解液对食管癌细胞EC9706的增殖和迁移均有抑制作用。     

人脐带间充质干细胞促进肝癌细胞的增殖和转移

目的:研究人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UC－MSCs)在体内?体外实验中对人肝癌细胞株HepG2的增殖和转移作用?方法:将UC－MSCs在无血清DMEM/F12培养基中培养48 h,收集上清液(MSCs－CM)?加入到HepG2的培养基中,使其在HepG2培养基的终浓度为25%?50%和75%作为实验组,DMEM/F12作为对照组,采用CCK－8法检测细胞增殖效应?其后使用Transwell法检测细胞的侵袭效应?建立裸鼠皮下肿瘤模型,健康雌性裸鼠12只随机分为A(HepG2细胞单/左侧皮下成瘤)?B(UC－MSCs+HepG2预混单/左侧皮下成瘤)?C(左侧HepG2?右侧UC－MSCs+HepG2皮下成瘤)3组(n = 4),每隔7 d监测成瘤体积变化,50 d后统一处死称量肿瘤湿重?结果:经各浓度MSCs－CM 处理后HepG2细胞增殖能力较对照组明显增高(P < 0.05);实验组侵袭能力明显高于对照组(P < 0.01)?50 d后皮下肿瘤湿重测得A组(0.054 2 ± 0.011 2)g?B组(0.292 0 ± 0.156 9)g?C组[左侧(0.089 4 ± 0.024 2)g?右侧(0.332 6 ± 0.102 9)g],并且从定期体积测量数据发现,两组体积的差异随着时间的推移逐渐增大(P < 0.05)?结论:UC－MSCs能促进HepG2的生长和转移,并且这种对肿瘤的增殖和侵袭促进作用可能与UC－MSCs分泌的一些因子有关?     

脐带间充质干细胞对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)抑制人卵巢癌SKOV3细胞增 殖及促进其凋亡的作用。方法：采用Transwell共培养观察UC-MSCs向卵巢癌细胞靶向归巢的作用;MTT 实验检测UCMSCs 条件培养基抑制SKOV3细胞增殖情况;Annexin V-FITC/PI双染法检测其凋亡率;实时PCR检测与SKOV3细胞增殖 和凋亡相关基因Ki-67,Bax,Bcl-2的表达。结果：UC-MSCs体外向SKOV3细胞靶向归巢。MTT 结果显示UC-MSCs条件 培养基明显抑制SKOV3细胞的增殖(P<0.01)。Annexin V-FITC/PI双染法提示75%条件培养基组的凋亡率明显高于对照 组(P<0.05)。实时PCR发现增殖相关基因Ki-67的表达明显下降(P<0.01),凋亡相关基因Bcl-2的表达明显降低(P<0.01), Bax的表达明显增加(P<0.01)。结论：UC-MSCs体外能向卵巢癌细胞靶向归巢,通过调节增殖相关基因Ki-67的表达, 抑制SKOV3细胞增殖;通过调节凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达,促进SKOV3细胞凋亡。     

人脐带间充质干细胞对肝癌细胞增殖性及凋亡的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchyma cell, MSC)对肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)癌细胞增殖和凋亡的影响,为HCC的治疗提供新的思路。 方法 取50%覆盖率的MSC培养皿,换上新鲜的DMEM/F-12培养基,待其培养至100%的覆盖率后收集培养基备用,即为MSC条件培养基。用新鲜DMEM/F-12培养基加上等量的MSC条件培养基的混合培养基培养HepG₂人类肝癌细胞株24、48和72h,使用MTT法测定HepG₂细胞的增殖活性、通过Hoechest33342和PI双染色后在荧光倒置显微镜下观察计数以测定HepG₂细胞的凋亡、用Transwell侵袭实验和黏附实验测定HepG₂细胞侵袭能力以及通过Western blot法检测凋亡相关信号通路蛋白的表达。 结果 混合培养基培养HepG₂细胞24h后,对其生长和凋亡及侵袭黏附能力没有显著影响(P>0.05)。但是培养延长到48h和72h后,HepG₂细胞的活性、增殖能力、侵袭能力和黏附能力都受到显著的抑制,这些变化伴随着细胞分裂相关因子Ki-67、PCNA和组蛋白H3磷酸化水平下调,以及细胞凋亡执行者caspase-3的激活和抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制。 结论 体外间接共培养实验表明,人脐带间充质干细胞具有抑制肝脏肿瘤细胞增殖及促进其凋亡的作用。     

人骨髓间充质干细胞表达外源性IL-24基因对肺癌细胞A549增殖的影响

目的探讨以人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)为基因治疗载体表达外源性IL-24对肺癌细胞A549增殖和凋亡的影响。方法分离培养hBMSCs,并通过流式细胞术鉴定。慢病毒介导IL-24基因转染hBMSCs,构建表达外源性基因IL-24的hBMSCs(hBMSCs-IL-24),qPCR及ELISA法检测hBMSCs-IL-24中IL-24基因mRNA及蛋白表达。CCK-8法检测hBMSCs-IL-24分泌的外源性IL-24对肺癌细胞A549增殖活性的影响。AnnexinV-PI检测hBMSCs-IL-24对A549细胞凋亡的影响。结果慢病毒介导的外源基因IL-24成功转染hBMSCs(hBMSCs-IL-24),其IL-24基因在mRNA及蛋白水平均有明显表达。hBMSCs-IL-24分泌的外源性IL-24蛋白显著抑制肺癌细胞A549的增殖并促进其凋亡。结论 hBMSCs-IL-24能够在mRNA及蛋白水平表达外源性IL-24基因,IL-24蛋白能显著抑制肺癌细胞A549的增殖,促进凋亡。     

BrdU标记人脐带间充质干细胞及对细胞生物学行为影响的体外研究

目的：探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）标记人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）的方法及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响。方法：将hUC-MSCs分离培养并进行细胞表面标志物及多向分化潜能鉴定,取第5代细胞以终浓度分别为10、15、20、25 ?滋mol/L BrdU进行标记,采用空白BrdU作为对照组,分别培养24、48、72 h及96 h后,台盼蓝排斥实验检测细胞活力;MTT法检测细胞增殖能力;AnnexinV-FITC检测细胞存活率及凋亡率,免疫组化法检测各组标记率。结果：台盼蓝排斥实验检测细胞活力都在96%以上,实验组与对照组比较均无统计学意义（不同浓度组间比较P=0.89,各时间点比较P=0.61,时间与不同浓度的交互作用P=0.89）。MTT结果显示BrdU对细胞增殖无抑制（P ＞0.05）。不同浓度标记组间细胞增殖率及凋亡率的差异（增殖率F=12.02,P＜0.001,凋亡率F=6.14,P=0.009）。结论：BrdU标记hUC-MSCs是安全可靠的,BrdU标记hUC-MSCs的最佳剂量和时间为20 ?滋mol/L、72 h,适于hUC-MSCs在临床前实验研究的体内示踪。     

转染白细胞介素－12基因的脐带间充质干细胞对胃腺癌细胞的影响

目的：探讨转染白细胞介素－12（IL－12）基因的脐带间充质干细胞（UCMSCs）对胃腺癌细胞的影响。方法原代分离培养和鉴定人UCMSCs;利用重组构建的IL－12和绿色荧光蛋白（ GFP）融合表达的慢病毒载体（LV－IL－12－GFP）感染UCMSCs,酶联免疫法（ELISA）检测细胞中IL－12的表达。用转染了LV－IL－12－GFP的UCMSCs与胃腺癌细胞SGC－7901共培养,Transwell双室培养体系检测胃腺癌细胞SGC－7901的侵袭能力,原位细胞凋亡方法检测胃腺癌细胞SGC－7901的凋亡情况,Cylinder方法检测48 h后转染了LV－IL－12－GFP的UCMSCs向胃腺癌细胞SGC－7901的迁移能力。结果成功分离得到UCMSCs;ELISA结果显示,经IL－12基因转染的UCMSCs可稳定表达持续高水平的IL－12;Transwell结果显示,与转染了LV－IL－12－GFP的UC-MSCs共培养的胃腺癌细胞SGC－7901的侵袭能力明显下降（P＜0.05）,凋亡率明显增加（P＜0.05）;Cylinder柱结果显示,转染了LV－IL－12－GFP的UCMSCs向胃腺癌细胞SGC－7901的定向迁移能力明显下降（ P＜0.05）。结论 UCMSCs可作为IL－12基因载体靶向追踪胃腺癌细胞,发挥肿瘤治疗作用。     

人脐带间充质干细胞过敏性试验

目的：观察人脐带间充质干细胞对豚鼠的过敏性反应,为临床使用人脐带间充质干细胞的安全性提供参考。方法：培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液。将30只豚鼠分成3组,分别是模型1组、模型2组和对照组。2个模型组隔日肌注细胞生理盐水混悬液3次,实验1组于首次注射后第14天,实验2组于首次注射后第21天分别静脉注射混悬液进行攻击。观察动物有无过敏反应症状。结果：动物无明显过敏反应症状,反应级数为0级。结论：人脐带间充质干细胞免疫原性低,不易导致过敏反应。     

Apelin-13对血清剥夺诱导的人脐带间充质干细胞凋亡的影响

目的 观察apelin-13对无血清培养诱导的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)凋亡的影响.方法 采用组织块贴壁培养法培养hUC-MSCs,随机分成无血清培养组(A组)和不同浓度apelin-13处理组,apelin-13处理组浓度分别为0.1 mmol/L(B1组)、0.5mmol/L(B2组)、5 mmol/L(B3组)、10 mmol/L(B4组).倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞仪测定hUC-MSCs表面免疫标记;流式细胞术检测各组细胞凋亡率,MTT法检测0.5、5mmol/L apelin-13对hUC-MSCs增殖活性影响.结果 流式细胞仪鉴定结果表明,hUC-MSCs表达CD44、CD90、CD105、CD73、HLA-ABC,不表达CD34、CD45、HLA-DR.与A组比较,B1、B2、B3、B4组均抑制无血清培养诱导的hUW-MSCs早期凋亡,凋亡率比较差异均有统计学意义(P＜0.05),B3、B4组与B1、B2组间差异有统计学意义(P＜0.05),B3组与B4组、B1组与B2组差异无统计学意义(P＞0.05).A组与B2、B3组比较,细胞在490 nm OD值差异无统计学意义(P＞0.05).结论 一定浓度内的apelin-13能抑制无血清培养诱导的hUC-MSCs早期凋亡,且这种抗凋亡作用可能不是通过促增殖作用引起的.     

不同途径移植人脐带间充质干细胞治疗糖尿病大鼠

目的观察不同途径移植人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)对糖尿病大鼠的治疗效果。方法 60只SD大鼠单次腹腔注射链脲佐菌素(70 mg.kg-1)建立糖尿病模型,成模后随机分为糖尿病模型组、胰腺被膜下移植组、肾被膜下移植组及肝实质内移植组,每组14只;另取10只大鼠为正常对照组。分别于各干细胞移植组大鼠胰腺被膜下、左肾被膜下、肝实质内注射0.5 mL hUCMSCs悬液(1×106个);糖尿病模型组及正常对照组于胰腺被膜下注射生理盐水0.5 mL。移植后动态观察空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、体质量变化,6周后处死大鼠,取相关组织行病理学检查及胰岛素、胰十二指肠同源异型盒基因(PDX-1)、巢蛋白mRNA表达测定。结果移植前各组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05);各干细胞移植组及糖尿病模型组大鼠FBG值高于正常对照组(P<0.05),FINS水平低于正常对照组(P<0.05);各干细胞移植组及糖尿病模型组大鼠FBG和FINS水平组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。移植5周末,与正常对照组比较,各干细胞移植组及糖尿病模型组大鼠体质量及FINS降低,FBG增高,差异均有统计学意义(P<0.05);与糖尿病模型组比较,各干细胞移植组大鼠体质量及FINS升高,FBG降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与胰腺被膜下移植组比较,肾被膜下及肝实质内移植组大鼠体质量降低,FBG升高,FINS水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,各实验组大鼠平均阳性染色面积均降低(P<0.05);胰腺被膜下移植组阳性染色面积大于糖尿病模型组(P<0.05);所有组织切片均未检测到人胰岛素的表达。与正常对照组比较,胰腺被膜下移植组、糖尿病模型组大鼠胰岛素mRNA表达量均降低(P<0.05),大鼠PDX-1及巢蛋白mRNA表达量均增高(P<0.05)。与糖尿病模型组比较,胰腺被膜下移植组大鼠胰岛素、PDX-1及巢蛋白mRNA表达量均增高(P<0.05)。各实验组均未检测到人胰岛素、PDX-1及巢蛋白mRNA表达。结论不同移植途径对hUCM-SCs治疗糖尿病的效果有影响,胰腺被膜下移植效果优于其他途径。hUCMSCs并未分化为β细胞,但其能够促进内源性胰腺干细胞增殖、分化。     

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的...     

Human umbilical cord mesenchymal stem cells and the treatment of spinal cord injury

Objective To review the recent studies about human umbilical cord mesenchymal stem cells （hUCMSCs） and advances in the treatment of spinal cord injury. Data sources Published articles （1983-2007） about hUCMSCs and spinal cord injury were selected using Medline. Study selection Articles selected were relevant to development of mesenchymal stem cells （MSCs） for transplantation in spinal cord injury therapy. Of 258 originally identified articles 51 were selected that specifically addressed the stated purpose. Results Recent work has revealed that hUCMSCs share most of the characteristics with MSCs derived from bone marrow and are more appropriate to transplantation for cell based therapies. Conclusions Human umbilical cord could be regarded as a source of MSCs for experimental and clinical needs. In addition, as a peculiar source of stem cells, hUCMSCs may play an important role in the treatment of spinal cord injury. Chin Med J 2009;122（2）：225-231     

小鼠脐带间充质干细胞的体外诱导分化

目的分离扩增小鼠脐带间充质干细胞（mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSCs）探讨其是否可诱导成软骨、脂肪和成骨细胞。方法 通过贴壁培养法将mUCMSCs体外分离、扩增、纯化,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达进行鉴定。运用诱导培养液对分离的mUCMSCs分别定向诱导培养为软骨、脂肪和成骨细胞。结果 运用组织贴块培养法可从新鲜脐带中分离到贴壁生长的成纤维样细胞,这些细胞高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD34。成软骨诱导后阿新兰染色呈蓝色;成脂诱导后油红O染色,出现红色脂滴;茜红素染色成骨诱导的mUCMSC,可见红色结节。结论 贴壁培养法分离培养所获得的mUCMSCs在体外可诱导分化为软骨、脂肪和成骨细胞。     

PHBHHx与人脐带间充质干细胞的体内异位成骨研究

目的：探讨以3‐羟基丁酸‐3‐羟基己酸共聚酯（PHBHHx）为支架材料,以人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）为种子细胞的复合物体内构建组织工程骨的能力。方法将hUCMSCs接种在PHBHHx上体外成骨诱导培养2周,诱导组为实验组,不滴加hUCMSCs组为对照组,植入裸鼠皮下,并分别于1、3、5个月取材行HE、Ⅰ型胶原免疫组织化学、碱性磷酸酶染色及逆转录聚合酶链反应（RT‐PCR）检测。结果 PHBHHx表现出良好的细胞吸附性。实验组细胞大、小形态基本保持原状,成骨特异性指标检测均为阳性;对照组细胞则不能保持原状,体积逐渐缩小至完全降解,成骨特异性指标均为阴性。结论 PHBHHx复合hUCMSCs经体外成骨诱导后具有在裸鼠体内异位构建组织工程骨的能力。     

血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响

目的探讨血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响。方法将人脐带间充质干细胞分别培养在不含血清、含灭活血清和含未灭活血清的低糖达尔伯克改良伊格尔培养基(L-DMEM)中。每天用显微镜观察脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长情况,并计算细胞总数、统计细胞成活率。结果脐带间充质干细胞在含未灭活血清的L-DMEM中生长状况最好,在不含血清的L-DMEM中生长状况最差。结论含未灭活血清的L-DMEM是脐带间充质干细胞体外培养的最佳培养基。     

hHGF腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

目的:构建人重组肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因腺病毒载体(Ad-HGF),转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs),为转基因治疗提供实验基础.方法:设计含有SalⅠ及XbaⅠ酶切位点的引物,PCR扩增hHGF,将扩增产物克隆到带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的pAdTrack-CMV穿梭质粒上.重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组,筛选获得含有hHGF的重组腺病毒质粒,PCR、酶切鉴定并测序.重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化,脂质体转染293A细胞,经3轮扩增,制备高效表达的AdGFP/HGF,并转染hucMSCs.结果:重组腺病毒质粒经PCR和SalⅠ,XbaⅠ酶切鉴定,证实含有HGF基因,测序结果和设计片段的序列一致.荧光显微镜下发现293A细胞发光率几乎为100%,感染的hucMSCs亦可表达绿色荧光蛋白.结论:成功构建了hHGF腺病毒表达载体,并获得高滴度的病毒, 能高效感染hucMSCs,为后续研究奠定了基础.