PLGA与明胶膜支架材料对神经干细胞生长、分化影响的体外研究

目的：探讨PLGA作为中枢神经组织工程支架材料的可行性。方法：从胎龄14～16d的Wistar大鼠分离培养获得神经干细胞，以10^8/L密度种植于PLGA膜、明胶膜和PLGA／明胶膜表面，置37℃、5％CO2培养箱中共培养，观察神经干细胞在PLGA膜、明胶膜和PLGA／明胶膜表面的生长、分化和PLGA的降解情况。结果：培养获得的神经干细胞表现具有自我更新和多相分化能力，能分化为神经元和胶质细胞。在观察期内PLGA膜无降解，神经干细胞在PLGA膜表面无贴附，但可在PLGA／明胶膜和明胶膜表面贴附、生长和分化。结论：PLGA可作为中枢神经组织工程支架材料。     

利用PLA、PGA、PLGA三种支架再生兔关节软骨

目的观察兔关节软骨细胞在聚乳酸（PLA）,聚羟基乙酸（PGA）,以及两者的共聚物PL—GA三种三维支架上的贴附和生长情况,利用组织工程技术培养工程化关节软骨。方法多聚赖氨酸包埋PLA,PGA,PLGA三维细胞支架。分离培养兔关节软骨细胞,体外扩增后种植到三种支架中。在体外培养软骨细胞一支架复合物,4周终止培养,进行HE、Masson组织学染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。结果（1）体外培养发现,软骨细胞在PLGA支架材料内贴附生长良好,长期培养仍保持软骨细胞特性,其贴附生长能力,分泌Ⅱ型胶原能力较PGA,PLA支架组强。（2）支架经过多聚赖氨酸包埋后,软骨细胞的贴附生长及分泌Ⅱ型胶原能力均较对照组好。结论多聚赖氨酸处理的PLGA三维支架适合软骨细胞贴附生长和分泌Ⅱ型胶原,可作为软骨组织工程的细胞载体。     

纤维粘连蛋白修饰的多孔PLGA对大鼠骨髓间充质干细胞粘附和增殖的影响

目的探讨经纤维粘连蛋白(Fn)修饰的聚乙醇酸乳酸共聚物(PLGA)对骨髓间充质干细胞(MSCs)粘附和增殖的影响。方法用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合获得SD大鼠的骨髓间充质干细胞,培养后以不同的浓度分别接种于PLGA上。其中,预先包被纤维粘连蛋白的PLGA作为实验组,未经纤维粘连蛋白修饰的作为对照组。分别于3、6、9h和7、14、21d收获细胞,通过细胞记数法测定细胞数,反映细胞的粘附和增殖情况。并通过电镜观察细胞在材料上的形态和贴附情况。结果纤维粘连蛋白能明显促进MSCs在PLGA上的粘附和增殖:在6、9h和7、14、21d时间点上实验组与对照组相比细胞数差异均有显著意义(P<0.05和P<0.01)。电镜证实实验组细胞贴附良好,为多角或梭形;对照组细胞数少,细胞铺展差,多为圆形。结论纤维粘连蛋白能促进MSCs在高分子材料上的粘附和增殖。     

骨髓间充质干细胞复合I型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸对骨质疏松大鼠骨缺损的影响

目的 通过将骨髓间充质干细胞复合I型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸(PLGA)微球支架注入骨质疏松大鼠股骨转子间,探讨其对骨缺损后骨质量的局部改善情况.方法 通过切除30只SD雌性大鼠双侧卵巢建立骨质疏松动物模型,并用电钻在股骨转子间人为制作骨缺损;实验动物按随机数字表法均分为给药组、模型组和假手术组.给药组大鼠骨缺损部位注入骨髓间充质干细胞复合I型胶原修饰的PLGA微球,模型组大鼠骨缺损部位注入PBS缓冲液,假手术组大鼠行假手术.分别考察术后1、3个月骨缺损部位的骨矿含量、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁面积百分比及分离度.结果 骨髓间充质干细胞与I型胶原修饰的PLGA微球支架体外培养7 d,发现细胞在支架表面黏附、生长良好.与模型组比较,给药组动物术后1个月的骨密度、骨小梁厚度、骨小梁面积百分比均显著增大,骨小梁分离度显著减小,均差异有统计学意义(P<0.05),骨矿含量变化不明显(P>0.05);给药组动物术后3个月的骨矿含量、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁面积百分比均显著大于模型组,骨小梁分离度显著小于模型组,均差异有统计学意义(P<0.05).结论 骨髓间充质干细胞复合I型胶原修饰的PLGA微球可修复大鼠骨质疏松部位骨缺损,改建骨小梁结构,提高骨质量.     

仿生矿化PLGA/MWNTs/HA引导组织再生膜的细胞相容性研究

目的 通过仿生矿化的方法制备PLGA/MWNTs/HA牙周引导组织再生膜并对其细胞相容性进行表征.方法 先将聚乳酸-羟基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]与多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotubes,MWNTs)复合,采用溶液浇铸法制备PLGA/MWNTs复合膜;再将其仿生矿化,制得PLGA/MWNTs/羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)复合膜,再将人牙周膜干细胞接种于PLGA/MWNTs/HA复合膜上培养,采用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察细胞在复合膜上的形貌,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析细胞的增殖情况.结果 PLGA/MWNTs复合膜表面比较均匀、致密;矿化7天后,PLGA/MWNTs复合膜表面有磷灰石晶体形成;人牙周膜干细胞在PLGA/MWNTs/HA复合膜表面生长、增殖良好,HA的加入有利于细胞的粘附和生长.结论 通过仿生矿化法制得的PLGA/MWNTs/HA复合膜具有良好的细胞相容性,有望在牙周引导组织再生领域发挥作用.     

外胚间充质细胞向神经胶质／雪旺细胞的诱导分化及在BAM生物材料的存活研究

目的探讨体外诱导外胚间充质细胞向神经胶质／雪旺细胞分化的潜能,观察细胞在不同材料上的生长状况,利用分化细胞观察在BAM生物材料的复合情况,为进一步构建组织工程神经提供理论依据。方法取妊娠10．5d胎鼠颌突外胚间充质细胞,纯化后分别用8．5mg／L牛脑垂体提取物BPE、50μmol／L弗司扣林（forskolin）及联合应用诱导细胞分化。相差显微镜下观察细胞的形态变化,免疫组化鉴定细胞性质,将诱导后的细胞种植于胶原膜及胶原凝胶,并于培养3、6d后分别进行光镜、HE染色及扫描电镜观察细胞的生长情况。结果培养3d后外胚问充质细胞形态发生变化,细胞形态为梭形,突起变长。而对照组细胞形态未见明显改变;免疫组化显示外胚间充质细胞表达S-100蛋白,但无GFAP的表达。而诱导分化后出现GFAP的表达,其中BPE及Forskolin联合应用后分化效果最好,约为79．2％。而在BAM凝胶和膜上细胞都可伸展并增殖。结论BPE和Forskolin可不同程度诱导外胚间充质细胞向神经胶质细胞分化。在BAM膜上分化细胞生长状态良好,为该细胞与BAM生物材料构建组织工程神经导管提供了理论依据。     

体外神经干细胞三维药物筛选模型的构建

研究目的：建立中药对神经干细胞诱导转变为神经细胞的体外模型，不仅对研究脑的发育和分化以及神经系统疾病的治疗具有重要价值，而且也有助于了解中药的作用机制，为中药的临床应用提供坚实的科学依据。本研究评价体外海马神经干细胞在胶原凝胶内的生长情况，探讨胶原凝胶作为神经系统组织支架材料的可行性，以建立适合于干细胞药物筛选及作用机理研究的三维培养模型。研究方法：①细胞培养：体外培养来源于孕13天胎鼠的海马部位神经干细胞，传至第三代；根据胶原的特性，把神经干细胞均匀混合于胶原的预凝胶溶液中，便可形成“细胞．胶原”的凝胶三维结构。②检测指标：倒置相差显微镜和激光共聚焦显微镜观察胶原凝胶中神经干细胞的生长、伸展情况；通用免疫细胞化学方法及荧光显微技术鉴定神经干细胞，BrdU染色标记增殖的细胞；采用CCK-8法及Live／DeadViability／CytotoxicityKit试剂盒检测神经干细胞不同培养条件下的生存和增殖能力，筛选出最佳的胶原工作浓度。结果：①倒置相差显微镜下观察发现胶原凝胶中的神经干细胞生长状态良好；     

胶质瘤细胞诱导神经干细胞迁移作用的实验研究

目的观察胶质瘤细胞在体外培养条件下对神经干细胞是否有诱导迁移的作用。方法①从新生1～2dSD大鼠脑皮层分离培养神经干细胞,进行神经干细胞及其增殖能力鉴定。②胶质瘤细胞与神经干细胞限定区域联合培养,观察神经干细胞的生长及其形态学变化。结果①所获得神经细胞球Nestin染色阳性,传代神经细胞球抗BrdU染色阳性。②可观察到神经干细胞球周围长出细胞突起,在靠近胶质瘤细胞的一侧,细胞突起的密度及长度均大于其他方向上的突起并且可见部分干细胞向胶质瘤细胞方向的移动。结论胶质瘤细胞在体外对神经干细胞有诱导迁移作用。     

壳聚糖、Ⅱ型胶原和PGA三种支架体外构建组织工程软骨的比较研究

目的 观察兔关节软骨细胞在壳聚糖、Ⅱ型胶原、聚羟基乙酸(PGA)三种细胞支架上的生长情况,探讨更适合构建工程软骨的细胞支架材料.方法 多聚赖氨酸包埋壳聚糖、Ⅱ型胶原和PGA三种多孔海绵支架.将体外分离培养的兔关节软骨细胞种植于三种支架上.体外培养4周,对组织工程软骨进行大体标本观察和HE染色,检测软骨内DNA含量、Ⅱ型胶原和糖胺多糖(GAG)的分泌量.结果 软骨细胞在壳聚糖支架内生长良好,培养4周后仍能维持软骨细胞的表型,其分泌Ⅱ型胶原和GAG的能力较其他两种支架好(P＜0.01).结论 壳聚糖支架更适合软骨细胞的贴附生长,有利于维持软骨细胞的表型,是较好的软骨组织工程细胞支架.     

SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元的原代培养

目的建立用自制的鼠尾胶原联合胰酶消化法原代培养SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元。方法采用出生3 d内的SD大鼠,取螺旋神经节组织,通过胰酶消化后在自制鼠尾胶原包被的培养皿中进行原代培养,应用神经微丝蛋白进行免疫组化鉴定。结果获得的螺旋神经元细胞在体外能较快地贴壁,可以存活、生长,细胞形态良好。结论自制鼠尾胶原联合胰酶消化的培养方法可获得良好状态的螺旋神经元细胞,为原代培养螺旋神经元提供了新思路。     

胚胎大鼠神经干细胞体外分化的激光共聚焦显微镜观察

目的:采用激光扫描共聚焦显微镜观察体外培养胎鼠大脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化情况。方法:利用无血清培养方法,分离培养胚胎大鼠大脑NSCs,进行体外扩增培养、传代;采用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入、双重免疫荧光细胞化学标记方法和激光扫描共聚焦显微镜,用神经细胞的特异性抗体(神经元β-微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白),鉴定NSCs向神经元与星形胶质细胞分化的情况。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)抗原。在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞2种神经细胞的特异性抗原,NSCs分化为星形胶质细胞神经元的比例分别为(43.70±8.55)%和(23.00±3.69)%。结论:从胎鼠大脑皮质分离出的细胞可获得呈集落样生长的神经干细胞团,并能表达NSCs的特异性抗原;激光扫描共聚焦显微镜可清晰地观察到培养细胞具有分化为神经元和星形胶质细胞的潜能。     

组织工程心脏瓣膜体外构建的初步研究

目的:初步体外构建组织工程人工心脏瓣膜。方法:种子细胞选用胸骨骨髓,抽取后分离出人骨髓间充质干细胞,体外培养,扩增待用。脱细胞瓣膜支架的构建应用破膜剂曲拉通-脱氧胆酸钠对新鲜猪主动脉瓣膜36片(实验组)进行处理48h后,与对照组未经处理的猪主动脉瓣膜(36片)进行对比,在光镜和电镜下观察脱细胞效果。将人骨髓间充质干细胞接种于脱细胞瓣膜支架上静态培养7d,观察细胞-支架复合体生长状况。结果:曲拉通-脱氧胆酸钠法脱细胞彻底,保持原有纤维结构。种植的人骨髓间充质干细胞7d后可生长于瓣膜支架的表面。结论:曲拉通-脱氧胆酸钠法是一种较为理想的猪瓣膜脱细胞方法;人骨髓间充质干细胞能在脱细胞猪瓣膜支架上较好地黏附和生长,从而初步构建组织工程人工心脏瓣膜。     

厄贝沙坦联合螺内酯对肾性高血压大鼠血管重塑信号通路的影响

目的比较厄贝沙坦、螺内酯单用及联合应用对肾性高血压大鼠(RHR)血管重塑(VR)的疗效,并深入探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂和醛固酮受体拮抗剂合用影响VR病理过程的作用机制。方法采用两肾一夹(2K1C)改良造模法制备RHR模型,给予厄贝沙坦或和螺内酯连续灌胃,每两周测定尾动脉收缩压。治疗8wk后,处死大鼠取血清测定Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)、Ⅲ型前胶原氨基端肽水平(PⅢNP),测量3级肠系膜动脉中膜厚度/管腔半径比和中膜横截面积/管腔面积比,饱和苦味酸-天狼猩红染色测量动脉中膜胶原纤维面积百分比,免疫组化法测定Ⅰ型胶原、结缔组织生长因子(CTGF)和P-p38MAPK蛋白的表达水平。结果厄贝沙坦能够有效降低RHR动脉血压,但是加用螺内酯不影响血压调节水平;RHR血管中膜厚度/管腔半径比、中膜横截面积/管腔面积比、血清PⅠCP和PⅢNP、动脉中膜胶原纤维面积百分比、Ⅰ型胶原、CTGF和P-p38MAPK蛋白表达等均明显增加;厄贝沙坦和螺内酯使上述指标减轻,联合用药产生协同作用。结论厄贝沙坦和螺内酯皆可改善VR,联合应用具有协同效应,其机制可能与两者均可下调P-p38MAPK、CTGF蛋白表达有关。     

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因对兔关节软骨细胞的有效转染及表达

目的 研究人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ)基因构建的真核表达载体质粒对兔关节软骨细胞的有效转染和表达.方法 将hIGF-Ⅰ基因构建在pcDNA 3.1质粒上,经FuGENE 6介导转入兔关节软骨细胞;设未转hIGF-Ⅰ基因软骨细胞作对照.转染后第3天用RT-PCR技术检测hIGF-Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚合素在mRNA水平的表达,用细胞爬片免疫组织化学和Western blot测定hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达.结果 RT-PCR显示hIGF-Ⅰ在转染组中琼脂糖电泳318 bp处见到相应的目的 条带,而对照组未出现目的 条带;Ⅱ型胶原和聚合素在转染和对照组中以β-actin为参照半定量检测分别增加到1.3倍和1.4倍(P<0.05).免疫组织化学显示转染组细胞爬片有hIGF-Ⅰ表达的棕黄色颗粒,对照组胞浆中未见棕黄色颗粒,转染组胞浆中出现大量的Ⅱ型胶原棕黄色颗粒.Western blot显示转染组细胞在7.6 KDa标记处有hIGF-Ⅰ的蛋白条带出现对照组则没有.结论 FuGENE 6介导的重组hIGF-Ⅰ基因真核表达载体质粒可有效转染兔关节软骨细胞,在mRNA和蛋白水平上有效表达hIGF-Ⅰ及Ⅱ型胶原,表达的hIGF-Ⅰ能在mRNA水平上增加Ⅱ型胶原和聚合素的合成,保持软骨细胞表型的稳定.     

骨形态发生蛋白-13促进小鼠骨髓干细胞的软骨分化

目的:研究骨形态发生蛋白-13对小鼠骨髓基质干细胞向软骨分化过程的作用。方法:体外培养小鼠骨髓基质干细胞(MSCs),贴壁细胞传代,取第3代细胞,用骨形态发生蛋白-13溶液干预培养1,4,7,14 d取样检测。倒置相差显微镜观察细胞形态;RT-PCR,western-blot和免疫细胞化学法检测不同时期Ⅱ型胶原,SOX9,阿尔辛蓝(Alcian)染色蛋白多糖。结果:Ⅱ型胶原和SOX9之mRNA和蛋白的表达在第4天开始出现并不断升高;Alcian染色结果显示骨形态发生蛋白-13诱导细胞分泌蛋白多糖基质,可见细胞小结区域呈明显的异染性。结论:骨形态发生蛋白-13可以定向诱导小鼠骨髓干细胞的软骨分化。     

大鼠神经干细胞的分离培养和分化鉴定

目的建立神经干细胞分离、培养和分化鉴定技术。观察神经干细胞生长、增殖特点。方法利用无血清培养,从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术,观察鉴定神经干细胞及其分化结果。结果从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有巢蛋白(nestin)表达阳性细胞,显微镜下观察见典型的干细胞特征。分化为3种神经细胞类型:神经元、胶质细胞、少突胶质细胞。结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,通过鉴定确为神经干细胞,并经过分化鉴定确认。     

清热活血补益方影响肝脏胶原代谢的分子生物学机制

目的 :从分子生物学水平研究中药复方清热活血补益方 (肝纤方 )如何影响大鼠肝脏的胶原合成及降解。方法 :运用血清药理学方法制备中药含药血清 ,将之作用于从SD大鼠肝脏分离培养的肝星状细胞 ,并测定Ⅰ型胶原含量、Ⅰ型前胶原mRNA的表达和胶原酶活性。结果 :与对照组相比 ,含药血清组Ⅰ型胶原含量降低 ,Ⅰ型前胶原mRNA的表达受到抑制 ,胶原酶的活性增加 (P <0 .0 5 )。结论 :清热活血补益方通过抑制Ⅰ型前胶原mRNA的表达来减少胶原的合成 ,通过提高胶原酶的活性来促进胶原的降解 ,这可能是其多位点抗肝纤维化的部分分子生物学机制。     

腺病毒介导的hIGF-Ⅰ基因转染对构建组织工程软骨的影响

目的 探讨腺病毒介导的人胰岛素样生长因子I(hIGF-Ⅰ)基因转染对构建组织工程软骨的影响.方法 分离新两兰大白兔关节软骨细胞,培养到第一代,用荧光标记的Ad/hrGFPhlGF-Ⅰ转染,然后接种在PLGA支架上(转染组);未转染的软骨细胞接种在PLGA支架上(对照组),在体外培养2周.利用荧光显微镜、Western blot、RT-PCR、免疫组织化学等方法鉴定hIGF-Ⅰ基因的有效转染,并观察其对构建的组织工=程软骨细胞外基质的影响.结果 Ad/hrGFP-hlGF-Ⅰ能对兔关节软骨细胞进行有效转染,RT-PCR显示构建的组织工程软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原、聚合素的表达高于对照组;定昔检测显示胶原和GAG的含量高于对照组(P＜0.01).结论 腺病毒介导的hIGFⅠ基因转染能成功转染兔关节软骨细胞,用它构建组织工程软骨能显著促进软骨细胞外基质的合成.     

人胚神经干细胞分离培养与鉴定方法

目的:建立神经干细胞(NSCs)实验室分离、培养方法,为NSCs移植提供细胞源.方法:取4月龄(±15 天)正常孕妇水囊引产胎儿大脑纹状体区组织分离神经干细胞,培养于含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和B27的无血清培养基;同时利用单细胞克隆技术进行连续传代培养;利用形态学观察和免疫荧光技术检测神经上皮干细胞蛋白Nestin抗原的表达来鉴定神经干细胞.结果:体外培养的干细胞在bFGF和B27培养基中可不断增殖形成细胞球,并出现少量细胞分化.单细胞培养4天即开始分裂,同时伴有个别细胞分化;出现大量神经球一般为15天;分化的细胞在30天开始分解,50天左右基本消失.细胞培养3个月(每月补液1次)仍具有分裂增殖能力.单细胞克隆可连续传代10次,仍具增殖分化能力.液氮冻存6个月的细胞复苏后仍具增殖分化能力.单细胞克隆传代增殖的细胞球经Nestin免疫荧光鉴定,呈阳性结果,证实其胚胎源性.结论:采用bFGF和B27的无血清培养基能促进神经干细胞连续稳定增殖,并有少量分化,细胞体外培养3个月、克隆连续传代10次情况下的细胞仍具有神经干细胞特性.     

人胚胎神经干细胞体外培养及其增殖与分化的研究

目的 建立神经干细胞分离、培养及分化的鉴定技术，观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎海马区分离神经干细胞，采用无血清培养基，进行体外扩增培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化的神经细胞；利用流式细胞仪和细胞生长曲线检测神经干细胞的增殖能力。结果 从人胚胎脑海马区分离的细胞具有增殖和多向分化潜能，可进行传代培养，获得的细胞团中大部分为nestin表达阳性细胞。贴壁分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论 用上述方法分离培养的细胞能表达nestin蛋白，具有自我更新和增殖能力，并具有向神经元、星形胶质细胞分化的潜能，具备神经干细胞的特征，可用于细胞移植等相关研究。