PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建PML-RAR o[融合基因相关重组表达质粒,在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)以PML-RAR α全长质粒为模板分别扩增出长度均为1 200 bp的PML和RAR o[序列,并将它们分别插入PET32a(+)质粒中,构建重组表达质粒,化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆,菌落PCR筛选阳性转化子,双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性.正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a(+)和Flag-RARα-PET32a(+).将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用表达蛋白的组氨酸“标签”(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质.结果 PCR扩增获得目的基因,重组表达质粒经EcoRI/HindⅢ双酶切和测序鉴定证明构建正确.转化感受态BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白.结论 成功构建重组表达质粒,并经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步的抗体制备等实验奠定了基础.     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

GP73联合AFP、VEGF检测对原发性肝癌的诊断意义

目的探讨高尔基体糖蛋白73（GP73）、甲胎蛋白（AFP）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）联合检测对原发性肝癌的诊断意义。方法用化学发光免疫分析法、ELISA法和全自动生化分析仪分别检测100例原发性肝癌和50例健康对照患者GP73、AFP和VEGF含量,分析GP73联合AFP、VEGF检测对原发性肝癌的诊断意义。结果健康对照组GP73、AFP和VEGF含量明显低于原发性肝癌组,差异有统计学意义（P〈0．05）;单独检测GP73、AFP和VEGF对诊断原发性肝癌的特异性分别为93．2％、95．6％和92．3％,敏感性分别为62．5％、67．2％、72．3％,联合检测GP73、AFP和VEGF可提高诊断原发性肝癌的特异性和敏感性,分别为100％和98．9％,单项检测的特异性和敏感性高于联合检测（P〈0．05）。结论联合检测GP73、AFP和VEGF作为诊断原发性肝癌的重要指标,可提高原发性肝癌的诊断价值。     

血清GP73、AFP及AFP-L3联合检测应用于原发性肝癌诊断中的价值分析

目的:分析血清高尔基体蛋白73(GP73)、甲胎蛋白异质体-L3(AFP-L3)、甲胎蛋白(AFP)联合检测应用于原发性肝癌患者诊断中的价值。方法:采集4组观察对象的血液标本进行血清GP73、AFP-L3、AFP检测,记录检测结果,分析各项血清指标对原发性肝癌的诊断价值。结果:在原发性肝癌诊断中,血清GP73灵敏度明显优于AFP-L3、AFP;三项指标联合检测的灵敏度明显优于各项指标单独检测。结论:血清标志物GP73、AFP-L3、AFP是临床诊断原发性肝癌的特异性指标,三项指标联合检测的灵敏度高,提高了对原发性肝癌的阳性诊断率,对病情的判定及下一步治疗方案的选择具有重要的指导意义。     

高尔基蛋白73(GP73)ELISA定量检测方法的建立及临床应用

目的 建立双抗体夹心ELISA定量检测人血清高尔基蛋白73(GP73)的方法,并用于检测血清GP73含量.方法 利用杂交瘤法制备纯化的抗GP73单克隆抗体(mAb)进行辣根过氧化物酶(HRP)标记后,通过棋盘滴定法确定包被抗体和酶标抗体及其最适工作浓度;以重组人的GP73抗原为标准品建立标准曲线;以重复性、灵敏性和回收率实验评价ELISA方法.应用该ELISA法对正常人、肝炎、肝硬化及肝癌患者血清中的GP73水平进行定量检测.结果 当抗GP73 mAb 3D5A10和7H3F5分别为捕获抗体和酶标抗体、工作浓度分别为40 μg/ml和1∶ 4000时,双抗体夹心ELISA法最优.该方法的平均批内和批间变异系数分别为4.6％和7.6％,灵敏度达3.76 ng/ml,平均回收率为(102.2±5)％.用本方法重复测定肝癌(33例)、肝硬化(28例)、乙型肝炎(44例)及正常人(44例)血清样本中GP73浓度(中位数)分别为25.9、27.6、16.7、9.9μg/L;除肝癌与肝硬化组间差异无统计学意义外,其余各组间均有统计学差异(P＜0.05).结论 成功建立了双抗体夹心ELISA定量检测GP73的方法.检测血清GP73可作为诊断肝脏疾病的重要辅助手段之一.     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

黑色素瘤抗原-3原核重组质粒的构建及表达

目的 构建MAGE-3目的 基因原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆茵(E.coli)B121(DE3)中的表达.方法 RT-PCR法制备MAGE-3目的 基因,连接入原核表达载体pGEX-4T-1.构建MAGE-3目的 基因的原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并测序,将该质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,12%SDS-PAGE和Western Blot表达鉴定.结果 扩增出349bp的MAGE-3 目的 基因并构建了原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3;测序结果与GenBank收录序列相一致;在E.coli BL21(DE3)中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的 蛋白.结论 成功构建的原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础,为后续实验提供了依据.     

重组人Hexastatin融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及其纯化

目的构建人Hexastatin蛋白原核表达载体,大量表达并纯化Hexastatin蛋白,为其在体内外的活性研究奠定基础。方法提取人食管癌EC9706细胞总RNA,通过RT-PCR方法扩增人Hexastatin基因,导入pMD18-T载体测序,然后克隆至pMAL-c4x表达载体,IPTG诱导表达,并利用Amylose亲和树脂纯化融合蛋白,产物进行Westernblot鉴定。结果经PCR扩增成功获得了687bp的人Hexastatin基因,测序正确。重组人Hexastatin基因在BL21菌体中获得高效可溶性表达,表达的可溶性蛋白占总蛋白量的24.8%,纯化后的MBP-Hexastatin融合蛋白纯度可达90%,Westernblot证实表达蛋白为目的蛋白。结论人Hexastatin基因克隆、表达及纯化的成功,为进一步在体内外研究其生物活性奠定基础,同时也为肿瘤的生物治疗提供了新的方法。     

高尔基体蛋白73、AFP、VEGF在原发性肝癌组织中的表达及临床意义

目的分析评价高尔基体蛋白73（GP73）、AFP、VEGF在原发性肝癌、癌旁组织以及正常肝脏组织中的表达及临床意义。方法取原发性肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织,分别检测GP73、AFP、VEGF的含量。结果肝癌组织中GP73、VEGF和AFP表达最强,其次为癌旁组织,正常组织中表达最弱,三者比较,差异有统计学意义（P〈0.01）。肝癌组织中,GP73和VEGF的表达均显著高于AFP（P〈0.01）。经Pearson相关分析显示GP73和VEGF在肝癌组织中的表达水平具有相关性（r=0.271,P〈0.01）。结论 GP73、VEGF和AFP在肝癌组织中呈高表达,联合检测三者有助于原发性肝癌的诊断。     

AFP-L3和GP73在原发性肝癌中的诊断价值

目的探讨AFP-L3和GP73在原发性肝癌中的诊断价值。方法分别检测来我院就诊的肝癌、肝硬化和肝炎患者的AFP-L3和GP73的含量,并对结果进行统计学分析。结果肝癌组与肝硬化和肝炎组GP73和AFP-L3的含量有统计学差异,肝癌组与肝硬化、肝癌组与肝炎组的GP73阳性率和AFP-L3含量有差异,但是肝硬化与肝炎组之间没有差异。血清GP73诊断原发性肝癌临界值为117.66μg/L,曲线下面积0.758,95%置信区间0.593～0.922,其诊断灵敏度为83.33%,特异度为69.1%;血清AFP-L3诊断原发性肝癌临界值为1.09%,曲线下面积0.722,95%置信区间0.539～0.905,其诊断灵敏度为58.30%,特异度为85.5%。结论 AFP-L3和GP73对原发性肝癌的诊断具有重要价值,可为临床决策提供参考。     

白细胞相关免疫球蛋白样受体-2的克隆、原核表达及纯化

以人白细胞相关免疫球蛋白样受体-2 (LAIR-2/CD306) cDNA质粒为模板,通过PCR技术获得该蛋白成熟区基因片段,插入表达载体pET28a的多克隆位点,进而将构建的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达,所得重组蛋白以包涵体形式存在,包涵体经变性、复性及亲合色谱分离后获得重组蛋白.     

GP73的联合检测用于早期肝癌筛查的可行性研究

目的 探讨高尔基体蛋白73(GP73)血清及其基因表达在原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)中的诊断价值。方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测105例PHC、106例肝硬化患者和102例健康人的血清GP73和甲胎球蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平。采用实时荧光定量(RT-PCR)法对各组外周血单个核细胞GP73 mRNA的拷贝数进行检测,采用Ct值比较法计算GP73 mRNA相对表达水平,并检测12份正常肝组织以及12份肝癌组织的GP73 mRNA相对表达水平。结果 PHC组GP73中位血清浓度明显高于肝硬化组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。PHC组和肝硬化组患者的AFP中位血清浓度差异无统计学意义。GP73诊断肝癌的敏感度为72.7%,特异度为70.8%,AFP的敏感度为49.8%,特异度为95.9%。两者联合检测肝癌的敏感度为79.6%,特异度为80.3%。3组间全血GP73 mRNA含量无统计学差异,肝癌组织GP73 mRNA表达量(12.87)明显高于正常肝组织(1.08),差异有统计学意义(P<0.01)。结论 GP73诊断PHC具有较好的敏感度,GP73与AFP联合检测可进一步提高诊断早期肝癌的敏感度。肝组织标本GP73 mRNA可为诊断原发性肝癌的肿瘤标志,但存在创伤大、风险大等弊端。     

细胞穿透肽TAT融合小鼠nNOS1-133重组蛋白的表达纯化及药效学研究

目的:表达、纯化有活性的TAT-nNOS1-133重组蛋白,并初步验证其神经保护作用;为开发新神经保护药物提供理论基础。方法:通过PCR、酶切和酶连的方法构建pET28a-TATnNOS1-133重组质粒,并转化入大肠杆菌中表达。表达产物经洗涤、复性、阴离子交换柱(DEAE-52)、超滤纯化并除盐。通过FITC标记目的蛋白评价其能否进入细胞,并通过检测细胞凋亡评价TAT-nNOS1-133对谷氨酸诱导的兴奋性毒性的保护作用。结果:获得了较高纯度的TAT-nNOS1-133重组蛋白,经SDS-PAGE电泳显示相对分子质量在17 kD附近有单一条带,且与理论分子质量一致。TAT-nNOS1-133可以进入神经细胞,并减少了谷氨酸诱导的PI阳性细胞数增多。结论:成功构建了TAT-nNOS1-133的原核表达系统并建立了其分离纯化方案。TAT-nNOS1-133可以进入细胞并且减轻了脑卒中病理模型谷氨酸诱导的兴奋性毒性。     

基因编码蛋白P_(73)和P_(53)在胃癌中表达的相关性研究

目的 :探讨基因编码蛋白 P73和 P53在胃癌中表达的相关性 ,以及与临床病理特征的关系。方法 :应用免疫组织化学方法 (S- P法 )检测 39例胃癌及 17例萎缩性胃炎、4 0例慢性炎性息肉中的 P73、P53蛋白的表达情况 ,并结合临床病理资料进行统计学分析。结果 :P73蛋白在胃癌中高表达 ,阳性率为 6 4 .1% ,与慢性炎性息肉组、萎缩性胃炎组比较有显著性差异 (P<0 .0 5 ) ;P73与组织学分型、TNM分期、淋巴结转移无相关 (P>0 .0 5 ) ;P53蛋白在胃癌中的阳性表达率为 6 4 .1% ,与慢性炎性息肉组、萎缩性胃炎组比较有显著性差异 (P<0 .0 5 ) ,与组织学分型、TNM分期、淋巴结转移无相关 (P>0 .0 5 )。结论 :P73高表达可能是一个胃癌发生的热点基因变化 ,基因蛋白 P73在胃癌中的表达对胃癌的发生发展可能起着重要作用 ,P73作为一个抑癌基因 ,有其组织特异性。P73和 P53蛋白虽然具有很高的同源性 ,但二者对胃癌的发生并无协同作用。     

AFP、AFP-L3%与GP73联合检测对原发性肝癌的诊断价值

目的:探讨甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体L3比率(AFP-L3%)与高尔基体蛋白73(GP73)联合检测对原发性肝癌(PHC)的诊断价值。方法:选择2019年4月~2021年4月某院收治的86例疑似PHC患者,所有入选者均检测AFP、AFP-L3%、GP73阳性情况。以病理检查结果作为金标准,比较良性病变组与PHC组AFP、AFP-L3%、GP73水平,分析AFP、AFP-L3%、GP73单独与联合检测诊断PHC的应用价值。结果:86例疑似PHC患者经病理检查确诊48例为PHC,占比为55.81%,38例为良性肝脏疾病,占比为44.19%;PHC组AFP、AFP-L3%、GP73水平均高于良性病变组,差异有统计学意义(P<0.05);AFP、AFP-L3%、GP73联合诊断PHC的灵敏度为91.67%(44/48)、特异度92.11%(35/38)、准确度91.86%(79/86)、阳性预测值93.62%(44/47)、阴性预测值89.74%(35/39)均高于AFP、AFP-L3%、GP73各项单独检测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在PHC诊断中采用AFP、AFP-L3%、GP73联合检测,能够提高诊断准确度、灵敏度,为早期诊断、治疗提供更多参考依据,具有较高的应用价值。