金黄色葡萄球菌肠毒素A诱导黑素瘤B16细胞凋亡的体外研究

目的 探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)诱导黑素瘤B16细胞凋亡.方法 用不同浓度的SEA(0.001、0.01、0.1、1 μg/mL)作用于体外培养的B16细胞,采用荧光法观察SEA诱导B16细胞凋亡的形态学改变,用末端标记法(TUNEL)计算细胞凋亡率,用流式细胞仪分析B16细胞的凋亡周期.结果 三种方法均显示SEA对小鼠B16细胞有明显的诱导凋亡作用,SEA在0.01 μg/mL浓度时B16细胞的凋亡率最高.结论 超搞原SEA对体外培养的小鼠B16细胞有诱导凋亡的作用.     

金黄色葡萄球菌肠毒素A对B16恶性黑素瘤细胞的杀伤作用

金黄色葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxinA,SEA)系金黄色葡萄球菌分泌的一种肠毒素,是具有高效激活T淋巴细胞能力的蛋白质抗原分子。为了能系统地了解SEA对肿瘤细胞的杀伤作用,我们通过体外试验检测了SEA活化的小鼠脾脏淋巴细胞对B16恶性黑素瘤(malignant melanoma,MM)细胞的杀伤作用。     

311nm中波紫外线调节B16黑素瘤细胞树突生成的研究

目的 探讨311 nm中波紫外线通过Rho家族小GTP酶对B16小鼠黑素瘤细胞树突生成的影响.方法 用相差显微镜和激光共聚焦显微镜分别观察311 nm中波紫外线照射后对B16黑素瘤细胞的树突变化和细胞骨架蛋白F-肌动蛋白的影响;用Pull down方法检测311 nm中波紫外线照射前及照射后不同时间点(15、30、60和120 min)B16黑素瘤细胞GTP-RhoA和GTP-Racl蛋白的表达情况.结果 311 nm中波紫外线100 mJ/cm2照射后24 h,B16黑素瘤细胞呈现胞体增大近似球状,树突明显增多似树枝,与未照光细胞比较树突数量明显增多(P＜0.01);而未照光细胞的树突仅表现为双极或三极,细胞分叉不明显.激光共聚焦显微镜显示,311 nm中波紫外线100 mJ/cm2照射前,B16黑素瘤细胞内张力纤维纹理清晰,照射后30 min和60 min细胞内张力纤维解聚、断裂,纹理欠清晰,在照射后6 h时张力纤维纹理模糊,呈团块状.Pull down结果显示,311 nm中波紫外线100 mJ/cm2照射后15 min和30 min,B16黑素瘤细胞GTP-Racl蛋白的表达逐渐升高,在30 min时表达是照射前的2倍多,随后略有下降,但在照射后60 min和120 min时表达仍高于对照组;而GTP-RhoA蛋白在照射后略有下降,而后逐渐升高,在照射后120 min时升高到照射前的1.6倍.结论 311 nm中波紫外线可通过活化Racl促B16黑素瘤细胞树突生成.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B对LAD2肥大细胞系活化作用的研究

目的 用LAD2肥大细胞系与金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)共培养,探讨SEB对肥大细胞非IgE机制的活化作用.方法 建立LAD2与不同浓度的SEB(0.01、0.1、1、10、100 μg/ml)以及A23187阳性对照、阴性对照的孵育体系,培养箱中培养30 min后,光镜下观察SEB对肥大细胞的细胞形态影响并收集各体系上清液,通过酶活性法检测肥大细胞分泌的类胰蛋白酶浓度,并通过ELISA法检测组胺水平.结果 LAD2与SEB共孵育30 min后,光镜下可见肥大细胞形态为细胞略增大、边缘模糊、突起增多,折光性下降,呈放射状毛刺样.LAD2与不同浓度SEB(0.01、0.1、1、10、100 μg/ml)共孵育30 min后,上清液检测类胰蛋白酶浓度分别为(4.116±0.651)、(5.344±0.874)、(3.806±0.459)、(1.309±0.247)、(0.310±0.199) ng/ml,SEB浓度在0.01、0.1、1μg/ml时,释放类胰蛋白酶浓度明显高于阴性对照组(P＜0.05),而SEB浓度继续增加则类胰蛋白酶浓度水平依次下降.不同SEB浓度下检测组胺水平分别为(242.409±63.915)、(522.491±73.466)、(550.926±84.466)、(334.397±33.640)、(226.527±5.678) ng/ml,SEB浓度在0.01、0.1、1μg/ml时,肥大细胞释放的组胺浓度随SEB浓度的增加而增高,明显高于阴性对照组(P＜0.05);而SEB浓度继续增加时,肥大细胞释放组胺浓度依次下降.结论 SEB可通过非IgE依赖机制直接作用于肥大细胞,使肥大细胞活化发生形态变化并释放类胰蛋白酶和组胺.     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在C57BL/6小鼠淋巴细胞中的表达

目的 通过复制缺陷型腺病毒载体的介导,将金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染入C57BL/6小鼠淋巴细胞中,观察基因表达产物对B16细胞的作用。方法 通过MTT法直接测定重组腺病毒颗粒感染的淋巴细胞的增殖情况,采用双抗体夹心ABC-ELISA法,测定淋巴细胞培养上清液中白介素2的水平。MTT法测定活细胞数目,以了解活化的C57BL/6小鼠淋巴细胞对B16细胞的杀伤效应。结果 加入不同滴度的重组腺病毒颗粒后,C57BL/6小鼠淋巴细胞明显增殖;同时淋巴细胞培养上清液中白介素2水平也明显增加。重组腺病毒颗粒转染的C57BL/6小鼠淋巴细胞可明显杀伤B16细胞,效/靶比越高,杀伤效应越明显。结论 SEA基因可以在C57BL/6小鼠淋巴细胞中表达,并且表达产物能够活化C57BL/6小鼠淋巴细胞,进而杀伤B16细胞。     

转移抑制基因nm23在恶性黑素瘤中的表达

为了研究ｎｍ２３／二磷酸核苷激酶（ＮＤＰＫ）表达与人恶性黑素瘤（恶黑）转移潜力的关系，我们用免疫组化技术研究了恶黑组织中ｎｍ２３基因的表达，以及表达程度与组织病理、细胞ＤＮＡ含量、增殖指数和临床预后的相关性。结果发现ｎｍ２３／ＮＤＰＫ在转移性恶黑及原发性恶黑伴淋巴结转移时表达减低。其表达程度与ＤＮＡ含量及增殖指数呈负相关，而与临床分期无关。另外，ｎｍ２３／ＮＤＰＫ表达程度高者生存时间较表达低者长。     

跨膜型血型A抗原模拟肽疫苗在黑素瘤细胞B16中表达及细胞毒效应检测

目的　建立稳定表达跨膜型血型A抗原模拟肽疫苗的恶性黑素瘤细胞株B16,并检测体外细胞毒活性。方法 采用脂质体转染法将前期构建的模拟肽疫苗稳定转染B16细胞进行表达,RT-PCR 及Western印迹法检测模拟肽/Fas融合基因及巨噬细胞炎症蛋白3β（Mip3β）的 mRNA及蛋白表达。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测疫苗介导的补体依赖性细胞毒效应（CDC）及抗体依赖的细胞介导细胞毒效应（ADCC）。结果 RT-PCR 在预期位置检测到特异性条带。Western印迹表明,表达产物具有特异的结合抗血型A抗体活性。析因分析提示不同分组之间CDC效应总体差异有统计学意义（F = 244.522,P < 0.01）,ADCC效应总体差异也有统计学意义（F = 71.593,P < 0.01）。组间比较示M-pIRES组CDC效应与空质粒pIRES组无统计学差异,两组均明显低于P/F-M-pIRES组和P/F-pIRES组;P/F-M-pIRES组、P/F-pIRES组ADCC效应明显强于M-pIRES组与pIRES组,P/F-M-pIRES组ADCC效应明显强于P/F-pIRES组（F = 15.42,P < 0.05）。结论　跨膜型血型A抗原模拟肽疫苗可在B16细胞膜稳定表达,且可通过介导CDC和ADCC发挥对黑素瘤细胞B16的杀伤作用。     

复方中药对小鼠B－16黑素瘤细胞株黑素合成和酪氨酸酶的激活作用

目的 研究复方中药对小鼠 B－ 16黑素瘤细胞株细胞增殖、黑素合成的影响,及其对细胞内酪氨酸酶的激活作用。方法 四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法测定中药对细胞增殖的影响;酶学方法研究中药对酪氨酸酶活性的作用; 470 nm比色标准曲线法测定黑素含量。结果 研究发现复方 3号（补肝肾为主）促进黑素细胞增殖和色素合成的能力高于复方 1号（光敏感性药物）或复方 2号（活血化瘀）,而酶激活能力复方 1号较为稳定。结论 在白癜风治疗中补肝肾类中药不可忽视。同时也说明影响黑素合成的因素是多方面的,可能不仅仅与酪氨酸酶活性有关。     

溶瘤腺病毒介导的IL-18在黑素瘤A375细胞中的表达

目的构建携带人IL-18基因的溶瘤腺病毒,观察在A375细胞中IL-18基因的表达情况。方法将pZD55-IL-18与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染293细胞获得重组腺病毒。PCR鉴定条件增殖腺病毒ZD55- IL-18。以ZD55-IL-18感染人黑素瘤A375细胞系,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-18基因mRNA的表达;Western blot法检测腺病毒E1A的表达情况;结晶紫染色法检测细胞杀伤作用;MTY法检测细胞存活情况。结果PCR鉴定表明ZD55-IL-18构建成功;RT-PCR和Western blot结果表明,ZD55-IL-18能高效介导IL-18基因在A375细胞中的表达,并在肿瘤细胞内表达E1A;结晶紫染色和MTT结果表明,ZD55-IL-18对A375细胞有明显的杀伤作用。结论构建成功的溶瘤腺病毒ZD55-IL-18,可在A375细胞中高效表达IL-18基因,并能抑制黑素瘤细胞生长。     

重组腺病毒载体转染 CTLA4Ig基因在毛乳头细胞中的表达

目的：探讨免疫耐受基因（CTLA4Ig）在毛乳头细胞中的表达,为毛乳头细胞移植后产生免疫耐受提供理论和实验依据。方法：通过构建的重组腺病毒载体将免疫耐受基因（CTLA4Ig）cDNA导入培养的毛乳头细胞中,并将体外基因转染的毛乳头细胞移植到小鼠体内,通过组织学和免疫组化检测目的基因在体内和体外的表达。结果CTLA4Ig蛋白在基因转染6h后即在细胞浆中表达,随着转染时间的延长其表达逐渐增加;基因转染的毛乳头细胞移植到小鼠体内,目的基因在24h开始表达,能持续表达2周;移植细胞未受到免疫排斥。结论：带有CTLA4Ig基因的毛乳头细胞在体外和小鼠体内能较长时间存活并表达CTLA4Ig。     

白花蛇舌草总黄酮对黑色素瘤A375和B16细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察白花蛇舌草总黄酮（FOD）对体外培养黑色素瘤A375和B16细胞增殖和凋亡的影响。方法：体外培养黑色素瘤A375和B16细胞,使用不同浓度的FOD作用24 h、48 h,采用MTT比色法检测细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪测定细胞凋亡的影响。结果：FOD抑制黑色素瘤A375和B16细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用呈明显的浓度和时间依赖性。结论：FOD能有效抑制黑色素瘤A375和B16细胞细胞增殖,并诱导细胞凋亡。     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因腺病毒载体,并在真核细胞表达。方法用PCR法,扩增出HPV11E7基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体形成重组质粒TOPO-E7。TOPO-E7与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DESTTM重组反应,E7基因被重组到腺病毒载体上。该载体经PacI酶切,脂质体法转染人胚肾293A细胞,获得重组腺病毒载体pAD-E7。pAD-E7转染人HaCaT细胞,激光共聚焦显微镜分析E7蛋白表达情况。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒TOPO-E7成功构建。重组子pAD-E7转染293A细胞后,获得滴度为1.4×107pfu/mL的重组腺病毒载体。该载体转染HaCaT细胞,48h后激光共聚焦显微镜下可见细胞内E7蛋白表达。结论重组腺病毒载体能有效介导HPV11E7基因在真核细胞的表达。     

积雪甙对黑素瘤细胞生长影响的实验研究

目的 研究积雪甙对黑素瘤细胞生长的影响。方法 将黑素瘤细胞B16常规传代培养,取其生长状态良好的对数生长期细胞,观察积雪甙对B16细胞的生长抑制作用,并进行对B16细胞生长抑制作用的形态学观察,用流式细胞仪检测积雪甙对B16细胞诱导凋亡的作用。结果 随着积雪甙的剂量增加,对B16细胞有丝分裂的抑制增加。代表凋亡早期细胞的annexin-v阳性细胞比例增加,摄取标记细胞线粒体的R123的细胞比例降低,而标记核内DNA的PI阳性细胞的比例增加,表明该药能够诱导细胞凋亡或致死亡。结论 积雪甙有抗黑素瘤细胞生长作用。     

HSPC011基因在毛乳头细胞的表达及其cDNA克隆

目的 确定HSPC011基因在毛乳头细胞的表达,并克隆其cDNA.方法 原位杂交技术证实HSPC011基因在毛乳头细胞表达;RT-PCR扩增目的基因并构建重组真核表达质粒pCI-neo/HSPCO11.结果 细胞内mRNA原位杂交证实HSPC011基因在凝集性生长的毛乳头细胞表达,而在非凝集性生长的毛乳头细胞和人真皮成纤维细胞不表达;RT-PCR从毛乳头细胞RNA中扩增到约430bp目的基因片段;构建了重组质粒pCI-neo/HSPCO11,酶切分析和测序结果均表明目的片段与HSPC011基因相应序列完全一致.结论 HSPC011基因在毛乳头细胞表达,其表达可能与毛乳头细胞的分化和功能状态有关.     

可溶性PD-1及联合Hsp70-B16抗原肽复合物对小鼠黑素瘤肺转移的抑制作用

目的 探讨黑素瘤肺转移小鼠模型体内表达可溶性PD-1（sPD-1）对B7-H1/PD-1信号传导的阻断作用，及联合Hsp70-B16抗原肽对小鼠黑素瘤肺转移的抑制作用。方法 建立小鼠黑素瘤肺转移模型，应用免疫组织化学染色和流式细胞术检测肺转移灶PD-1及B7-H1的表达情况，从小鼠尾静脉注射sPD-1表达质粒，并联合应用Hsp70-B16抗原肽皮下免疫小鼠，于接种瘤细胞后第17天解剖小鼠，观察黑素瘤肺转移的情况，检测各组小鼠肺转移灶局部淋巴细胞浸润及部分免疫学指标。结果 小鼠黑素瘤肺转移模型成功建立，肺转移灶局部有大量的PD-1阳性细胞，转移瘤B16细胞表面表达较多B7-H1分子，静脉注射sPD-1表达质粒联合抗原肽免疫治疗组小鼠肺转移明显受抑制，抑制率达95％，显著高于对照组，其对应组小鼠肺部CD8+ T淋巴细胞的数量、脾淋巴细胞的细胞毒活性及血清中的IL-2和IFN-γ的浓度均明显高于对照组（P < 0.01）。结论 小鼠体内转染表达sPD-1可阻断B7-H1/PD-1信号传导，抑制小鼠黑素瘤肺转移，联合应用Hsp70-B16抗原肽具有明显的协同作用。     

麦冬皂苷B通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡

目的探讨麦冬皂苷B对人黑色素瘤(Melanoma)A375细胞增殖,凋亡和细胞周期的影响以及相关机制。方法麦冬皂苷B处理A375细胞后,采用CCK-8法检测细胞活力;流式细胞仪检测A375细胞周期变化及细胞凋亡水平;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡形态;免疫印迹法检测麦冬皂苷B对A375细胞PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT蛋白以及通路下游凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Cleaved-caspase3表达的影响。结果麦冬皂苷B能抑制A375细胞增殖活力及PI3K/Akt/mTOR通路的活化;麦冬皂苷B促进了A375细胞内Bax和Cleaved-caspase 3的表达,抑制Bcl-2表达,诱导人黑色素瘤细胞发生凋亡;麦冬皂苷B阻滞了A375细胞细胞周期,G0/G1期细胞比例明显升高;PI3K/Akt/mTOR通路活化剂IGF-1处理A375细胞后抑制了麦冬皂苷B的上述作用。结论麦冬皂苷B能抑制A375细胞的增殖,诱导细胞发生凋亡,阻滞细胞周期于G0/G1期。