广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库的构建及免疫学筛选

目的构建广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库,免疫学筛选抗原基因。方法提取广州管圆线虫Ⅴ期幼虫总RNA,用Clontech公司的SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建未扩增文库,检测未扩增文库滴度和重组率后,进行文库扩增。用大鼠感染血清作免疫探针筛选文库,PCR扩增外源基因插入片段并测序,用生物信息学软件进行同源性比对,推导氨基酸序列,预测其理化性质。结果成功构建了广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库,免疫学筛选获得11个阳性克隆,对测序的9个阳性克隆进行初步分析,1个与广州管圆线虫Ⅴ期幼虫的1个EST同源性为99%,6个(有2个为同一克隆)与秀丽隐杆线虫和新杆状线虫均有不同程度的同源性,最高达91%。共有7个阳性克隆存在完整的开放阅读框。结论从广州管圆线虫Ⅴ期幼虫cDNA文库中初步筛选出7个有诊断意义的抗原基因,为其相关研究奠定了基础。     

结肠黏膜组织蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立与优化

目的为开展人类结肠黏膜组织的蛋白质组研究,建立并优化其蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术,提高其分辨率及重复性.方法采用电子结肠镜直视下活检钳取结肠黏膜组织,对组织蛋白质的提取方法进行改进以达到考马斯亮蓝法染色所需的浓度,优化双向凝胶电泳的关键因素与环节,如第一向固相pH梯度(IPG)等电聚焦的上样量及电泳参数,第二向垂直平板SDS凝胶浓度等.结果以固相pH梯度-IPG胶条(pH=3～10)进行第一向等电聚焦,以SDS均一胶(12.5%)的垂直电泳为第二向,成功地得到了人类结肠黏膜组织的双向凝胶电泳图谱.平均含333±36个蛋白点,匹配率85.56%.结论优化人类结肠黏膜组织蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术可以建立高分辨率和良好重复性的双向凝胶电泳图谱.     

福寿螺体内广州管圆线虫Ⅲ期幼虫的形态学观察

目的观察福寿螺体内广州管圆线虫Ⅲ期幼虫的形态学特征。方法实验室培养的广州管圆线虫Ⅰ期幼虫感染禁食24h的福寿螺,61d解剖,取其肺囊和足肌,常规制作石蜡切片,观察其Ⅲ期幼虫外部形态和内部结构。结果Ⅲ期幼虫虫体卷曲,头部圆钝,咽管始于头部顶端的口孔,在咽肠连接处与肠管连接,尾部尖,肛管清晰。幼虫皮层为伊红染色,皮层外有一层无色透明的鞘膜。部分虫体尾部出现圆柱体,有些幼虫体内出现亚腹腺、很短的双管子宫等Ⅳ期幼虫早期特征。结论广州管圆线虫Ⅲ期幼虫的形态学特征清晰,对预防广州管圆线虫病流行有一定意义。     

抗广州管圆线虫Ⅴ期幼虫55ku抗原单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的制备抗广州管圆线虫Ⅴ期幼虫55 ku抗原单克隆抗体,初步应用于大鼠广州管圆线虫感染检测。方法利用Western blot鉴定能被感染广州管圆线虫Ⅴ期幼虫大鼠血清识别的特异性抗原,经电渗法获得抗原后免疫BALB/c小鼠;取脾细胞,采用常规细胞融合方法建立筛选分泌高滴度、高特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,用ELISA、Western blot对获得的杂交瘤细胞株进行鉴定,用生产的单克隆抗体以抗体夹心ELISA法检测感染广州管圆线虫Ⅴ期幼虫大鼠血清循环抗原水平。结果经Western blot鉴定,得到能被感染广州管圆线虫Ⅴ期幼虫大鼠血清识别的广州管圆线虫Ⅴ期幼虫55 ku抗原;获得2株分泌高滴度抗广州管圆线虫Ⅴ期幼虫55 ku抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为ACV1和ACV2,其分泌的抗体均为IgG2b亚型,均能识别广州管圆线虫Ⅴ期幼虫55 ku抗原,与日本血吸虫抗原等其他寄生虫抗原无交叉反应。用该单抗以ELISA方法检测感染广州管圆线虫Ⅴ期幼虫大鼠血清循环抗原,阳性率为73.3%(22/30)。结论制备的抗广州管圆线虫Ⅴ期幼虫55 ku抗原杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的单克隆抗体,该单抗可应用于广州管圆线虫Ⅴ期幼虫循环抗原的检测。     

PCR检测大瓶螺体内广州管圆线虫幼虫方法的建立

目的 建立一种基于PCR方法检测大瓶螺体内广州管圆线虫幼虫的方法。 方法 从美国生物信息中心 GenBank中获得广州管圆线虫感染性III期幼虫（L₃）cDNA特异性片断，应用美国 DNASTAR公司Lasergene软件，设计特异性引物。TRIzol 一步法抽提广州管圆线虫感染性L₃和大瓶螺总RNA，按RT-PCR试剂盒提供方法进行PCR 扩增。 结果 用RT?鄄PCR方法能检测出阴性与感染性螺，其最低检出的总RNA量相当于1条广州管圆线虫L₃；将阴性大瓶螺总RNA与感染期幼虫总RNA不同浓度混合，PCR法可检测出肉眼能分辨的电泳条带相当于总RNA浓度为128 pg。此方法可以检测出广州管圆线虫III期幼虫RNA的最低值为105 pg。 结论 建立了PCR检测大瓶螺体内广州管圆线虫幼虫的方法。     

用多重PCR技术检测小管福寿螺体内广州管圆线虫幼虫

目的建立一种多重PCR方法检测小管福寿螺体内的广州管圆线虫幼虫。方法根据广州管圆线虫核糖体小亚基rDNA基因序列(GenBank登录号为AY295804)设计特异性引物,并与小管福寿螺16srDNA的特异性引物组合,建立多重PCR检测方法。分别以阳性和阴性小管福寿螺DNA为模板进行多重PCR扩增,电泳鉴定并测序。用阴性小管福寿螺DNA倍比稀释200条广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA模板,使之浓度分别为1200ng/μl、120ng/μl、12ng/μl、1200pg/μl、120pg/μl和12pg/μl,检测该方法的敏感性。野外采集小管福寿螺172只,肺检法检测后,进行多重PCR扩增,计算敏感性和特异性。结果电泳和测序结果证实该多重PCR检测方法能有效扩增出目的片段,小管福寿螺和广州管圆线虫的目的片段分别为550和405bp。该方法可检测出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA的最小浓度为120pg/μl。肺检法和多重PCR法检测均为阳性结果的45只,两法均为阴性的100只。肺检法为阴性、多重PCR法为阳性的24只,肺检法为阳性而多重PCR法检测为阴性的3只。多重PCR的敏感性和特异性分别为93.8%(45/48)和80.6%(100/124)。多重PCR法的阳性检出率为40.1%(69/172),肺检法阳性检出率为27.9%(48/172),差异具有统计学意义(χ2=14.8,P0.01)。结论建立了检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的多重PCR方法。     

广州管圆线虫幼虫致小鼠脑组织细胞凋亡研究

目的建立广州管圆线虫幼虫实验感染ICR小鼠动物模型,对其脑组织细胞凋亡情况进行检测。方法对小鼠动物模型脑组织切片,HE染色观察凋亡细胞的形态变化,再利用TUNEL法进行组织细胞凋亡水平检测及Western-blot方法检测不同感染时期小鼠脑组织中Caspase3表达水平变化,对广州管圆线虫幼虫致小鼠脑组织细胞凋亡进行综合评价。结果HE染色发现感染鼠脑组织细胞形态变化,经TUNEL法观察到感染鼠大脑、小脑、脑干部分均有不同程度的细胞凋亡,细胞凋亡率分别为20%、50%和70%,且用Western-blot方法分析Caspase3结果显示随着幼虫感染小鼠时间的延长,活性Caspase3表达量增加,即细胞凋亡程度增加。结论证实广州管圆线虫幼虫可诱导小鼠脑组织细胞凋亡,且随感染时间的延长组织凋亡水平亦增加。     

广州管圆线虫感染大鼠脑组织转录组分析

目的 了解广州管圆线虫感染后大鼠脑组织转录组的表达水平。方法 将32只SD大鼠随机分为对照组（12只）和感染组（20只）,感染组每只大鼠经灌胃感染40条广州管圆线虫Ⅲ期幼虫,对照组灌胃等体积生理盐水。感染后1、7、14、21 d,对照组、感染组分别随机解剖3、5只,取脑组织制备石蜡切片,苏木精-伊红（HE）染色后观察脑组织病理变化。TRIzol法提取感染后14 d大鼠脑组织RNA,逆转录为cDNA后测序。选取差异表达mRNA进行基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）代谢通路分析,采用STRING数据库预测差异表达mRNA靶蛋白之间的蛋白质互作（PPI）关系。利用生物信息学方法构建差异表达基因的竞争性内源性RNA (ceRNA)调控网络。采用qPCR验证表达差异的lncRNA。结果 HE染色结果显示,感染广州管圆线虫后14 d,感染组大鼠脑组织出现病理变化,脑海马区神经元胞浆固缩;感染后21 d,脑膜处可见寄生虫样组织。RNA测序结果显示,感染广州管圆线虫后14 d,大鼠脑组织中差异表达mRNA的数量为955个（890个上调、65个下调）;差异表达lncRNA的数量为193个（122个上调、71个下调）。GO富集分析结果显示,差异表达mRNA主要富集在炎症反应、免疫应答等生物过程,细胞成分主要为质膜外侧的胞外空间、细胞表面等,分子功能主要为趋化因子活性、趋化因子受体结合等;KEGG代谢通路分析结果显示,差异表达mRNA主要参与细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子等信号通路。PPI分析结果显示,差异表达基因主要的靶点为趋化因子配体11、RT1-Da、丝氨酸家族E成员1等,均与免疫应答相关。ceRNA结果显示,显著富集的miRNA如mir-466b-3p、mir-1956、mir-207和mir-328a-5p等与免疫应答、细胞凋亡、血管生成等过程有关。qPCR结果显示,感染广州管圆线虫后,感染组大鼠H19的相对转录水平逐渐升高,在感染后21 d达到峰值,为15.074±3.366,高于对照组的1.000±0.113 (t=13.190,P <0.05);RT1-CE6、LOC100910973和lncR-ncf1的相对转录水平在感染后14 d达到峰值,分别为9.702±1.408、6.683±1.299和7.733±0.717,均高于对照组的1.003±0.039、1.001±0.156和0.999±0.076 (t=20.760、13.830、28.810,均P <0.01);AABR07030796.1的相对转录水平在感染后14 d开始上升,至感染后21 d达到峰值,分别为4.485±0.236和5.068±1.608,均高于对照组的1.000±0.159和1.001±0.256 (t=7.049、8.229,均P <0.01)。感染广州管圆线虫后14 d,大鼠脑组织中H19、RT1-CE6、LOC100910973、lncR-ncf1和AABR07030796.1的qPCR结果和RNA测序结果均显示上调,表达趋势一致。结论 广州管圆线虫感染后大鼠脑组织转录组中获得955个差异表达mRNA和193个差异表达lncRNA,主要富集在炎症反应、免疫应答等生物过程。     

丙硫咪唑对小鼠体内广州管圆线虫幼虫的杀灭作用

广州管圆线虫引起的嗜酸粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎主要流行于亚太地区,目前少有有效药物。阿苯达唑是高效杀蠕虫药,且能杀灭幼虫及虫卵。本文报告其对广州管圆线虫的化疗效果。用胃管法以每只50条第3期     

广州管圆线虫Ⅳ期幼虫cDNA文库的筛选及EST序列分析

目的 筛选和鉴定广州管圆线虫未知基因序列,丰富该虫的基因序列数据,为寻找诊断或药物靶点分子提供实验依据.方法 构建广州管圆线虫Ⅳ期幼虫cDNA噬菌体文库,随机挑选单个噬菌斑,提取噬菌体DNA进行PCR,扩增其插入的cDNA片段并对PCR产物进行序列测定;采用生物信息学方法对表达序列标签(expressed sequence tags,EST)序列进行分析.结果 获得了51条广州管圆线虫基因的EST序列,并提交至GenBank,这些基因包括半乳糖凝集素10,半乳糖凝集素140,表皮蛋白,CRE-RPS-24蛋白等.序列分析结果提示,表皮蛋白和CRE-RPS-24蛋白可能为具有诊断价值的抗原分子,值得进一步研究.结论 获得51条广州管圆线虫基因序列,为进一步研究广州管圆线虫致病机制及候选抗原分子提供了新的序列信息.     

广州管圆线虫的生物信息学分析

从GenBank下载1 277条广州管圆线虫的表达序列标签（EST）, 用BlastX比对分析, 并用SignalP V3.0预测潜在的抗原或过敏原相关蛋白N端是否具有分泌信号肽或信号锚定肽。结果显示, 得分值＞100有614条, 其中14条与广州管圆线虫一致, 540条与其他物种的相关蛋白相匹配, 60条与数据库中序列无同源性。614条序列可分为10类, 抗原或过敏原相关蛋白有80条, 编码22种蛋白, 其中12种具有分泌信号肽, 3种具有信号锚定肽。     

左旋米唑在体内对广州管圆线虫和哥斯达黎加管圆线虫幼虫的杀灭效果

广州管圆线虫寄生于野鼠的肺动脉和心脏,是引起人体嗜酸粒细胞性脑膜脑炎的病因,并有从流行区蔓延至世界其它地区的可能性。哥斯达黎加管圆线虫自哥斯达黎加首次报告以来,从墨西哥至巴西的整个西半球相继有许多人体感染的报告。曾用海群生、噻苯达唑作过人体治疗试验,但疗效未能肯定。本研究考核了左旋米唑杀灭鼠体内上述两种管圆线虫幼虫的效果。     

广州管圆线虫脑膜脑炎的诊断和治疗

广州管圆线虫(angiostrongyluscantonensis)的终宿主为哺乳动物,主要是鼠类,中间宿主是陆生螺类或淡水螺类,如玛瑙螺(achatinafulica)、福寿螺(ampullarumcrossean)、蛞蝓等。人多因生吃含有第期幼虫的淡水螺肉而被感染。当婴幼儿在有蛞蝓孳生的地方爬行时,亦有可能获得感染。第期幼虫可侵入肠道、进入血液循环系统,随血流到达各种器官组织。人类只能充当广州管圆线虫的转续宿主。在人体内它可发育为第期和第期幼虫,但不能发育为成虫。幼虫在人体内移行,常侵犯中枢神经系统,引起嗜酸粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜脑脊髓炎。尸检曾发现患者的脑…     

四川省首次在蛞蝓体内检出广州管圆线虫幼虫的报告

目的 调查分析四川省广州管圆线虫中间宿主—蛞蝓的感染情况,分析四川省本地广州管圆线虫病流行因素,为下一步防治工作的开展提供依据。方法 2022年3月17日,调查组到自贡市贡井区在患广州管圆线虫病的患儿家周围菜地、房屋周围和鱼塘边等地方,采取直接捕捉的方式捕捉蛞蝓,采用酶消化法和直接压片法在镜下观察蛞蝓感染广州管圆线虫的情况并记录。结果 在患儿家周围菜地、房屋前后和鱼塘边3个地方分别捕捉到双线嗜粘液蛞蝓5只、3只和1只。通过直接压片法查到有5只蛞蝓体内有广州管圆线虫幼虫,阳性率为55.56%,其中房屋周围捕捉到的3只均为阳性。通过酶消化法查到有2只蛞蝓体内有广州管圆线虫幼虫,阳性率为22.22%。镜下形态符合广州管圆线虫第3期幼虫的特征。结论 此次蛞蝓体内广州管圆线虫幼虫的发现在四川省为首次,需进一步加强广州管圆线虫病防治力度,更深入开展调查,加强健康教育宣传,提高群众防治知识和能力,减少对群众的危害。     

广州管圆线虫感染家猫和犬的观察

广州管圆线虫为嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎的病原体,已有许多文献报告了该虫对猴子和各种鼠类等实验动物的致病作用的研究［１］,但有关猫、犬的感染情况未见报道。我们用广州管圆线虫感染了家猫和狗,现报告如下。１　方法　　从实验感染的福寿螺中分离出广州管圆线虫第三期幼虫［２］,分别感染家猫３只,狗１只。经口感染和皮下注射感染。感染后一定时间用乙醚麻醉后处死解剖,观察脑、脊髓、心和肺部病变。２　结果２．１　猫感染情况观察　用广州管圆线虫的三期幼虫５００条直接经口灌注猫１只,２ｍｉｎ后猫将胃的内容物全…     

广州管圆线虫致病机制的研究进展

广州管圆线虫是一种人兽共患寄生虫，幼虫侵入人体后可移至大脑，主要引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎。其发病为幼虫移行，幼虫在颅部占位并释放代谢产物，基质金属蛋白酶与纤溶酶原活化因子的产生，嗜酸性粒细胞对神经细胞的毒害及超敏反应等多因素作用的结果。偶尔该虫也可侵犯眼球，眼球病变主要是免疫反应导致的损害。了解广州管圆线虫的发病机制，对该病的防治和诊断具有重要意义。     

广州管圆线虫特异性基因的检测

目的广州管圆线虫特异性基因的探索和检测以及其应用诊断价值。方法根据广州管圆线虫的特异性rRNA基因的序列特点,设计引物,对广州管圆线虫成虫、Ⅲ期幼虫及Ⅰ期幼虫及虫卵的DNA进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序。结果经电泳和DNA序列测定,广州管圆线虫各期虫体及虫卵的rRNA基因片段有特异性。结论广州管圆线虫的大亚基rRNA基因是细胞中含量最多,且结构保守,编码为多拷贝的基因,易于检测发现,具有进行诊断广州管圆线虫的价值。     

广州管圆线虫性肺炎的病理学研究

目的 探讨广州管圆线虫肺炎的病理变化特征。方法 大白鼠感染管圆线虫后,用组织学、组织化学及是观察肺组织的形态改变。结果 成虫寄生于肺动脉内形成虫栓,虫卵及幼虫阻塞肺毛细血管形成异物肉芽肿结节。肺血管内弹力膜断裂,坏变上动脉炎及内皮细胞呈弥漫性或簇状乳头状增生。肺部还可伴随支气管炎,肺炎及肺脓肿等改变。结论 实验性广州管圆线虫性肺炎的主要病变为成虫和虫卵的栓塞血管,血管的坏变和内皮细胞高度增生,成虫     

广州管圆线虫的感染与防治

广州管圆线虫[Angiostrongylus cantonensis(Chen,1935)Dougherty,1946]隶属于线形动物门线虫纲尾感器亚纲圆线目管圆科管圆线虫属,它寄生于鼠类肺部血管,偶可寄生人体引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎,是一种人畜共患病.我国学者陈心陶于1933年在广州家鼠及褐家鼠体内发现,命名为广州肺线虫,后由Matsumoto 1937年在台湾报道,到1946年才由Dougherty订正为本虫.首例人体广州管圆线虫病由Nomura和Lin 在台湾发现[1].中国大陆首例广州管圆线虫病由何竞智报道(1984)[2],在国外早在1954年澳大利亚的Brisbane就已发现有广州管圆线虫[3,4].1996年前我国大陆仅发现3例,但在以后短短的6年间已猛增至73例,而如今更有明显增加趋势,最近的感染报道是台湾的某工人体检时[5]及美国游客从牙买加旅行回来的途中被检出[6].