地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立

目的 应用地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞,探讨建立方便可靠的胰岛素抵抗(IR)细胞模型的方法. 方法 3T3-L1前脂肪细胞经1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3-L1脂肪细胞,将其与10 nmol/L和100 nmol/L、1 μmol/L地塞米松共孵育,100 nmol/L胰岛素作用30 min刺激脂肪细胞糖转运.以葡萄糖氧化酶法测定培养液中残余的葡萄糖含量,观察地塞米松对脂肪细胞糖摄取的影响,鉴定IR模型. 结果 地塞米松抑制胰岛素诱导前后的脂肪细胞糖转运,抑制作用呈剂量依赖性,其中1 μmol/L地塞米松的抑制率分别为80%及75%(P＜0.05). 结论 地塞米松可诱导3T3-L1脂肪细胞产生IR,这种细胞模型简便、可靠.     

3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型建立的3种方法对葡萄糖转运时效关系的影响

目的:对比3种不同方法(地塞米松、游离脂肪酸、高糖高胰岛素)诱导的胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖转运时效关系及对葡萄糖转运子4(Glut4)蛋白表达的影响.方法:采用3种不同方法诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗,分别检测各组细胞12,24,36,48及60h时的葡萄糖转运率及各组细胞60 h后Glut4蛋白的表达.结果:在24 h内,造模组细胞的葡萄糖转运率与正常对照组相比均明显降低(P＜0.01);在24 h以后,游离脂肪酸组葡萄糖转运率与正常对照组相比无明显统计学差异(P＞0.05),地塞米松组葡萄糖转运率相比正常对照组明显降低(P＜0.05),而高糖高胰岛素组葡萄糖转运率较地塞米松组明显降低(P＜0.01);地塞米松组及游离脂肪酸组的Glut4蛋白表达水平较正常对照组明显降低(P＜0.01);相对于地塞米松组及游离脂肪酸组,高糖高胰岛素组的Glut4蛋白表达水平明显降低(P＜0.01).结论:高糖高胰岛素能够诱导3T3-L1脂肪细胞产生更强的胰岛素抵抗,这种抗性的产生可能是因为抑制了Glut4蛋白的表达获得的.     

IR-3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞的建立

目的探讨3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞（insulin resistant 3T3-L1 adipocytes cell, IR-3T3-L1）最佳的建立条件。方法采用
地塞米松（Dexamethason,DEX）、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（3-isobutyl-methylxanthine, IBMX）和不同浓度的胰岛素（10-8、10-7、
10-6 mol·L-1）诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,Oil red O染色确定最佳胰岛素诱导浓度,继而用1 μmol·L-1 DEX
诱导建立IR-3T3-L1 脂肪胰岛素抵抗细胞。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（Glucose oxidase-peroxidase, GOD-POD）法对
IR-3T3-L1细胞的最佳诱导时间（24~120 h）及其稳定时间（24~48 h）进行了考察。结果Oil red O染色发现3T3-L1前脂肪细胞
用DEX、IBMX和10-6 mol·L-1胰岛素诱导9 d,>90% 的前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞;用1 μmol·L-1 DEX培养96 h后,脂肪
细胞葡萄糖消耗率达到最大（P=0.0003）;稳定时间考察发现,在36 h内葡萄糖消耗与对照组比较有统计学意义（P<0.001）。结
论3T3-L1前脂肪细胞在1 μmol·L-1 DEX、0.5 mmol·L-1 IBMX 和10-6 mol·L-1最佳胰岛素浓度作用下诱导分化为成熟的脂肪细
胞后,用1 μmol·L-1 DEX培养96 h即可成功诱导成IR-3T3-L1-IR脂肪胰岛素抵抗细胞,且在36 h内稳定。
     

内质网应激可介导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗

目的观察内质网应激(ERs)抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)对ERs诱导剂衣霉素(TM)介导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的干预效果,探讨脂肪细胞IR与ERs的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并将其诱导分化为成熟的脂肪细胞。以MTT比色法检测不同干预条件下脂肪细胞存活情况、以葡萄糖氧化酶法(GOD)法检测不同干预条件下脂肪细胞葡萄糖消耗情况,利用Western blot检测不同干预条件下ERs关键信号蛋白(P-IRE、IRE)的表达差异。结果 (1)5μg/mL TM作用5h后可使胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量降低19.7%(P<0.05),而1mmol/L TUDCA预处理24h后均可缓解TM的抑制作用。(2)Westernblot显示,5μg/mL TM作用5h明显增加P-IRE的表达,而经1mmol/L TUDCA预处理24h后可减少P-IRE的表达。不同处理因素对总IRE的表达无明显影响。结论 ERs可诱导3T3-L1脂肪细胞发生IR,缓解ERs可减轻IR。     

GOD-POD法在3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗评价中的应用

目的:通过葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(Glucose oxidase-peroxidase,GOD-POD)法检测脂肪细胞葡萄糖消耗,建立简便、经济的脂肪细胞胰岛素敏感性的评价方法.方法:诱导分化成熟的313-L1脂肪细胞,分别采用高浓度葡萄糖(25 mmol/L)、地塞米松(Dexamethagone,DEX)(1.0 μmol/L)诱导脂肪细胞产生胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR),GOD-POD法测定糖浓度,动态观察诱导过程中细胞糖消耗,并计算胰岛素敏感性指数(Insulin sensitivity index,ISI);同时应用RT-PCR检测脂联素(Adiponectin)mRNA表达.结果:通过该方法检测,可以反映脂肪细胞对葡萄糖的摄取利用,以胰岛素刺激下较基础状态细胞葡萄糖消耗的增加量,计算出ISI,能够反映细胞对胰岛素的敏感性及抵抗程度.结论:GOD-POD法能够准确测定细胞总体葡萄糖消耗,可用于脂肪细胞糖摄取利用与IR评价,此方法操作简便、经济易行.     

熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型CAP表达的影响

目的：观察熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗、摄取及细胞分化的影响,并探讨其作用机制。方法：将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,用高糖、高胰岛素联合诱导胰岛素抵抗模型。使用葡萄糖氧化酶法检测3T3-L1细胞葡萄糖消耗量,氚标葡萄糖法检测其葡萄糖摄取量,以评价模型建立情况。用四唑盐（methylthiazolyltetrazolium,MTT）比色法检测不同浓度熊果酸对3T3-L1脂肪细胞活力的影响以确定实验药物浓度。加入不同浓度熊果酸分组干预,用氚标葡萄糖法检测脂肪细胞葡萄糖摄取量;用油红O色法检测3T3-L1脂肪细胞分化情况;用实时荧光定量聚合酶链反应法、蛋白质印迹法分别观察熊果酸对3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型细胞分化相关蛋白脂肪细胞脂类结合蛋白、基质金属蛋白酶1和原癌基因Cbl相关蛋白（c-Cbl-associatedprotein,CAP）表达的影响。结果：在成功建立胰岛素抵抗模型的基础上,使用MTT法检测细胞活力。确定熊果酸的作用浓度在4～20μmol／L。与模型组相比,低、高剂量熊果酸组（10、20μmol／L）及罗格列酮组（5μmol／L．）葡萄糖摄取均明显升高（P〈0．01）;低、高剂量熊果酸组3T3-L1脂肪细胞分化程度低于对照组和罗格列酮组。熊果酸可明显上调3T3-I,1细胞胰岛素抵抗模型CAPmRNA及蛋白的表达（P〈0．01）。结论：熊果酸改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的同时可抑制其分化,这一机制可能与熊果酸上调脂肪细胞CAP的表达有关。     

3T3-L1脂肪细胞中高糖诱导胰岛素抵抗的分子机制

观察 3T3-L1脂肪细胞长期暴露到高浓度葡萄糖对糖的转运活动和胰岛素信号蛋白的表达及磷酸化的影响。结果表明 ,在 3T3 -L1脂肪细胞中高浓度葡萄糖 (10 ,15和 2 5mmol·L-1)培养 2 4h ,以一种剂量依赖的方式诱导基础的和胰岛素刺激的糖转运活动的减少。高糖降低了细胞内胰岛素受体底物 1(IRS1)的蛋白表达和它的酪氨酸磷酸化 ,而胰岛素受体底物 2 (IRS2 )蛋白表达呈明显的上调 ;对p85和PKB量无影响。 3T3 -L1脂肪细胞长期暴露到高浓度葡萄糖可以抑制糖的转运活动 ,诱导胰岛素抵抗。其作用机制与影响胰岛素信号肽的表达和酪氨酸磷酸化有关。     

代综方对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的作用研究

目的研究代综方(DZF)对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的作用及可能的调控机制。方法分化成熟的脂肪细胞给予不同浓度DZF或对照药物罗格列酮(Ros)干预48 h,检测培养上清中葡萄糖消耗量、甘油、游离脂肪酸(NEFA)浓度及胞内甘油三酯(TG)含量;应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测葡萄糖转运体4(GLUT-4)、脂滴包被蛋白(perilipin)、激素敏感性脂肪酶(HSL)的mRNA表达。结果 DZF使培养上清中葡萄糖消耗量增加(P<0.01)、甘油的浓度不同程度增加,但对NEFA无显著影响(P>0.05),DZF使胞内TG降低(P<0.01);对照组Ros增加葡萄糖消耗(P<0.01),增加胞内TG积累(P<0.05),对培养上清中甘油、NEFA无显著影响(P>0.05);DZF各组能不同程度上调GLUT-4、HSL的mRNA表达,显著下调Perilipin的mRNA表达(P<0.01);Ros能上调GLUT-4、HSL、Perilipin的mRNA表达。结论 DZF能促进脂肪细胞葡萄糖消耗和胞内TG分解,改善脂质合成与分解的动态平衡,其作用机制与Ros增加胞内TG积累不同。     

3T3-L1脂肪细胞与胰岛素抵抗脂肪细胞miRNAs表达谱的差异性分析

目的探讨正常3T3-L1脂肪细胞和胰岛素抵抗(IR)脂肪细胞微小RNA(miRNAs)的差异性表达,并进行初步分析。方法采用高糖(25 mmol/L葡萄糖)/高胰岛素液(1μmol/L)处理3T3-L1脂肪细胞24h,通过葡萄糖摄取实验判断IR脂肪细胞模型的建立;接着通过miRNA芯片技术,检测脂肪细胞和IR脂肪细胞中miRNAs的表达,并对其分析;随后借助生物信息学方法,对显著变化的2个miRNAs(miR-320和miR-21)寻找并筛检其可能调控的靶基因。结果共获得79个IR相关miRNAs(29个低表达,50个高表达,其中miR-320显著上调,miR-21显著下调),且筛选出与IR或糖尿病相关的靶基因共13个。结论获得了3T3-L1脂肪细胞和IR脂肪细胞miRNAs的差异性表达谱,为进一步研究这些miRNAs在IR和糖尿病的发病机制中的作用奠定了基础。     

血清淀粉样蛋白A在3T3-L1脂肪细胞的表达及其与胰岛素抵抗的关系

目的 了解血清淀粉样蛋白A(SAA)在3T3-L1脂肪细胞的表达情况及其与胰岛素抵抗的关系.方法 用3种不同浓度的地塞米松(10、100、1000nmol/L)建立3种不同程度的脂肪细胞胰岛素抵抗模型(分别称为模型组1、模型组2、模型组3),同时设立空白对照组.采用2-脱氧-3H-D-葡萄糖摄入法检测葡萄糖的摄入情况.以葡萄糖摄入减少的百分比反映胰岛素抵抗程度;RT-PCR技术检测各组SAAmRNA的表达,ELISA检测SAA蛋白的表达.结果 各组基础状态下葡萄糖的摄取率无明显差异(P>0.05);胰岛素刺激后模型组1、模型组2、模型组3的葡萄糖摄取率分别比对照组减少了15%(P<0.05)、40%(P<0.01)、55%(P<0.01);SAAmRNA的表达量分别是对照组的2.5(P<0.01)、3.33(p<0.01)、4.08倍(P<0.01);SAA蛋白表达量分别是对照组的2.05(P<0.05)、3.13(P<0.01)、4.23倍(P<0.01);相关分析显示3T3-L1脂肪细胞SAA mRNA的表达量(r=0.773,P<0.01)和蛋白表达量(r=0.832,P<0.01)与胰岛素抵抗程度均呈正相关.结论 采用地塞米松干预3T3-L1脂肪细胞可成功建立胰岛素抵抗模型;脂源性炎症因子SAA与胰岛素抵抗密切相关,它可能是胰岛素抵抗的一个标记物.     

罗格列酮改善胰岛素抵抗细胞摄取葡萄糖的途径研究

目的 探讨地塞米松和胰岛素联合作用诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗后,罗格列酮改善抗性细胞摄取葡萄糖的途径.方法 在地塞米松和胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗后,加入10-5 mol/L罗格列酮,作用48 h改善细胞抗性,提取细胞总RNA和总蛋白,Western blot显示葡萄糖转运子(GLUT4)丰度,RT-PCR检测GLUT4和信号分子c-Cbl 相关蛋白(c-Cbl associated protein,CAP)的基因表达.结果 ①罗格列酮显著增加了细胞GLUT4的转录水平和翻译水平,其表达丰度介于正常组与抵抗组之间.②罗格列酮提高了CAP基因水平,增强经CAP途径调节的GLUT4的转位.结论 罗格列酮可能通过启动其下游基因GLUT4和CAP基因表达,增加GLUT4的数目,并激活CAP信号途径,提高GLUT4向细胞膜的转位,改善细胞对葡萄糖的摄取,从而改善胰岛素抵抗.     

甘精、地特、人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响

目的探讨甘精、地特、人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响。方法体外培养3T3-L1脂肪细胞,诱导分化成熟后加入含有1nmol／L、10nmol／L、100nmol／L、1000nmol／L甘精、地特、人胰岛素的基础培养基培养24h,并设立基础培养基组为空白对照组,培养24h,RT-PCR方法检测脂肪细胞脂联素mRNA水平。结果100nmol／L、1000nmol／L甘精、地特、人胰岛素均抑制脂联素mRNA的表达中,1000nmol／L胰岛素的抑制作用强于100nmol／L胰岛素。地特胰岛素的抑制作用弱于人胰岛素及甘精胰岛素。甘精胰岛素的抑制作用弱于人胰岛素。结论高浓度甘精、地特、人胰岛素均不同程度抑制3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA的表达。     

MiRNA-27a对3T3-L1细胞胰岛素抵抗的作用及机制简

目的研究miRNA-27a对3T3-L1细胞葡萄糖摄取的影响,并初步探讨其作用机制。方法通过肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactoralpha,TNF-α）诱导建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的细胞模型,观察miRNA-27a对3T3-L1细胞葡萄糖摄取的影响,酶联免疫吸附（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELlSA）检测细胞培养上清中白细胞介素6（interleukin6,IL-6）的变化,Westernblot检测细胞内总Akt和磷酸化Akt的变化。结果miRNA-27a明显抑制3T3-L1细胞对胰岛素诱导的葡萄糖的摄取,miRNA-27a可促进炎症因子IL-6的产生并抑制Akt的磷酸化。结论miRNA-27a可促进脂肪细胞产生胰岛素抵抗,其作用可能通过抑制胰岛素信号通路P13K／Akt实现。     

葡萄糖和胰岛素对脂肪细胞内脂素表达的作用

 目的  观察脂肪细胞经不同浓度葡萄糖和胰岛素干预后内脂素表达的改变,探讨内脂素在糖尿病发病过程中的作用。 方法  培养3T3-L1前脂肪细胞,并诱导分化成成熟脂肪细胞。采用不同浓度葡萄糖、胰岛素孵育脂肪细胞48h,RT-PCR和western blot技术检测3T3-L1脂肪细胞中内脂素mRNA和蛋白的表达水平 结果  与对照组比较,随着葡萄糖浓度的增加,3T3-L1脂肪细胞内脂素mRNA和蛋白的表达量下降（P均＜0.05）;在不同浓度胰岛素作用下,3T3-L1脂肪细胞内脂素mRNA和蛋白的表达量改变无统计学意义（P＞0.05）。  结论  高糖状态可抑制体外培养的脂肪细胞内脂素的表达,胰岛素浓度的改变对内脂素表达无影响。     

胰岛素、地塞米松、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对3T3-L1脂肪细胞脂肪水孔蛋白表达的调节作用

目的通过细胞培养研究胰岛素样生长因子-1(IGF鄄1)、地塞米松对成熟脂肪细胞水孔蛋白(Aquaporinadipose,AQPap)基因表达的影响,并与胰岛素的作用相比较,以此了解AQPap基因表达的影响因素,探讨其在肥胖及糖尿病发病中所起作用。方法用不同浓度(10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)的胰岛素、IGF鄄1(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)及地塞米松刺激液(10-6、10-7、10-8mol/L)刺激诱导分化第9天的3T3鄄L1细胞6h;提取细胞RNA,运用半定量RT鄄PCR技术,检测AQPapmRNA表达量的变化。结果与对照组相比,10-9mol/L胰岛素刺激细胞6h可使AQPap基因表达下降16%,10-6mol/L胰岛素使之下降超过50%。IGF鄄1也降低AQPap的基因表达,但相同浓度(10-7mol/L)刺激下,IGF鄄1的作用要弱于胰岛素(P<0.05)。地塞米松对AQPapmRNA的表达量无明显影响,不过,同时给予10-6mol/L的地塞米松和胰岛素与单用10-6mol/L胰岛素相比,AQPapmRNA的表达量有所上升(P<0.05)。结论胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap的表达起抑制作用,并呈剂量及时间依赖性。IGF鄄1也有抑制作用,但较胰岛素弱。地塞米松能够拮抗胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap基因表达的下调作用。     

柚皮素对3T3-L1和HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖摄取能力和胰岛素敏感性的影响

目的 探讨柚皮素(Naringenin,Nar)对3T3-L1和HepG2细胞胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)模型葡萄糖摄取能力和胰岛素敏感性的影响.方法 采用含0.5 mM IBMX、1μM地塞米松、10 mg/L胰岛素的诱导液将3T3-L1细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,采用高糖/高胰岛素诱导建立3T3-L1和HepG2细胞IR模型;按照空白组、正常组、IR模型组、对照药物IR组以及不同浓度Nar干预IR组;以M T T法检测细胞增殖;以葡萄糖氧化酶法(GOD)检测细胞对葡萄糖的摄取量.结果 与正常组细胞相比,3T3-L1和HepG2 IR模型组细胞增殖受到抑制、葡萄糖摄取量减少以及对胰岛素敏感性减弱(P<0.001);Nar干预IR模型组能明显促进IR细胞的增殖,增加IR细胞的葡萄糖摄取和增强对胰岛素的敏感性(P<0.001).结论 Nar对3T3-L1和HepG2细胞IR模型葡萄糖摄取能力降低和胰岛素敏感性改变有改善作用,可以作为防治IR的一种手段.     

促酰化蛋白对3T3-L1脂肪细胞炎性反应的影响

目的 观察3T3-L1成熟脂肪细胞胰岛素抵抗状态下促酰化蛋白(acylation stimulating protein,ASP)对炎性因子(IL-6、MCP-1、MIP-1α和TNF-α)分泌水平以及炎性信号因子(JNK1、IKKβ)蛋白表达的影响。 方法 3T3-L1成熟脂肪细胞分别给予不同浓度(0、0.125、0.5、1.0mmol/L)油酸(C18∶ 1)或棕榈酸(C16∶ 0)温育过夜,诱导胰岛素抵抗,在此基础上给予ASP刺激,用ELISA测定IL-6、MCP-1、 MIP-1α和TNF-α 4种细胞炎性因子的分泌水平,采用Western blot法检测JNK1和KKβ蛋白表达。 结果 油酸诱导的胰岛素抵抗下,ASP刺激的脂肪细胞IL-6和MCP-1的分泌水平轻度下调,但差异无统计学意义;而ASP刺激的脂肪细胞MIP-1α和TNF-α的分泌水平显著下降,MIP-1α和TNF-α的分泌分别下调57%(P<0.05)和48%(P<0.05)(1.0mmol/L油酸组)。棕榈酸诱导的胰岛素抵抗下,ASP刺激的脂肪细胞IL-6分泌水平呈下降趋势,最大下调50% IL-6(P<0.05);22% MCP-1(P>0.05),35% MIP-1α(P>0.05)和38%TNF-α(P>0.05)的分泌。高浓度(1.0mmol/L) 油酸和棕榈酸诱导的脂肪细胞胰岛素抵抗状态下,ASP刺激的炎性信号蛋白JNK1蛋白表达显著下调,分别为34%(P<0.05)和54%(P<0.01)。但IKKβ蛋白表达差异无统计学意义。 结论 在脂肪酸诱导的脂肪细胞胰岛素抵抗状态下,ASP在一定程度上调节炎性因子分泌,参与调节JNK、IKK/NF-κB信号通路中重要信号分子的功能,ASP参与了脂肪细胞脂毒性-炎性反应的调控。