THP-1单核细胞氧化低密度脂蛋白过程中基因表达谱的改变

目的检测与巨噬细胞氧化低密度脂蛋白可能相关的信号传导相关蛋白基因。方法利用低密度脂蛋白作用人单核细胞系THP-1,通过基因芯片分析人信号相关蛋白的表达谱,期望获得阐明氧化机制的有价值的线索。结果在被检测的1 651个基因中,13个基因的表达变化超过了2倍以上,其中9个基因表达增加,4个基因表达减少。在表达增加的基因中,有2个基因已在新近的报道中被认为可能与动脉粥样硬化相关。结论我们的发现可能为揭示巨噬细胞氧化低密度脂蛋白的机制提供全新的思路。     

BCG-PPD、H37Rv-PPD诱导入巨噬细胞死亡及TNF-α、IL-1β和IL-10的表达差异

目的 本实验对不同毒力结核杆菌的衍生蛋白(PPD)对人巨噬细胞(THP-1)的影响及其与TNF-αt、IL-1 β及IL-10的差异性进行研究.方法 用H37Rv-PPD和BCG-PPD分别在3 h、8 h、15 h及24 h四个时间点刺激分化成熟的THP-1细胞,再应用Hochest染色法,荧光镜下观察细胞的转归差异(凋亡及坏死情况),同时取上清用ELISA法测TNF-α、IL-1β及IL-10的浓度.结果 BCG-PPD刺激下细胞核以椭圆凋亡小体多见,而H37Rv-PPD刺激下细胞核则多呈坏死状,以坏死多见;BCG-PPD刺激下上清中TNF-α及IL-10的表达量低于H37Rv-PPD刺激组,但BCG-PPD刺激下IL-1β的表达量却高于后者.结论 提示高毒力菌株衍生蛋白(H37Rv-PPD)引起THP-1坏死的原因可能与TNF-α的过度表达有关,而凋亡少见可能与IL-10抑制凋亡作用有关,而低毒力菌株衍生蛋白诱导凋亡与IL-1β有关.可能菌株毒力差异就存在于菌株的蛋白成分之中,且与上述几种细胞因子密切相关.     

活血化瘀中药对内毒素诱导THP-1细胞增殖及蛋白质组的影响

目的：通过内毒素诱导的炎症细胞模型,筛选抗炎活血化瘀中药单体,并探讨蛋白质表达谱.方法：用LPS诱导THP-1细胞株增殖和产生TNF-α,作为内毒素诱导的炎症细胞模型.以此筛选活血化瘀中药单体抗炎成分,用双向电泳技术,分析差异蛋白点.结果：通过筛选活血化瘀中药单体发现丹参酮ⅡA对内毒素诱导的炎症细胞模型有明显抑制作用,双向电泳图象分析筛选出差异性明显的蛋白质点26个.模型组有16个蛋白点增高,丹参酮ⅡA组能下调13个蛋白点（占50%）,有3个蛋白点进一步上调（占11.5%）;在模型组下调表达的10个蛋白点（占38.5%）,丹参酮ⅡA组均有不同程度上调趋势.结论：内毒素感染的细胞模型适合实验室小剂量中药单体的筛选,丹参酮ⅡA的抗炎作用与这些差异表达蛋白质有关,能够改善一些蛋白质的表达.     

肺炎嗜衣原体CPAF诱导THP-1细胞产生前炎症细胞因子和凋亡

目的 研究肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)衣原体蛋白酶样活性因子(Chlamydial protease-like activity factor,CPAF)能否在体外诱导人单核细胞THP-1产生前炎症细胞因子和凋亡,为进一步探索Cpn感染宿主致病的分子机制提供实验依据.方法 将Cpn CPAF全基因克隆于pGEX6p-2载体上,在大肠杆菌(E coli)中诱导表达重组蛋白,经去内毒素纯化柱和琼脂糖凝胶FF获得纯化且无脂多糖(LPS)污染的重组蛋白GST-CPAF.以不同浓度的该蛋白作用于THP-1,ELISA检测TNF-α吨和IL-6水平.MTT法检测经该蛋白处理后THP-1的增生或抑制作用,用Hoechst33258荧光染色、DNA片段化分析、Armexin V-FITC-PI染色法检测细胞凋亡情况.结果 制备的莺组蛋白GST-CPAF以时间和剂量依赖方式刺激THP-1分泌TNF-α和IL-6,并以剂量依赖方式抑制THP-1增殖;当GST-CPAF刺激THP-1细胞24 h后,能诱导细胞调亡.结论 制备的Cpn重组蛋白GST-CPAF能诱导THP-1产生前炎症细胞因子和凋亡,可能是Cpn致病机制中的一个因素.     

NADPH氧化酶在TNF-α诱导HUVEC HO-1表达中的作用

目的探讨NADPH氧化酶来源的活性氧(ROS)在TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血红素氧化酶1(HO-1)表达中的作用。方法用小分子RNA干扰(siRNA)技术消除HUVEC的NADPH氧化酶p47phox亚基,用分子探针2,7-DCF测定细胞内ROS的产生量以及用RT-PCR测定HO-1 mRNA的表达。结果TNF-α(200 U/mL)作用24 h后,HUVEC中ROS的产生量增加了138%,细胞内HO-1 mRNA表达较对照组增加146.5%;转染p47phoxsiRNA后,细胞内NADPH氧化酶p47phox亚基的mRNA表达消失,ROS的产生量降低至对照组水平,而HO-1 mRNA的表达水平降低约54%。结论TNF-α刺激后,HUVEC内产生的ROS主要来源于NADPH氧化酶的活化,但ROS仅部分介导了TNF-α对HO-1基因表达的诱导作用。     

DMT-1在介导低密度脂蛋白氧化中的作用

目的 通过基因芯片分析发现人单核细胞THP-1氧化LDL的过程中二价金属转运蛋白1(Divalent metal transporter 1,DMT1)的mRNA表达水平显著升高.本实验通过RT-PCR和Western Blot来验证基因芯片的结果.方法用空白,LPS,LDL分别处理THP-1细胞,应用RT-PCR和Western Blot比较在LDL和LPS处理后THP-1细胞DMT-1的表达情况.结果 RT-PCR和Western Blot结果显示,在THP-1氧化LDL的过程中DMT1的表达显著升高.LDL和LPS相比,用LDL处理的THP-1细胞的DMT1的表达增加较LPS处理的明显.结论 RT-PCR和western blot证明了基因芯片的结果,在THP-1氧化LDL的过程中DMT1的表达显著升高,为临床心血管疾病的抗氧化治疗提供新的思路.     

熊果酸对THP-1细胞HMGB1表达和NF-kB活性的影响

目的 研究熊果酸(UA)对人单核细胞系THP-1细胞HMGB1表达和NF-kB活性的影响.方法 用不同浓度的UA(0、0.1、1、5和10 μmol/L)作用细胞后进行如下检测:1)MTr检测细胞增殖;2)RT-PCR法检测HMGB1和P65 mRNA表达;3)Western blot检测HMGB1和P65蛋白的表达;4)荧光素酶报告基因转染,质粒pNF-kB-luc瞬时转染THP-1细胞,转染40h后加1μmol/L UA作用,于转染48 h后进行荧光素酶活性测定.结果 1)随着UA浓度的增高,可明显抑制THP-1细胞的增殖;2)不同浓度的UA对THP-1细胞HMGBl mRNA和蛋白表达,呈现出一定的双向性,且以l μmol/L UA作用最强(P ＜0.05);3)UA可增强P65 mRNA和蛋白表达以及NF-kB活性.结论 UA可影响单核细胞HMGB1表达和NF-kB活性.     

人巨细胞病毒感染THP-1源性巨噬细胞对IL-1β表达的影响

目的 观察HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后,促炎细胞因子IL-1β表达的时序性变化.方法 构建HCMV感染THP-1源性巨噬细胞模型,设立HCMV AD169标准毒株感染组、模拟感染对照组、LPS+ATP对照组和poly(dA:dT)对照组.用ELISA法测定THP-1源性巨噬细胞培养上清IL-1β水平在病毒感染细胞后lh、3h、6h、12h、24 h和48 h的时序性变化.分别用real-time PCR和western blot检测感染后6 h IL-1β基因和蛋白的表达水平.结果 HCMV感染THP-1源性巨噬细胞6h后,促炎细胞因子IL-1β基因的相对表达量是模拟感染组的7.77倍.HCMV感染THP-1源性巨噬细胞1h后,细胞上清IL-1β表达量逐渐显著增高,感染后3h和6h继续升高,感染后12h达到高峰,一直持续到48 h.HCMV感染THP-1源性巨噬细胞6h HCMV感染组IL-1β蛋白表达明显高于模拟感染对照组和poly(dA:dT)对照组,而与LPS+ATP对照组比较无统计学差异.结论 HCMV感染THP-1源性巨噬细胞可诱导IL-1β高表达,且呈时序性增高趋势.     

Advanced glycation end product Nε‐carboxymethyllysine induces endothelial cell injury: the involvement of SHP‐1‐regulated VEGFR‐2 dephosphorylation

N^ε‐carboxymethyllysine (CML), a major advanced glycation end product, plays a crucial role in diabetes‐induced vascular injury. The roles of protein tyrosine phosphatases and vascular endothelial growth factor (VEGF) receptors in CML‐related endothelial cell injury are still unclear. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) are a commonly used human EC type. Here, we tested the hypothesis that NADPH oxidase/reactive oxygen species (ROS)‐mediated SH2 domain‐containing tyrosine phosphatase‐1 (SHP‐1) activation by CML inhibits the VEGF receptor‐2 (VEGFR‐2, KDR/Flk‐1) activation, resulting in HUVEC injury. CML significantly inhibited cell proliferation and induced apoptosis and reduced VEGFR‐2 activation in parallel with the increased SHP‐1 protein expression and activity in HUVECs. Adding recombinant VEGF increased forward biological effects, which were attenuated by CML. The effects of CML on HUVECs were abolished by SHP‐1 siRNA transfection. Exposure of HUVECs to CML also remarkably escalated the integration of SHP‐1 with VEGFR‐2. Consistently, SHP‐1 siRNA transfection and pharmacological inhibitors could block this interaction and elevating [³H]thymidine incorporation. CML also markedly activated the NADPH oxidase and ROS production. The CML‐increased SHP‐1 activity in HUVECs was effectively attenuated by antioxidants. Moreover, the immunohistochemical staining of SHP‐1 and CML was increased, but phospho‐VEGFR‐2 staining was decreased in the aortic endothelium of streptozotocin‐induced and high‐fat diet‐induced diabetic mice. We conclude that a pathway of tyrosine phosphatase SHP‐1‐regulated VEGFR‐2 dephosphorylation through NADPH oxidase‐derived ROS is involved in the CML‐triggered endothelial cell dysfunction/injury. These findings suggest new insights into the development of therapeutic approaches to reduce diabetic vascular complications. Copyright © 2013 Pathological Society of Great Britain and Ireland. Published by John Wiley & Sons, Ltd.     

钙离子对重组创伤弧菌溶细胞素诱导THP-1细胞损伤的影响机制

目的 研究重组创伤弧菌溶细胞素( rVvhA)诱导人单核细胞白血病细胞(THP-1)的凋亡机制及其Ca2+的变化.方法 采用CCK-8法、激光共聚焦显微镜结合Fluo 3/AM法、流式细胞术结合AnnexinV -PI标记等检测rVvhA对THP-1细胞的影响,并观察胞内Ca2+浓度变化.结 果rVvhA可诱导THP-1细胞发生凋亡并引起细胞内Ca2+浓度升高,细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM处理组胞内钙离子升高幅度远高于细胞外钙离子螯合剂EGTA处理组.结论 rVvhA具有诱导THP-1细胞凋亡的生物学活性,并能引起细胞内Ca2+浓度升高,升高的Ca2+主要源于胞外钙离子内流.     

熊果酸对单核细胞白血病细胞作用机制的初步研究

目的 探讨熊果酸在体外对单核细胞白血病细胞株THP-1（human acute monocytic leukemia cell line）的增殖抑制和杀伤机制。方法 采用MTT法和流式细胞术检测熊果酸对THP-1细胞的增殖抑制和杀伤效应．hoechst33258荧光染色观察DNA片段化。结果 熊果酸对THP-1细胞具有增殖抑制和杀伤效应，并呈浓度和时间依赖性。在熊果酸作用下THP-1细胞DNA受损，出现凋亡征象，G1期细胞数减少，细胞主要阻滞在S期。结论 熊果酸在体外能诱导THP-1细胞凋亡。     

Distinct Cytokine Release Profiles from Human Endothelial and THP-1 Macrophage-like Cells Exposed to Different Amphotericin B Formulations

Amphotericin B(AmB) formulations, Fungizone, and Amphotec caused substantially greater proinflammatory cytokine release than AmBisome (L-AMB) and Abelcet in TPA differentiated THP-1 macrophages as determined by antibody based protein arrays. Lipopolysaccharide but not AmB induced significant pro-inflammatory cytokines in human endothelial cells.     

NADPH氧化酶NOX家族的组织分布及生理功能

NADPH 氧化酶特异存在于吞噬细胞质膜，能生成用于清除病原微生物的活性氧(reactive oxygen species, ROS)。最近发现吞噬细胞NADPH氧化酶的6个同源物即NOX1, NOX3, NOX4, NOX5, DUOX1, DUOX2。NADPH 氧化酶催化亚基gp91phox/NOX2及其同源物统称为NOX家族蛋白。这些酶能通过质膜传递电子产生活性氧(ROS)。NOX家族不同成员的激活机制及分布是不同的。NOX激活多条信号转导通路，调节细胞的生长、增殖、分化等，NOX缺陷会导致免疫抑制，如DUOX2突变可以导致甲状腺功能减低症。     

IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号通路调节研究

目的 研究IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号调节通路,探索DC -SIGN表达的信号调控网络.方法 以佛波脂(PMA)刺激THP-1细胞24h后加入IL-4作用48 h诱导DC-SIGN的表达,并设ERK阻断剂、NF-κB阻断剂、JAK-STAT阻断剂和MAPK阻断剂处理组.用RT-PCR检测DC-SIGN的mRNA表达,Western blot检测胞质内DC-SIGN蛋白的表达,流式细胞术检测细胞表面DC-SIGN的表达.另外,提取IL-4诱导0、10、20、30、60和120 min的THP-1细胞胞质和胞核蛋白,Western blot检测不同信号通路的信号蛋白及其磷酸化蛋白的变化.结果 IL-4可以大幅提高DC-SIGN在THP-1细胞上的表达,包括mRNA和胞膜蛋白水平.在mRNA、胞质和细胞表面蛋白表达3个水平上,ERK通路阻断剂阻断效果最好,几乎完全阻断了IL-4的诱导效果,JAK-STAT和NF-κB通路阻断剂具有部分阻断效果,而p38通路阻断剂无阻断效果.信号蛋白检测结果显示,IL-4诱导0～120 min内,胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65、NF-κBp50、磷酸化IKB和磷酸化AKT随时间推移浓度逐渐升高,而p38MAPK及其磷酸化蛋白浓度无明显改变.胞核内胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65和NF-κBp50随时间推移浓度逐渐升高.结论 ERK、JAK-STAT和NF-κB通路参与了DC-SIGN启动子的活化,其中以ERK通路为主.     

NF-κB信号通路介导AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞表达MMP-9

目的：探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导人单核/巨噬细胞（THP-1细胞）基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的机制。方法:用0.1μmol/L佛波酯（PMA）作用48h,诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞后,随机分为4组：（1）PMA组,即对照组;（2）PMA+AngⅡ组（10-7mol/L,1h）;（3）PMA+AngⅡ+2-硫代氨基甲酸吡咯烷组［PDTC（10μmol/L,30min）］;（4）PDTC组。用Westernblotting蛋白印记技术分别检测总蛋白MMP-9及磷酸化核转录因子-κBp65（NF-κBp65）的变化,用RT-PCR检测MMP-9mRNA表达的变化。结果:与对照组相比,AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞磷酸化NF-κBp65增加（1.02±0.10,P<0.05）,MMP-9蛋白量也增加（1.06±0.11,P<0.05）,MMP-9mRNA表达上调（1.22±0.08,P<0.05）,而使用NF-κB的抑制剂PDTC后磷酸化NF-κBp65（0.99±0.12,P<0.01）减少,MMP-9表达明显受到抑制（1.04±0.14,P<0.01）,MMP-9mRNA表达下调（0.90±0.06,P<0.01）。结论:NF-κB信号转导途径是AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞表达MMP-9的重要途径之一。     

miR-146a对THP-1细胞靶基因AUF1调控及细胞因子表达的影响

目的探讨miR-146a对人急性单核白血病细胞系(THP-1)靶基因AU碱基富集区结合降解因子1(AUF1)表达的调控及细胞因子表达的影响。方法构建miR-146a过表达及抑制表达慢病毒载体并转染THP-1细胞,以正常培养的THP-1细胞为对照。用实时定量PCR法检测THP-1细胞AUF1 mRNA表达;蛋白质印迹法检测THP-1细胞AUF1蛋白的表达;酶联免疫吸附试验检测THP-1细胞培养基上清液白细胞介素-8(IL-8)及白细胞介素-35(IL-35)浓度。结果过表达miR-146a,可导致THP-1细胞AUF1 mRNA及蛋白表达下调(P0.01,P0.05);THP-1细胞上清液IL-8及IL-35浓度降低(P0.01,P0.05)。抑制miR-146a表达,导致THP-1细胞上清液IL-8及IL-35浓度明显增高(P0.01,P0.01)。结论 AUF1是miR-146a的靶基因。miR-146a可以调控THP-1细胞上清液IL-8、IL-35浓度。IL-8的改变引起相应IL-35的改变,一起参与炎性反应。     

Expression of S100 family proteins in neonatal rats with sepsis and its significance

Objective: This study aims to study the expression changes of S100 family proteins in neonatal rats with sepsis and investigate the effect and significance of S100 family proteins in pathogenesis and development of sepsis. Methods: The functions of S100 family proteins were analyzed with bioinformatics. The immune-associated proteins were chosen as the candidate proteins. Twenty neonatal SPF SD rats were randomly divided into two groups: sepsis model group and control group. The liver sample was stained with HE to evaluate the establishment of sepsis model. The expression amount of proinflammatory factor IL-1, IL-6 and TNF-α was detected with ELISA. The expression changes of S100A8, S100A9, S100A11 and S100A12 in sepsis model rats were detected with real-time PCR and Western blotting. After shRNA plasmid was transfected into THP-1 cells and the expression of S100A12 was silenced, the expression changes of proinflammatory factor IL-1, IL-6 and TNF-α in LPS-induced inflammation were studied in order to investigate the S100A12 mediated inflammatory process. Results: IL-1, IL-6 and TNF-α in the serum of rats with sepsis induced by LPS were 55.79 ± 3.80 ng/l, 48.76 ± 1.03 ng/l and 29.98 ± 2.27 ng/l respectively. S100A8, S100A9, S100A11 and S100A12 detected with real-time PCR in sepsis model group were 14.4 ± 1.37, 10.23 ± 1.81, 5.5 ± 1.64 and 9.97 ± 1.82 respectively. Compared with the control group, S100A8, S100A9, and S100A12 were significantly up-regulated. The shRNA silenced the expression of S100A12 which reduced the expression of proinflammatory factors after LPS stimulated the cells (P < 0.05). Conclusion: Compared with the control group, S100A8, S100A9, and S100A12 were significantly up-regulated in rat sepsis model group. After the expression of S100A12 in propylene glycol monomethyl ether acetate (PMA) induced human macrophages was silenced, the expression of proinflammatory factor IL-1, IL-6 and TNF-α was down-regulated.     

溶血磷脂酸对基质金属蛋白酶-9表达及活性的影响

目的观察溶血磷脂酸（Lysophosphatidie Acid,LPA）对人单核细胞株THP-1细胞基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9）表达及活性和NF-κB p65表达活性的影响,探讨MMP-9在LPA致动脉粥样硬化中的作用及机制。方法以不同浓度水平LPA（0-10μmol/L）刺激人THP-1细胞4h,RT-PCR法测定MMP-9mRNA表达,酶谱法检测MMP-9活性,westernblot检测核蛋白NF-κB p65表达变化。结果随着LPA剂量的增加,MMP-9表达及活性,核蛋白NF-κB p65表达逐渐增强,在LPA1μmol/L时达到最高点,然后逐渐减弱,LPA以剂量依赖的方式激活NF-κB,上调THP-1细胞MMP-9表达,增加MMP-9活性。结论LPA可能通过激活NF-κB,在转录水平促进THP-1细胞MMP-9mRNA表达,并增强其活性,促进粥样硬化发生和发展。     

机械牵张诱导THP-1细胞高迁移率族蛋白B1移位出核

目的:探讨机械牵张对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在THP-1细胞内移位的影响。方法:构建HMGB1－增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的真核表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合蛋白的形式克隆到pcDNA3-HA载体上,随后转染THP-1细胞并施加机械牵张应变,荧光显微镜观察HMGB1在细胞内的表达及移位情况。结果:重组质粒经酶切鉴定证明构建正确,并在THP-1细胞中大量表达。荧光显微镜观察发现,HMGB1-EGFP融合蛋白主要分布于细胞核,经机械牵张18h,可见细胞中融合蛋白从细胞核移位到细胞质,在细胞浆中观察到明显的绿色荧光。结论:成功构建了HMGB1-EGFP融合蛋白,在THP-1细胞中观察到机械牵张可诱导HMGB1移位出核。