相对定量RT-PCR法中内对照基因表达水平的稳定性及其应用评价

目的评价相对定量RT-PCR方法中不同内对照基因表达水平的稳定性及其对靶基因预后判断的影响程度。方法以36例食管癌患者为例,收集其手术前（B-1）、手术刚结束时（B0）和术后第三天（B＋3）的外周血样品。利用实时定量RT-PCR技术,分别检测内对照基因Beta-actin和GAPDH在不同时间的表达水平,并以CEA mRNA作为靶基因,比较基于这两种内对照得出的靶基因相对定量结果用于患者预后判断的差异;标准化的绝对定量结果被作为＂预后判断的参照标准＂。结果在三个取样时间点,两种内对照基因表达水平的标准偏差依次分别为Beta-actin mR-NA：1.44,1.56和1.92;GAPDH mRNA：3.16,3.28和4.04;两者的总体变异程度分别为9.9%和17.3%。术后一年的复发结果表明,绝对定量法和基于Beta-actin mRNA的相对定量法在预后判断中能够得到一致的结果,而GAPDH mRNA的相对定量结果与复发之间未显示统计学意义的相关性（P〉0.05）。结论相对定量RT-PCR法中内对照基因表达水平的变异程度低于10%时,才能保证内对照的有效性以及靶基因测定结果的可比性。基因表达研究时应对所用的内对照基因表达稳定性进行前期评估。     

COVID-19 mRNA vaccines: Platforms and current developments

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腓肠肌肌球蛋白收缩功能在有氧训练后的变化

背景:已有实验证实长期耐力训练能导致肌纤维及其肌球蛋白重链异形体由快型向慢型转变,但对于运动训练中肌球蛋白重链异形体mRNA的变化仍有待进一步的实验观察与验证。目的:观察跑台训练对雄性SD大鼠腓肠肌肌球蛋白收缩功能的影响。设计:随机对照动物实验。单位:西安交通大学医学实验中心。材料:选用40只生后7周雄性SD大鼠,体质量(230±16)g,所有动物实验前均未进行过跑台运动。试剂:一抗为鼠源性抗骨骼肌肌动蛋白及快缩型肌球蛋白重链(MHCⅡ)单克隆抗体,ABCam产品。二抗为偶合碱性磷酸酶的抗鼠IgG,SIGMA产品。方法:实验于2005-03/10在西安交通大学医学实验中心完成。随机摸球法将大鼠分为对照组(n=10)和训练组(n=30)。训练组大鼠进行连续4～6周强度约为75%VO2max(18.5～24m/min,坡度为0°)的跑台训练,50min/次,2次/d。对照组自由活动,不给予任何干预措施。训练至4,5,6周,分别取10只大鼠,采用反转录聚合酶链式反应腓肠肌肌球蛋白重链mRNA含量,以免疫组化方法检测肌球蛋白肌纤维的改变情况及横截面积的大小,大鼠麻醉后游离腓肠肌,采用张力传感器及电刺激器给予方波脉冲刺激,逐步拉伸腓肠肌至等长收缩张力为最大时的肌肉初长Lmax位置,平衡10min,记录肌肉长度与张力。取右侧腓肠肌称量湿质量,计算其与体质量之比。肌肉质量与体质量之比按下式计算:肌肉质量(mg)/体质量(g)×100%。主要观察指标:①腓肠肌肌球蛋白重链mRNA含量。②肌球蛋白肌纤维的改变情况及横截面积的大小。③大鼠体质量与腓肠肌质量的变化。④腓肠肌等长收缩最大张力。结果:纳入大鼠40只全部进入结果分析。①腓肠肌肌球蛋白重链mRNA含量:经过4周耐力训练,训练组肌球蛋白总肌球蛋白重链表达是对照组的105%(P<0.01),肌球蛋白重链Ⅱa表达量高于对照组(1.27±0.08,1.17±0.06,P<0.05),肌球蛋白重链ⅡxmRNA表达量高于对照组(1.29±0.04,1.19±0.05,P<0.01)。②肌球蛋白肌纤维的改变情况及横截面积的大小:经过4～6周的有氧训练后,大鼠肌球蛋白重链主要以Ⅱ型慢缩型肌纤维表达为主,而Ⅰ型快缩型肌纤维表达较少。对照组大鼠腓肠肌Ⅰ、Ⅱ型肌纤维横截面积分别为(1958.0±30.5),(1656.1±35.3)mm2。而训练组4周后Ⅰ、Ⅱ型肌纤维横截面积较对照组分别增加24.5%与22.1%(P<0.01);训练组5周后分别增加26.4%与51.5%(P<0.01),训练组训练6周后分别增加33.2%与48.9%(P<0.01)。③大鼠体质量与腓肠肌质量的变化:训练组大鼠训练4,5,6周腓肠肌湿质量分别为(135.6±3.1),(139.2±5.1),(148.4±6.2)mg,高于对照组[(103.2±3.4),(87.5±2.9),(68.3±3.3)mg,P<0.01]。训练组大鼠训练4,5,6周腓肠肌相对湿质量分别为(0.55±0.01),(0.56±0.02),(0.59±0.03),高于对照组[(0.43±0.02),(0.37±0.04),(0.29±0.05),P<0.05～0.01]。④腓肠肌等长收缩最大张力:方波脉冲刺激后6周训练组等长收缩最大张力较对照组显著增加(P<0.01)。结论:短期耐力训练后,肌球蛋白重链中的两种慢型肌球蛋白重链异形体-肌球蛋白重链Ⅱx、肌球蛋白重链Ⅱb基因表达增加,肌纤维横截面积增加,等长收缩最大张力增加,表明有氧训练对提高肌球蛋白收缩功能有促进作用。     

RNA干扰技术及应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的细胞内双链mRNA特异性降解现象,属于转录后的基因沉默机制.RNAi是生物界普遍存在的抵抗病毒入侵、调控基因表达的监控机制.目前已成功用于基因功能和信号转导的研究,在基因治疗方面也显现出良好前景.     

急性等容血液稀释对胃癌患者外周血IL-2、IL-10及其mRNA表达的影响

目的观察急性等容血液稀释(ANH)前后对胃癌患者外周血细胞因子白细胞介素(IL)-2、IL-10及其mRNA表达的影响。方法择期全麻下行胃癌根治术患者24名,ASAⅠ级或Ⅱ级,随机分为2组:ANH组和对照组,每组12例。ANH组在全麻诱导后行ANH,对照组未行ANH。分别于麻醉诱导后切皮前(T1)、术后1 h(T2)、24 h(T3)取静脉血检测细胞因子IL-2和IL-10的血浆浓度及其mRNA表达。结果 2组比较,ANH组IL-2、IL-2mRNA、IL-2/IL-10比值和IL-2 mRNA/IL-10 mRNA比值于T2—3均明显高于对照组,而IL-10浓度、IL-10 mRNA于T2明显低于对照组(P<0.05)。结论急性等容血液稀释自体血回输更有利于改善细胞免疫功能,有利于患者预后。     

威灵仙干预体外培养兔膝关节软骨细胞增殖及转化生长因子β1 mRNA基因的表达

背景:有研究显示,威灵仙能够维持和促进软骨细胞合成蛋白多糖与Ⅱ型胶原,并可能通过抑制自细胞介素1水平的增高保护关节软骨,延缓骨关节炎的发展.目的:在以往研究基础上,观察中药威灵仙对体外培养兔膝关节软骨细胞增殖及转化生长因子β1 mRNA基因表达的影响,探讨其治疗骨关节炎的作用及可能机制.方法:取新西兰白兔膝关节软骨,剪碎后,采用酶消化法原代分离培养软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定后,取处于对数生长期第3代细胞随机分组,实验组分别加入0.01,0.05,0.1,0.5,1.0 g/L威灵仙培养基,对照组仅加入普通培养基进行培养.倒置显微镜下观察原代培养的软骨细胞形态变化及甲苯胺蓝染色鉴定,MTT法检测不同质量浓度威灵仙对软骨细胞增殖影响,RT-PCR法检测转化生长因子β1 mRNA表达.结果与结论:原代软骨细胞呈圆球形,悬浮状态,24 h后大部分细胞贴壁;传代后软骨细胞生长速度加快,融合成片,外观呈典型"铺路石"状;传4代后逐渐出现长梭形软骨细胞,传代培养至6代时,呈成纤维细胞样外观,生长速度明显减慢,传代周期延长.软骨细胞经甲苯胺蓝染色后细胞外基质可见蓝色异染颗粒,细胞核染成深蓝色.不同质量浓度威灵仙均能促进软骨细胞增殖,尤以0.5 g/L增殖效果明显,且增殖高峰出现在威灵仙干预后的第3天.0.05,0.1,0.5,1.0 g/L威灵仙均能促进软骨细胞转化生长因子β1 mRNA表达,4组组间比较差异无显著性意义(P＞0.05),但作用的高峰为0.5g/L组.威灵仙能促进软骨细胞增殖及转化生长因子β1 mRNA的表达,提示这可能是其治疗骨关节炎的作用及可能机制之一.     

胃癌组织中β-catenin mRNA表达水平及临床意义

目的:检测胃癌组织标本β-catenin mRNA表达水平,并探讨其临床意义.方法:以β-actin为内参照,采用实时荧光定量PCR技术检测45例胃癌患者术后胃癌组织标本、肿瘤边缘5 cm外的正常组织β-catenin基因mRNA的表达水平,并进行比较.结果:胃癌患者术后胃癌组织标本β-catenin mRNA表达水平较正常组织标本高(P<0.01);肠型胃癌β-catenin mRNA表达水平高于弥漫型胃癌(P<0.05);TNM分期早期胃癌β-catenin mRNA表达水平低于晚期(P<0.05);淋巴结有转移者高于无转移者(P<0.01),且与浸润深度相关(P<0.01);胃癌β-catenin mRNA表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小及分化程度无关.结论:β-catenin mRNA在胃癌组织中呈高表达,是评价疾病发生、发展的良好指标.     

参芎滴丸与环磷酰胺对MCAO模型大鼠脑梗死组织TNF-α mRNA表达的影响

目的:通过分析炎性细胞因子TNF-α mRNA的变化,探讨参芎滴丸与环磷酰胺对急性脑梗死炎性反应的影响。方法:用电凝法闭塞大鼠大脑中动脉制成大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,于造模后12、48、72h三个不同时点处死大鼠,取梗死区脑组织备用,采用RT-PCR方法观察不同剂量参芎滴丸与环磷酰胺对缺血大鼠脑组织TNF-α mRNA表达的影响。结果:模型组大鼠TNF-αmRNA表达明显升高,与正常组、假手术组比较差异有显著性(P&lt;0.05);参芎滴丸低(5倍)、中(10倍)、高(20倍)三个剂量组、环磷酰胺组梗死后24、48、72h三个不同时点TNF-αmRNA的表达明显下降,与模型组比较差异有显著性(P&lt;0.05);不同剂量组之间差异有显著性(P&lt;0.05),呈现量效关系;高剂量参芎滴丸的作用强度与环磷酰胺相似。结论:参芎滴丸与环磷酰胺均能显著抑制MCAO模型大鼠TNF-α mRNA表达,进而抑制梗死早期的炎性反应,高剂量参芎滴丸的作用强度与环磷酰胺相似。     

宫颈鳞状细胞癌组织PAR-1基因mRNA的表达及临床意义

目的探讨宫颈鳞状细胞癌（SCC）组织蛋白酶活化受体-1（PAR-1）基因mRNA的表达与临床意义。方法采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测49例宫颈鳞状细胞癌组织中PAR-1基因mRNA的表达情况。结果不同病理分级的宫颈鳞状细胞癌中PAR-1的表达率：Ⅰ级31.3%,Ⅱ级42.1%,Ⅲ级50%,各组之间比较差异无显著性意义（P〉0.05）。PAR-1 mRNA在宫颈鳞状细胞癌中的表达率：Ⅰ期40%,Ⅱ期35%,Ⅲ期42.9%,各组之间比较差异无显著性意义（P〉0.05）。PAR-1 mRNA在无淋巴结转移的宫颈鳞状细胞癌中的表达率为28.6%,在有淋巴结转移的宫颈鳞状细胞癌中的表达率为71.4%,差异有显著性意义（P〈0.01）。结论PAR-1mRNA表达增高可能参与宫颈鳞状细胞癌的转移和侵袭过程。     

精神分裂症外周血淋巴细胞多巴胺D1受体基因mRNA表达探索

目的 探讨首发精神分裂症患者外周血淋巴细胞多巴胺D1受体基因mRNA表达水平与精神分裂症的关联. 方法 将117例首发精神分裂症患者设为患者组,117名健康体检者设为对照组;应用半定量RT-PCR方法测定两组多巴胺D1受体基因mRNA表达量;患者组在服用抗精神病药物前抽取静脉血标本,并进行阳性与阴性症状量表评定;对照组于入组次日晨起空腹抽取肘静脉血检测上述指标.分析两组多巴胺D1受体基因 mRNA表达量的差异性以及患者组多巴胺D1受体基因 mRNA表达量与阳性与阴性症状量表总分和各因子分的相关性. 结果 患者组多巴胺D1受体基因mRNA水平高于对照组,差异有显著性（t=2.067,P＜0.05）;患者组治疗前多巴胺D1受体基因mRNA表达量与阳性与阴性症状量表阴性症状因子分呈有统计学意义正相关（R=0.350,P＜0.01）,与攻击因子分呈有统计学意义负相关（R=-0.334,P＜0.01）;与总分、阳性症状及一般病理因子分均无统计学意义相关性（R=0.127、0.043、-0.029;P均＞0.05）. 结论 多巴胺D1受体基因mRNA表达量与精神分裂症存在关联,其表达量增高可能导致精神分裂症阴性症状,但抑制精神分裂症的攻击行为.     

隔药饼灸对兔动脉粥样硬化斑块中基质金属蛋白酶-2,9 mRNA表达的影响

目的观察隔药饼灸对兔动脉粥样硬化(AS)中基质金属蛋白酶-2,9(MMP-2,9)表达的影响,探讨隔药饼灸对兔动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。方法将75只新西兰大耳白兔,通过高脂饲料喂养及免疫损伤法建立兔AS模型。然后随机分为5组,每组15只,即：空白组(空白对照组);模型组(AS模型组);直接灸组(AS模型+艾炷直接灸);隔药饼灸组(AS模型+隔药饼灸);西药组(AS模型＋阿托伐他汀)。运用原位杂交法检测兔动脉粥样硬化斑块中MMP-2,9 mRNA的表达。结果隔药饼灸、直接灸和西药均能抑制兔动脉粥样硬化斑块中MMP-2和MMP-9 mRNA的表达(P<0.01或P<0.05);隔药饼灸组和西药组MMP-2和MMP-9 mRNA的表达低于直接灸组(P<0.01或P<0.05)。结论隔药饼灸、直接灸和西药通过抑制兔动脉粥样硬化斑块中MMPs的表达,起到稳定动脉粥样硬化斑块的作用,且隔药饼灸和西药抑制MMPs表达的作用优于直接灸。     

Taqman探针定量检测ICOS/ICOSL基因表达的方法

背景:近年来可诱导共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)/可诱导共刺激分子配体(ICOS Ligand,ICOSL)在抗感染、抗移植反应、抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病等多方面领域受到了越来越多的关注.目前对ICOS/ICOSL表达量的研究大多基于分子水平,国内外尚鲜见ICOS/ICOSL mRNA定量检测的报道.目的:构建ICOS/ICOSL cDNA质粒标准品,建立Taqman探针检测 ICOSL/ICOSL基因表达量的方法.方法:以胃腺癌组织总RNA为模板、Random 9 mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板聚合酶链反应扩增人ICOS/ICOSL 基因相应的cDNA目的片段,构建PMD-18-ICOS/ICOSL重组质粒,鉴定测序后,用Taqman探针实时荧光定量聚合酶链反应制作标准曲线.结果与结论:组织提取的总 RNA 完整性良好,构建的ICOS/ICOSL质粒测序结果与目的片段一致,质粒的原始浓度为6.10×1013,4.31x1013 copies/mL,倍比稀释后用Taqman探针荧光定量聚合酶链反应检测,在1012～1013 copies/mL线性关系良好(R2=1),提示成功建立了Taqman探针定量检测ICOS/ICOSL基因表达的方法.     

雷公藤对哮喘的治疗作用及对痰液中嗜酸细胞IL4和IL-5mRNA表达的影响

目的 探讨雷公藤对哮喘的治疗作用及对痰液中嗜酸细胞(EOS)IL-4和IL-5mRNA表达的影响.方法 12例哮喘患者的诱导痰标本,与雷公藤内酯醇(10-7 mol/L)共同培养48小时设为雷公藤组(12例),单独培养48小时设为空白组(12例),健康自愿者痰液为正常对照组.采用斑点分子杂交检测EOS IL-4、IL-5mRNA表达.结果 哮喘患者痰液中EOS浸润密度与正常对照组比较,差异有显著性意义(P<0.01);雷公藤组与空白组EOS IL-4、IL-5mRNA表达水平比较,差异有显著性意义(P<0.01),空白组与正常对照组EOS IL-4、IL-5mRNA表达水平比较,差异有显著性意义(P<0.01);雷公藤组与正常对照组EOS IL-4、IL-5mRNA表达水平比较,差异无显著性意义(P>0.01).结论 IL-4、IL-5mRNA表达增加可能是导致哮喘嗜酸气道炎症的原因,雷公藤内酯醇能抑制IL-4、IL-5mRNA表达,可能为哮喘抗炎治疗的机制之一.     

哮喘患者诱导痰中嗜酸细胞IL-4和IL-5mRNA表达

目的 :探讨IL - 4、IL - 5在哮喘诱导中痰嗜酸细胞 (EOS)炎症的作用。方法 :斑点分子杂交检测哮喘患者诱导痰中嗜酸细胞IL - 4、IL - 5mRNA表达。结果 :哮喘患者痰液中EOS细胞浸润密度增加 ,IL - 4、IL - 5mRNA表达比正常人明显升高 (p<0 .0 1) ,而正常对照组无明显变化 (p >0 .0 5 )。结论 :IL - 4、IL - 5mRNA表达增加可能在导致哮喘EOS气道炎症的过程中起信号途径作用。     

RhoC基因在胃癌中的表达及其意义

目的 研究胃癌与癌旁胃黏膜中RhoC mRNA的表达情况及其与胃癌主要临床病理特征的关系. 方法 采用半定量RT-PCR方法检测23例新鲜胃癌组织和相应的癌旁胃黏膜组织中RhoC mRNA的表达. 结果 胃癌组织中RhoC mRNA的表达水平高于相应的癌旁组织,其吸光度比值分别为1.40±0.23和0.36±0.15(P<0.01);同时RhoC mRNA在胃癌组织中的表达水平与胃癌浸润深度、TNM分期和有无淋巴结转移有相关性(均P<0.01). 结论 RhoC mRNA在胃癌组织中过表达可能与胃癌的发生发展密切相关,有望成为胃癌的早期诊断指标.     

胃癌患者外周血hTERT mRNA转录水平及临床意义

目的研究胃癌患者外周血中hTERT mRNA的表达，探讨其作为胃癌肿瘤细胞标志物的可行性。方法应用实时荧光定量RT—PCR技术检测96例原发性胃癌、50例胃溃疡和60例健康献血员血清中hTERT mRNA表达水平，并对阳性PCR产物进行克隆、测序。结果胃癌组hTERT mRNA表达水平（12．78±0．97）copies／ml，显著高于良性胃溃疡组（0．93±0．23）copies／ml和健康对照组（0．29±0．17）copies／ml。多变量分析表明，hTERT表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤生长方式、肿瘤分化程度、淋巴管侵犯、静脉侵犯均无显著相关性（P〉0．05），而与浸润深度、淋巴结转移、远处转移、pTNM分期及CEA有显著相关性（P〈0．05）。结论qRT—PCR具有快速、敏感和特异的特点。定量分析外周血hTERT mRNA转录水平可作为胃癌的肿瘤细胞标志物之一，用于早期诊断。     

塞来昔布对胃癌细胞凋亡及survivin mRNA表达的影响

目的:探讨塞来昔布(celecoxib)对胃癌细胞株MGC803凋亡的影响,为寻求新的胃癌治疗策略提供理论依据.方法:MGC803细胞经塞来昔布处理后,用AO/EB荧光染色检测细胞凋亡率;RT-PCR检测凋亡相关基因survivinmRNA的表达.结果:荧光染色法显示塞来昔布可诱导MGC803细胞凋亡,并呈时间、剂量依赖性;RT-PCR检测发现塞来昔布可抑制凋亡相关基因survivinmRNA的表达.结论:塞采昔布诱导MGC803凋亡可能与survivinmRNA表达下调有关.     

LunX mRNA联合CEA、SCCA、CYFRA21—1三项肿瘤标志物诊断非小细胞肺癌的临床应用价值

目的 探讨外周血LunX mRNA联合CEA、SCCA、 CYFRA21-1三项肿瘤标志物检测在非小细胞肺癌(NSCLC)患者临床诊断中的价值.方法 应用实时荧光定量RT-PCR技术和化学发光免疫分析法,分别对NSCLC、乳腺癌、胃癌、肺炎患者及健康体检人群外周血中LunX mRNA和三项肿瘤标志物水平进行检测.结果 NSCLC患者外周血中检测到LunX mRNA,阳性表达率为78.6%(44/56),在乳腺癌、胃癌、肺炎患者健康体检人群外周血中LunX mRNA检测为阴性,但是其他三项肿瘤标志物在NSCLC、乳腺癌、胃癌外周血中检测为阳性,在肺炎患者和健康体检者中检测为阴性.外周血中LunX mRNA表达水平及其阳性表达率与NSCLC患者TNM病理分期密切相关(P＜0.05).结论 NSCLC患者外周血中LunX mRNA表达特异性高, LunX mRNA联合三项肿瘤标志物检测对NSCLC临床诊断提供重要参考依据.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的 建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-PCR)方法,探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值.方法 应用SYBR GreenⅠ作为荧光染料,以GAPDH作为内对照,建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法,并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测.结果 56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为1.07±2.99,阳性表达率为66.1%(37/56),30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为0.13±0.07,阳性表达率为6.7%(2/30),30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性;结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化(P＞0.05),但在Dukes C+D期表达水平(1.73±2.15)及表达阳性率82.8%(24/29)均显著高于Dukes A+B期表达水平(0.39±0.87)及表达阳性率48.1%(13/27)(P＜0.01).结论 该FQ-PCR方法简便、特异、可靠;检测外周血CEA mRNA表达水平,对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性,可提高早期结直肠癌诊断符合率;在发生转移的Dukes C+D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A+B期,可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一,动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值.