用反义策略研究hMMS2基因在人细胞分裂增殖中的作用

目的 :ｈＭＭＳ2是人细胞中新发现的基因 ,其酵母同源基因ＭＭＳ2是一个抗增变基因。本研究用反义策略建立ｈＭＭＳ2基因表达阻断细胞系 ,以分析ｈＭＭＳ2基因的功能。方法 :1 ｈＭＭＳ2反义ＲＮＡ表达质粒构建 :用ＰｓｔＩ酶从ｐＢＳ -ｈＭＭＳ2上切出 837ｂｐ长ｈＭＭＳ2ｃＤＮＡ片断 ,两端切平后分别连上ＳａｌＩ连接子 ,ＳａｌＩ酶切后 ,将比目的片断连到改建的地塞米松诱导表达载体多克隆位点的切点上 ,通过酶切图谱分析筛选ｈＭＭＳ2反义ＲＮＡ表达重组子 ;2 细胞转染及筛选 :反向表达重组子用改良的磷酸钙法转染入ＦＬ细胞 ,通过Ｇ…     

人羊膜FL细胞CROC-1基因表达反义阻断后的 生物学特性研究

目的 :ＣＲＯＣ - 1是人细胞中新发现的基因 ,其酵母同源基因ＭＭＳ2是一个抗增变基因。本研究用反义策略建立ＣＲＯＣ - 1基因表达阻断细胞系 ,分析ＣＲＯＣ - 1基因在细胞生理活动中的作用。方法 :1 ＣＲＯＣ - 1反义ＲＮＡ表达质粒构建 :用ＡＣＣＩ酶从ｐＢＳ -Ｃｒｏｃ- 1Ｂ上切出 840ｂｐ长ｃＤＮＡ片断 ,两端填平后分别连上ＳａｌＩＬｉｎｋｅｒ,ＳａｌＩ酶切后将此目的片断连到改建的地塞米松诱导表达载体多克隆位点的ＳａｌＩ切点上 ,通过酶切图谱分析筛选ＣＲＯＣ - 1反义ＲＮＡ表达重组子 ;2 细胞转染及筛选 :反向表达重组子用…     

表达反义hREV3基因片段的真核细胞表达质粒的构建

目的：构建真核细胞表达重组体,为今后利用反义核酸阻断技术研究ｈＲＥＶ３基因功能４及其与细胞遗传不稳定性的关系提供物质材料。方法：用内切酶ＢａｍＨⅠ及Ｂａｍ ＨＩ＋ＨｉｎｄⅢ分别对ｐＢＳ－ｈＲＥＶ３进行单酶切和双酶切,从而得到含ｈＲＥＶ３ ｃＤＮＡ特异性保守序列的两种长度片段,分别将两者插入真核细胞载体;ｐＢＫ－ＲＳＶ和ｐＭＡＭｎｅｏ ａｍｐ＾－。     

1,25(OH)2D3及其类似物对人骨肉瘤细胞系HOS-8603增殖分化调节作用的分子机制

目的 :研究维生素Ｄ3受体 (ＶＤＲ)及其靶基因ｐ2 1在 1 ,2 5(ＯＨ) 2 Ｄ3及其类似物调节人骨肉瘤细胞系ＨＯＳ - 860 3增殖分化中的作用。方法 :构建ＶＤＲ反义ｃＤＮＡ的真核表达载体 ,用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法转染人骨肉瘤细胞系ＨＯＳ - 860 3,经Ｇ41 8筛选后获得稳定转染的单克隆细胞株 (ＶＤＲａｓｌ～ 6) ,并采用免疫组化方法和瞬时转染报告基因技术分别检测ＶＤＲａｓ3细胞内源性ＶＤＲ蛋白的表达情况和转录激活功能 ;继而利用ＶＤＲａｓ3细胞研究ＶＤＲ被阻断后细胞增殖以及靶基因ｐ2 1ｍＲＮＡ表达的变化。用定量ＲＴ -Ｐ…     

6种真核表达质粒作为HBV-DNA疫苗免疫小鼠的研究

将编码ＨＢＶ表面抗原的Ｓ基因分别克隆到 6种不同的真核表达质粒上 ,包括两种真核质粒载体 (ｐｃＤＮＡ3.1,ｐＣＩ ｎｅｏ) ,两种逆转录病毒载体 (ｐＸＴ1,ｐＬＸＳＮ)和两种ＥＢ病毒载体 (ｐＣＥＰ4,ｐＭＥＰ4) ,构建不同的真核表达重组体 ,经酶切鉴定符合要求。将重组体用电转染法导入人肝癌细胞系ＨｅｐＧ2获得稳定分泌ＨＢｓＡｇ的抗性细胞系。不同重组体表达ＨＢｓＡｇ的滴度 ,以逆转录病毒重组基金项目 :国家自然科学基金资助项目(36930 2 80 ,3957660 )作者单位 :重庆医科大学肝病研究所通信作者 :叶珈 30 0 0 70天津医科大学免疫教…     

用反义核酸技术研究POLκ基因对细胞遗传稳定性的影响

目的 :建立POLκ基因表达反义阻断的FL细胞系研究POLκ(polymerasekappa)在维持细胞遗传稳定性中的作用。方法 :将POLκ基因的 16 90 - 1918片段反向克隆到哺乳动物细胞表达载体pMAMneo -amp-中 ,将重组表达质粒转染FL细胞 ,经G4 18筛选 ,获得POLκ基因被表达阻断的哺乳动物细胞系FL -POLκ-。采用穿梭质粒pZ189介导的突变实验 ,观察在POLκ基因表达被阻断细胞系中进行复制时的自发突变频率。结果 :成功建立细胞系FL -POLκ-。穿梭质粒pZ189在FL -POLκ-细胞中复制后 ,其supFtRNA基因的自发突变频率为 11.2× 10 -4,而对照细胞FL和FL -M分别为 4 .9× 10 -4和 3.7× 10 -4。结论 :POLκ在维持哺乳类细胞的遗传稳定性中起重要作用     

含日本脑炎病毒pre-M/E蛋白基因真核表达质粒的构建及免疫效果观察

本文作者将日本脑炎病毒（ＪＥＶ）的前膜蛋白和囊膜蛋白（ｐｒｅＭ／Ｅ）的基因插入到真核表达载体ｐＳＧ５中，构建了重组表达载体ｐＳＧＪＥ。用其体外转染地鼠肾细胞ＢＨＫ－２１，经间接免疫荧光法（ＩＦＡ）检测，证实了ＪＥＶ－Ｅ的瞬时表达。大量制备和纯化重组质粒，经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，结果显示该重组质粒可明显促进小鼠在受到ＪＥＶ活病毒攻击后特异性抗体的产生。     

含日本脑炎病毒pre—M／E蛋白基因真核表达质粒的构建及…

本文作者将日本脑炎病毒（ＪＥＶ）的前膜蛋白和囊膜蛋白（ｐｒｅＭ／Ｅ）的基因插入到真核表达载体ｐＳＧ５中，构建了重组表达载体ｐＳＧＪＥ。用其体外转染地鼠肾细胞ＢＨＫ－２１，经间接免疫荧光法（ＩＦＡ）检测，证实了ＪＥＶ－Ｅ的瞬时，大量制备和纯化重组质粒，经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，结果显示该重组质粒可明显促进小鼠在受到ＪＥＶ活病毒攻击中特异性抗体的产生。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核 …

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶ Ｃ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达的核心抗原     

反义阻断CROC-1基因表达导致细胞生长变慢

目的:建立CROC- 1 基因表达被阻断的FL-CROC- 1 ^-细胞系,研究CROC- 1 基因在细胞生长中的作用。方法: 运用反义技术将新近发现的人泛素缀合酶样蛋白基因CROC- 1 的适当长度cDNA片断克隆到本室改建的真核细胞表达载体pMAMneo-amp^-中,经限制性内切酶图谱分析筛选出反向插入的表达CROC- 1 反义RNA的重组质粒。将此反义表达重组质粒(pMAM-antiCROC- 1 )用改良的磷酸钙法转染人羊膜FL细胞并用含G418的培养基筛选,测定G418抗性的FL-CROC- 1 ^- 细胞系的生长速度。 结果:建立的FL-CROC- 1 ^- 细胞系在地塞米松诱导下CROC- 1 基因表达被反义抑制后,其生长速度较对照FL细胞及转染了载体pMAMneo-amp^- 的FL细胞(FL-MAMneo)的明显要慢(P＜0.05)。结论: 本研究成功地建立了CROC- 1 基因表达被阻断的FL-CROC- 1 ^- 细胞系,并提示CROC- 1 基因编码的泛素缀合酶样蛋白在细胞生长中起正调控作用。     

重组HBsAg免疫逃逸突变体的表达及其抗原性分析

为了深入研究乙型肝炎病毒S基因变异所致的包膜抗原抗原性的改变，从含ＨＢＶＤＮＡ双拷贝的质粒载体ｐＥｃｏｂ６，获得一个８３７ｂｐ的ＨＢＶ－Ｓ基因片段，将其插入至载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ~＋的ＳｍａⅠ位点，通过体外寡核苷酸介导的人工定点突变分别获得第１４５位、１２６位和第１４５位＋１２６位氨基酸三种Ｓ基因变异型。然后将这些Ｓ基因变异片段克隆到真核表达载体ｐＭＥｐ４上，从而构建了含ＨＢＶ－Ｓ基因及其突变型的表达载体ＰＭＥｐ４ＨＢＶＳＭ。用其转染人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２，获得稳定分泌ＨＢｓＡｇ及其变异体的抗性细胞系。经体外初步研究表明，ＨＢｓＡｇ １４５位氨基酸变异体可影响ＨＢｓＡｇ的“ａ”抗原决定簇的结构。     

通用型腺病毒伴随病毒载体的构建

目的构建含腺病毒伴随病毒（ＡＡＶ）基因组两端的反向重复序列（ＩＴＲｓ）和表达必须元件如启动子、多克隆位点和ＰｏｌｙＡ信号的通用型载体质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ，并获得重组ＡＡＶ（ｒＶＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ）。方法通过ＤＮＡ重组技术，将ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ、Ｎｅｏ基因、ＣＭＶ－ＩＥ启动子和多克隆位点组成表达盒子，取代含ＡＡＶ全基因组质粒ｐＳＳＶ９中ＡＡＶ结构基因部分，构建成质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ。用ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ转染５型腺病毒（Ａｄ５）感染的重组ＡＡＶ包装细胞系ＡＥ１２０１，能获得重组病毒ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ。提取ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ感染细胞的染色体，用Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析重组病毒基因组在感染细胞中的存在情况。结果质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ转染包装细胞系后所得ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ滴度为４．２×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，并且ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ能在转导细胞内实现其基因组与细胞染色体的整合。结论成功地构建了通用型ＡＡＶ载体，为今后的ＡＡＶ载体研究、基因治疗和临床应用打下了基础     

血管内皮生长因子基因的表达及血管生成作用

构建新的血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）高效真核表达载体ｐｃＤ２／ＶＥＧＦ,体外转染ＶＳＭＣ〈发现其在ＶＳＭＣ中的表达效率较ｐｃＤＮＡ３／ＶＥＧＦ明显增高,体外和体内实验证实ＶＥＧＦ基因具有显著促进血管生成的作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。     

血管内皮生长因子反义基因转染对高转移人巨细胞肺癌细胞系生 …

目的 探讨反义血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因转染在抑制恶性肿瘤生长和转移的抗肿瘤血管基因治疗中的意义。方法 利用基因重组技术构建正义和反义ＶＥＧＦ１２１ ｃＤＮＡ真核表达载体,用脂质体法转染高转移性人巨细胞肺癌细胞（ＰＧ）,经Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹免疫化学检测ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ和蛋白质的表达水平,并对转染前后细胞进行体外生长和裸鼠体内生长转移等多项生物学行为实验,结果 转染反义转     

腺病毒伴随病毒载体介导的Ⅰ型单纯疱前病毒胸苷 …

目的 研究腺病毒伴随病毒（ＡＡＶ）载体介导杀肿瘤瘤基因的转移及其在肿瘤治疗方面的应用。方法 应用作者构建的腺病毒伴随病毒载体，克隆Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶＩ－ＴＫ）基因，构建质粒ｐＡＣＴＫ－１９。用ｐＡＣＴＫ－１９转染５型腺病毒（Ａｄ５）感染的重组ＡＡＶ包装细胞系ＡＥ１２０１，获得重组病毒ｒＡＡＶ／ＡＣＴＫ。再用此重组病毒感染肺癌细胞系Ａ５４９，并联合现氧鸟苷（ＧＣＶ）作用，研究其体外对肺     

HIV-1核心蛋白p24在大肠杆菌中的表达与纯化

探索进一步提高ＨＩＶ－１Ｐ２４ｇａｇ蛋白在大肠杆菌中的表达效率,增加产物的纯化手段。方法：通过改造原核表达载体ＰＢＶ２２０和ｐＥＴ２８,构建了一种通用型温控原核表达载体ｐＶＶ５,将ＨＩＶ－１ｇａｇ基因的１１４８－１８５７编码序列,插入到ｐＶＶ５ｂ和ｐＥＴ２８ｂ的相应位点中,构建了重组表达质粒,ｐＥＧ１ｂ和ｐＥＧ７ｂ,转化到大肠杆菌中进行表达,产物利用ＩＭＡＣ金属螯合层析柱进行纯经,纯化的表达产物用     

hREV3基因表达被反义阻断的人胚肾细胞系的建立及其某些生物学特性观察

目的:建立hREV3基因表达反义阻断的细胞系并观察其生长特性与对烷化剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)敏感性的改变。方法:利用改良磷酸钙-DNA共沉淀法分别将本室构建的持续和诱导表达反义hREV3 RNA的真核细胞重组表达质粒pBK-RSV-hREV3和pMAMneo-amp^--hREV3^-转染人胚胎肾细胞(HEK-293细胞),经G418筛选,建立相应的细胞系293-B-hREV3^-和293-M-hREV3^-。通过细胞计数方法观察这些细胞系的生长速率和不同浓度MNNG对细胞的细胞毒作用。 结果:持续或诱导阻断hREV3基因的表达对细胞生长速率均无影响;反义阻断细胞系对MNNG的细胞毒作用比母本293细胞较为敏感。结论:hREV3基因的编码产物并非细胞生长所必需而可能在细胞的DNA损伤修复中起作用。     

反义RNA体外抑制丙型肝炎病毒基因表达的研究

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因调控方式及反义RNA对HCV基因表达的体外抑制作用。方法 采用业已建立的HCV基因调控细胞模型，以重组质粒共转染策略，将反义RNA重组质粒与HCV5′非翻译区(5′UTR)调控的报道基因——虫荧光素酶(luc)重组质粒共同转染人肝癌细胞系(HepG2)，并以不表达反义RNA的原核重组质粒和不含有HCV5′UTR的luc重组质粒做为对照。转染细胞经短期培养后制备细胞提取液，荧光检测法检测luc基因的表达。结果 针对HCV5′uTR的反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR调控的luc基因的表达，并具有剂量依赖效应。对照重组质粒转染实验证明，上述抑制作用呈序列特异性。结论 HCV5′UTR具有调控下游目的基因表达的重要功能，反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR介导的病毒基因的表达。     

HSV—1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免？…

目的 构建ＨＳＶ－１型ＳＭ４４株糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的真核表达载体,并用此重组质粒直接免疫小鼠,探讨ＨＳＶ－１ ｇＤ基因作为基因疫苗的可能性。方法 从ＨＳＶ－１基因组中扩增ｇＤ的全编码基因,克隆入载体ｐＵＣ１９中,测序鉴定后转入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）。所得重组质粒ｐｃＤ－ＮＡ－ｇＤ以电穿孔法转染ＣＨＯ细胞,并以荧光染色法鉴定表达效果。用ｐｃＤＮＡ－ｇＤ免疫小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测基因免疫