酵母双杂交诱饵蛋白Rb融合质粒构建及鉴定

目的　为筛选和克隆与口腔鳞癌增殖相关的新基因 ,构建酵母双杂交系统用诱饵蛋白融合质粒。方法　从pGBT9 pRb中酶切、电泳鉴定、回收Rb基因 ,将其连接至酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体 pGBKT7中 ,构建重组质粒pGBKT7 pRb ,并经鉴定、测序、体外翻译、转录等方法验证后 ,将重组质粒转化酵母Y187,测定其在Y187中的自激活现象及毒性。然后 ,提取转化后的酵母总蛋白 ,经Westernblot检测该重组质粒在Y187内的表达情况 ,以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性。结果Rb基因经酶切、电泳后 ,大小正确 ,割胶回收 ,与质粒 pGBKT72 4h连接 ,转化大肠杆菌DH5α ,挑选重组质粒 ,测序结果与Genbank中Rb序列比对完全正确。重组质粒pGBKT7 pRb双酶切鉴定、体外翻译、转录试验 ,Westernblot等方法均证实重组质粒中的Rb基因能够正确合成Rb蛋白。转化酵母后排除重组质粒的自激活作用。结论　构建重组质粒 pGBKT7 pRb ,能够在Y187内正确表达 ,可作为酵母双杂交系统用诱饵蛋白。     

采用酵母表达载体pWX530构建表达人重组牙骨质蛋白1

目的：构建含人重组牙骨质蛋白1（recombination human cementum protein 1,rhCEMPl）基因的真核表达载体,观察其在酿酒酵母细胞中的表达。方法：采用PCR方法扩增rhCEMPl基因,利用定向克隆技术将rhCEMPl基因插入到中间载体pTeasy中,再进一步转插入载体pWX530。重组的pWX530-rhCEMPl在大肠杆菌DH5a中扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定所构建的质粒。经鉴定正确的表达载体pWX530-rhCEMPl转入酵母感受态细胞中,酵母经氨基酸营养缺陷型筛选后培养表达。利用聚丙烯酰胺凝胶（SDS—PAGE）电泳和酶联免疫吸附测定（ELISA）分析蛋白表达情况,离子交换层析提纯蛋白。结果：构建的重组质粒成功转入酵母细胞,通过SDS—PAGE和ELISA检测rhCEMPl表达成功。结论：成功构建的含m—CEMPl基因的真核表达载体pWX530-rhCEMPl,并能转入酵母细胞中成功表达。     

口腔癌缺失基因(doc-1)的结构与功能研究

DOC-1是一个进化上高度保守，显示杂合性缺失和在恶性角化细胞表达明显消失的基因。p12(DOC-1)是DOC-1基因编码的生长抑制因子蛋白，它在口腔鳞癌的发生中起着重要作用，它不仅能抑制肿瘤的生长，其表达水平还与口腔肿瘤患者的预后紧密相关。进一步的研究有利于理解口腔肿瘤的发病机理，为诊断、治疗和预防口腔肿瘤，提供新的作用靶点。     

MAPK—ERK在牙本质基质蛋白1信号通路中的作用

目的 探讨在人骨髓间充质干细胞（hMSC）、小鼠前成骨细胞（MC3T3）和成牙本质细胞（MDPC-23）中,牙本质基质蛋白1（DMP1）是否通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）-细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路发挥作用.方法 Western blot 检测不同时间点rDMP1C 和rDMP1F 蛋白处理hMSC、MC3T3-E1 和MDPC-23 后,对MAPK-ERK 的激活情况;并检测使用MAPK 抑制剂后,ERK 的激活是否被抑制;细胞免疫荧光技术观察MAPK 抑制剂抑制激活的ERK 从胞浆向胞核的转位情况.Western blot 检测siRNA 沉默Ras 基因后,对rDMP1 引起MAPK-ERK 信号通路激活的影响.结果 三种细胞中,rDMP1F 和rDMP1C 在5 min ～ 3 h 均可以激活MAPK-ERK 通路,而总ERK 在各时间点均无显著变化;rDMP1F 激活信号通路的持续时间均明显长于rDMP1C;MAPK 抑制剂处理组的p-ERK 条带与rDMP1F/C 处理组的p-ERK 条带差别明显.hMSC 中,rDMP1F 激活MAPK 信号通路持续时间要长于其在MC3T3 和MDPC-23 中的作用.细胞免疫荧光检测发现,MAPK 抑制剂组可以阻断ERK 向细胞核内的转位.MC3T3 和MDPC-23 在siRNA 沉默Ras 基因后,ERK 的磷酸化水平与rDMP1F 单独处理组相比显著降低.结论 rDMP1C 和rDMP1F 都通过Ras 激活MAPK-ERK信号通路,而rDMP1F 比rDMP1C 具有更强的信号功能.     

通过真核细胞表达系统获得重组人釉原蛋白

目的构建重组人釉原蛋白基因的真核表达系统，并建立稳定表达该蛋白的细胞系。方法取26周龄引产胎儿的牙胚组织，提取总RNA，用RT—PCR技术扩增釉原蛋白基因片段，插入中间表达载体pGEM -T。经双酶切后，再与真核表达载体pcDNA3.1^TM／myc—His（-）B相连接，构成最终的表达质粒，将该重组表达质粒转染至HEK 293A细胞，用G418筛选出阳性细胞克隆，并建立稳定表达釉原蛋白的细胞系。结果通过测序表明，人釉原蛋白基因被成功地连接到了真核表达载体上。将该表达系统转染HEK293A细胞后，进行Western Blot检测，证明有相对分子质量约32000的釉原蛋白表达。结论本实验成功构建了重组人釉原蛋白真核表达系统，建立了稳定细胞系，为获得高纯度的釉蛋白，进一步研究蛋白质功能奠定了基础。     

人釉原蛋白重组质粒PsecTaq2A-AMG在COS-1细胞系中表达

目的研究人釉原蛋白重组质粒PsecTaq2A-AMG在COS-1细胞系中的表达，为基因工程制备釉原蛋白奠定基础。方法采用脂质体载体法将釉原蛋白重组质粒PsecTaq2A-AMG导人COS-1细胞系，用Zeoin筛选得到稳定转染克隆，并经免疫组化及酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞内和细胞培养液中重组釉原蛋白的表达。结果在未经转染的对照组细胞内和细胞培养液中均未检测到重组釉原蛋白的表达，而经转染的实验组不论细胞内或细胞培养液中均检测到重组釉原蛋白的较高表达，重组质粒PseeTaq2A．AMG转染组ELISA定量检测细胞内重组釉原蛋白浓度达0.877μg／ml。结论PsecTaq2A-AMG具有较强的在真核细胞系中表达和分泌重组釉原蛋白的能力，适宜基因工程体外制备重组釉原蛋白。     

牙髓卟啉单胞菌脂多糖对小鼠成骨细胞表达MCP-1的影响

目的: 探讨牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis,P.endodontalis)脂多糖对小鼠成骨细胞表达单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)mRNA和蛋白的影响,以及是否有p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路和核因子κB（Nuclear Factor-κB, NF-κB）信号通路的参与。方法: 以不同质量浓度的P.endodontalis脂多糖(0~50 mg/L)刺激MC3T3-E1细胞24 h;以20 mg/L P.endodontalis脂多糖作用于细胞不同时间（0~48 h）后,采用实时反转录PCR和酶联免疫吸附测定检测MCP-1mRNA和蛋白的表达。采用p38MAPK抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂BAY11-7082分别预处理细胞1 h,检测其对P.endodontalis脂多糖刺激MC3T3-E1细胞后MCP-1mRNA表达的影响。采用SPSS 13.0软件包对结果进行单因素方差分析和Dunnett t检验。结果: 不同质量浓度的P.endodontalis脂多糖（0~50 mg/L）刺激MC3T3-E1细胞后,MCP-1的mRNA表达和蛋白分泌呈剂量依赖性;观察时间内（0~48 h）,20 mg/L P.endodontalis脂多糖作用于MC3T3-E1细胞后,MCP-1 mRNA的表达和蛋白分泌呈时间依赖性;10 mol/L的SB203580和BAY11-7082分别预处理细胞1 h,可以降低P.endodontalis脂多糖诱导MCP-1 mRNA的表达,且SB203580的抑制作用强于BAY11-7082。结论: P.endodontalis脂多糖可能通过激活p38MAPK和NF-κB信号通路诱导成骨细胞表达MCP-1mRNA和蛋白。     

BMP1和mTLL1在牙齿发育中的研究进展

骨形态发生蛋白1（bone morphogenetic protein 1,BMP1）和哺乳动物tolloid 样 1（mammalian tolloid like 1,mTLL1）是细胞外基质金属蛋白酶,同属于虾红素家族（astacin family）,在包括牙在内的多种组织中共表达。BMP1和mTLL1具有功能冗余性,在切割和激活细胞外基质（extracellular matrix,ECM）蛋白方面起重要作用,通过水解修剪各种ECM蛋白的前体调节ECM的沉积。以往研究表明,BMP1和mTLL1促进成牙本质细胞和成骨细胞分化,维持ECM中胶原和非胶原蛋白的平衡,在牙齿发育中发挥重要作用。现就BMP1和mTLL1在牙齿发育中的研究现状作一综述。     

重组真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建重组人白细胞介素1受体拮抗剂（rhIL-1ra）基因真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra,稳定转染小鼠成纤维细胞（NIH3T3）并检测其表达,为使用细胞因子拮抗剂基因治疗牙周炎奠定实验基础。方法Trizol法提取人乳腺癌组织总RNA,RT-PCR方法扩增目的基因。胶回收、纯化后产物与克隆载体pMD18-T连接、转化,测序鉴定正确后将重组克隆载体与真核表达质粒pEGFP-N1分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,体外连接。重组DNA转化感受态细菌E.coliTOP10,筛选阳性克隆并鉴定。将构建正确的pEGFP-N1/hIL-1ra重组质粒DNA由脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选20d,RT-PCR检测基因的表达,ELISA检测蛋白的表达。结果重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra经PCR及双酶切鉴定均证实人IL-1ra基因已与pEGFP-N1正确重组。稳定转染NIH3T3细胞后,RT-PCR得到目的基因片段,ELISA检测到目的蛋白的表达。结论本实验成功构建了编码人IL-1ra基因的重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra,并获得了稳定表达目的蛋白人IL-1ra的NIH3T3细胞系,为牙周炎基因治疗的后续研究奠定了实验基础。     

shRNA沉默LASP-1对舌鳞状细胞癌SCC9细胞增殖和迁移的影响

目的：探讨LASP?1在人舌鳞状细胞癌细胞中的表达,并应用shRNA沉默人舌鳞状细胞癌细胞SCC9中LASP?1基因,研究LASP?1对SCC9细胞增殖和迁移能力的影响。方法构建携带绿色荧光蛋白的LASP?1 shRNA质粒及阴性对照组质粒LASP?1 shNC,通过脂质体转染SCC9细胞,采用MTT法检测细胞增殖;RT?PCR法检测细胞LASP?1 mRNA表达;Western blot检测细胞LASP?1蛋白的表达;运用Transwell小室实验检测细胞迁移能力。结果 LASP?1在舌鳞状细胞癌细胞中高表达;实验组和阴性对照组分别转染相应质粒48 h后细胞均有绿色荧光蛋白表达,表明质粒转染成功;实验组SCC9细胞LASP?1 mRNA和LASP?1蛋白表达明显降低;与空白对照组相比,实验组细胞培养48 h和72 h细胞存活率分别降低了（51.23±1.47）%和（50.07±2.11）%;Transwell实验结果显示, LASP?1基因被沉默后细胞迁移能力明显下降,比对照组降低约43%。结论 LASP?1在舌鳞状细胞癌细胞中高表达,下调LASP?1基因表达可抑制SCC9细胞的增殖和迁移。     

成骨蛋白—1成熟蛋白编码区cDNA克隆与序列分析

目的：克隆成骨蛋白－１（ＯＰ－１）成熟蛋白编码区基因。方法：用一步酸酚法从中国健康人胎盘组织中提取总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成胎盘ｃＤＮＡ文库，然后利用ＰＣＲ的方法，从ｃＤＮＡ文库中扩增出编码人ＯＰ－１成熟区的基因片段，将所得基因片段插入ｐＧＥＭ－３ｚｆ（＋）载体，转化大肠杆菌后挑选阳性克隆，提取双链ＤＮＡ模板，用ＡＢＩＤＮＡ自动测序仪进行序列测定分析。结果：克隆和测序结果与国外文献报道一致。结论：在国内第一次克隆到ＯＰ－１的成熟蛋白编码区基因。     

重组质粒pcDNA3/sIL-1R(I)在哺乳动物细胞中的表达

目的　检测重组质粒pcDNA3/sIL-1R(I)在哺乳动物细胞系COS-1和CHO细胞中的表达。方法　采用脂质体介导基因转染技术,将已构建的pcDNA3/sIL-1R(I)质粒DNA导入体外培养的哺乳动物细胞系COS-1和CHO 细胞中。加入G418对转染的细胞加压筛选,获得稳定转染的细胞。酶联免疫吸附实验(ELISA)对重组质粒在COS- 1和CHO细胞表达产物的含量进行检测。结果　G418筛选获得稳定转染的COS-1和CHO细胞,对照组加压后第 10~20天细胞全部死亡。转染组第15~23天汇片达80%左右。转染组细胞培养液和冻融液中sIL-1R表达量均显著高于对照组(P<0·05)。结论　以sIL-1R胞外成熟肽编码区基因作为目的基因构建的重组质粒pcDNA3/sIL-1R (I)在哺乳动物细胞系中具有表达功能。     

白念珠菌RAS1基因高表达菌株的构建及鉴定

目的：构建白念珠菌RAS1基因高表达菌株pCaEXP?RAS1?CAI4。方法：将白念珠菌RAS1基因的开放阅读框（ ORF）置于高表达载体pCaEXP的启动子MET3之后，构建高表达质粒载体pCaEXP?RAS1。将整合的重组质粒转化进入大肠杆菌DH5α，经扩增后采用质粒抽提试剂盒大量制备pCaEXP?RAS1质粒。单酶切线性化质粒，将线性化的pCaEXP?RAS1经醋酸锂法转化入白念珠菌CAI4细胞内，随后在SD?ura?met?cys选择性培养基获得转化子，构建pCaEXP?RAS1?CAI4菌株。挑取单克隆菌落，经菌落PCR验证阳性转化子，并采用实时定量PCR检验RAS1基因在pCaEXP?RAS1?CAI4菌株的表达水平。结果：酶切及测序鉴定表明高表达质粒载体pCaEXP?RAS1构建成功，实时定量PCR检验转化子RAS1基因在pCaEXP?RAS1?CAI4菌株的表达水平，表明pCaEXP?RAS1?CAI4菌株构建成功。结论：通过高表达质粒载体pCaEXP?RAS1可以成功构建pCaEXP?RAS1?CAI4菌株。     

mcpr1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建mcpr1基因原核表达载体 ,表达MCPR1蛋白。 方法 :采用多聚酶链式反应 (PCR)扩增出mcpr1基因的蛋白编码序列 ,克隆到中间载体中 ,再经双酶切 ,亚克隆到表达载体中 ,构建该基因的融合表达载体pGEX 4T mcpr1,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达 ,SDS PAGE电泳。 结果 :酶切和测序鉴定 ,表明融合表达载体内插入片段正确 ,在大肠杆菌中诱导后 ,出现一条 3 60 0 0的新蛋白带 ,主要存在于细菌沉淀中 ,占总蛋白的3 9 %。结论 :研究表明mcpr1基因编码的蛋白质能够在原核细胞中表达 ,为进一步深入研究该蛋白质的结构与功能打下基础     

SIP1在人舌癌Tca8113细胞中的定位和融合蛋白表达鉴定的研究

目的检测Smad相互作用蛋白1(SIP1)在人舌癌Tca8113细胞系中的定位及融合蛋白的表达鉴定。方法 PCR扩增SIP1编码序列的全长,克隆到pCMV-Flag-MAT-Tag 1载体。利用共聚焦激光扫描显微镜观察SIP1和SIP1-Flag在人舌癌Tca8113细胞系中定位,并将构建好的Flag标签SIP1(SIP1-Flag)真核表达载体转染到人舌癌Tca8113细胞系中,提取蛋白进行Western blot检测,利用Flag标签抗体进行免疫沉淀纯化SIP1-Flag融合蛋白。结果构建了SIP1-Flag真核表达载体。SIP1和SIP1-Flag融合蛋白主要定位于人舌癌Tca8113的细胞核中,Western blot检测到SIP1-Flag融合蛋白表达,且在人舌癌Tca8113细胞中成功纯化SIP1-Flag蛋白。结论成功构建真核表达载体。SIP1和SIP1-Flag主要定位于细胞核,成功鉴定融合蛋白表达并纯化SIP1-Flag融合蛋白。     

转化生长因子-β1shRNA真核表达载体的构建

目的 构建转化生长因子β1（TGF-β1）的短发夹状RNA（shRNA）表达系统，为人涎腺粘液表皮样癌的治疗提供新的方法。方法 根据Genebank提供的TGF-β1 mRNA序列，设计短链寡核苷酸，化学合成后经退火形成双链DNA片段，克隆到pWH1载体中，用酶切方法对重组体进行鉴定；最后将构建的TGF-β1特异性shRNA表达载体转染涎腺粘液表皮样癌细胞，通过RT-PCR、免疫组化观察其对细胞TGF-β1 mRNA和蛋白水平表达的影响。结果 经酶切、连接后构建的质粒称之为pWH1-TGF-β1。酶切证实成功构建了TGF-β1 shRNA表达载体，RT-PCR和免疫组化结果显示其能够在mRNA和蛋白水平抑制细胞内TGF-β1的表达。结论 成功构建的TGF-β1特异性shRNA表达载体具有阻断TGF-β1表达的功能，可能为涎腺粘液表皮样癌治疗提供有效的方法和手段。     

人牙本质基质蛋白1 cDNA序列的克隆

目的：克隆人牙本质基质蛋白１（ＤＭＰ１）成熟肽编码区基因片段。方法：用异硫氰酸胍一步法从引产胎儿牙乳头组织中抽提总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙乳头ｃＤＮＡ，然后利用ＰＣＲ方法，从ｃＤＮＡ中扩增出人ＤＭＰ１成熟区的基因片段（约１．８ｋｂｐ），将所得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒载体，转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到人ＤＭＰ１成熟肽编码区基因片段。