正义、反义Id1真核表达载体的构建及其对胃癌细胞的转染

目的构建正义、反义Id1真核表达载体,并转染胃癌SGC7901细胞株,筛选稳定表达的细胞株。方法设计Id1基因两端的引物,RT-PCR扩增Id1全长序列。将目的基因插入pcDNA3.1＋/Hygro构建正义Id1真核表达载体,插入pcDNA3.1-/Hygro构建反义Id1真核表达载体。脂质体转染法转染胃癌SGC7901细胞系,潮霉素筛选稳定表达的细胞株。结果RT-PCR法获得长约530 bp的Id1全长序列,经酶切及测序鉴定正确后转染胃癌SGC7901细胞株。经过潮霉素筛选8周,获得抗性的细胞株。经Western-blot鉴定,转染正义Id1真核表达载体的细胞株Id1蛋白表达水平高于对照组,而转染反义Id1真核表达载体的细胞株Id1蛋白表达水平低于对照组。结论成功构建正义、反义Id1真核表达载体并转染胃癌SGC7901细胞株,为进一步研究打下基础。     

稳定表达HIV-1 GagPol基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建能稳定表达HIV-1 GagPol基因的真核表达载体.方法:用PCB方法扩增HIV-1 GagPol基因,克隆入pMD18-T,然后亚克隆人真核表达质粒pcDNA3.2(一)中,将构建的重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol分别瞬时和稳定转染HEK293细胞,经G418筛选,建立稳定转染GagPol基因的细胞系,并应用Western Blot方法鉴定表达产物.结果:酶切鉴定和Western Blot检测证实重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol构建正确,并能稳定表达HIV-1GagPol蛋白.结论:成功构建携带HIV-1 GagPol基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/GagPol,并在HEK293细胞中获得稳定表达.     

大鼠干扰素诱导蛋白-10的体外表达和鉴定

目的 构建大鼠干扰素诱导蛋白-10(IP-10)真核表达载体,在NIH3T3细胞中表达重组载体pcDNA3.1(+)-IP-10,并对其表达产物进行鉴定.方法 通过PCR扩增IP-10基因片段,通过酶切和连接反应,构建IP-10的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,免疫荧光技术检测pcDNA3.1(+)-IP-10在NIH3T3细胞的表达情况.转染的Nm3T3细胞通过G418筛选出稳定表达的细胞克隆,Western Blotting鉴定IP-10蛋白在细胞培养上清的表达情况.结果 酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10基因被成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),免疫荧光技术检测证实重组载体可在NIH3T3细胞表达.Western Blotting结果显示细胞培养上清有IP-10蛋白表达.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,为进一步研究其对Th1型自身免疫性疾病的治疗效果奠定基础.     

SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定.方法:扩增小鼠H /K ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定.用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达.结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达.结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功.     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的 构建人PCK1基因的真核表达载体.方法 以人内脏脂肪细胞cDNA为模板, 聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定.结果 PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致.重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和 2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+) 中.结论 成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体.     

新基因PRR11的克隆、真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,半定量RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-PRR11。然后将pcDNA3.1-PRR11重组载体转染入HeLa细胞中,收集细胞,制备总RNA和细胞裂解液,采用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测目的基因表达情况。结果：成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,测序结果表明序列完全正确,pcDNA3.1-PRR11真核重组表达载体构建成功。半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法证实了转染入HeLa细胞中的目的基因表达成功。结论：成功构建了PRR11基因的真核表达载体,并可在HeLa细胞中成功表达,为进一步研究PRR11基因的功能奠定了基础。     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况.结果 PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1, 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和 850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank 序列号NM_000209)序列一致.证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1 中.Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达.     

大鼠EAAT3真核表达载体的构建及在Hella细胞中的表达

目的:克隆大鼠谷氨酸转运蛋白3(EAAT3)的cDNA,构建其真核表达载体并转染Hella细胞.方法:从大鼠的脑组织中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增EAAT3的基因编码区序列,将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ). 经酶切及测序鉴定后用阳离子脂质体将其转染到Hella细胞中,通过免疫印迹法鉴定其表达.结果:经双酶切、测序鉴定证实EAAT3基因的真核表达载体构建成功.免疫印迹法证实EAAT3基因的表达.结论:成功克隆了EAAT3编码区序列,并构建了其真核表达载体,为以EAAT3为基础的中枢神经系统疾病的治疗奠定了基础.     

AKTIP基因真核表达载体的构建及其在GES-1细胞中的表达

目的:构建人蛋白激酶B相瓦作用蛋白(AKTIP)基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体,观察其在GES-1细胞中的表达.方法:从健康人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增AKTIP cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,经酶切鉴定及DNA测序证实后,应用脂质体将AKTIP基因转染入人胃黏膜细胞株GES-1细胞中,通过Western Blot检测其在GES-1细胞中的表达情况.结果:重组载体经酶切鉴定和测序证实目的基因正确无误,Western Blot结果显示AKTIP基因在GES-1细胞具有良好的表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1/myc-His(-)A-AKTIP真核表达载体,并成功地在GES-1细胞中进行了表达,为进一步研究AKTIP的功能和结构奠定了基础.     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致。重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体。     

小鼠4-1BBLcDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆小鼠4-1 BBL基因，构建其真核表达载体，并观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法：取C57BL/6小鼠脾细胞，经PHA诱导后，以RT-PCR克隆4-1 BBLcDNA，测序，构建pCDNA3．1( )-m4-1BBL真核表达质粒，转染COS-7细胞，RT-PCR检测m4-1BBLmRNA表达，间接免疫荧光法和流式细胞仪检测4-1 BBL蛋白的表达，结果：从小鼠脾细胞中克隆到m4-1 BBL cDNA，经测序完全正确，所构建的m4-1BBL质粒在COS-7细胞中获得高效表达。结论：小鼠4-1BBLcDNA基因克隆、真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

人类TAP1基因克隆及表达载体pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-TAP1的构建

目的 克隆TAP1(抗原处理相关转运1)基因cDNA序列,构建其真核表达载体peDNA3．1／V5-His TOPO TA-TAP1。方法 从人类B-LCL细胞中提取总RNA,以RT-PCR技术扩增TAP1基因片段,将该段基因克隆到表达载体peDNA3．1／V5-His TOPO TA上测序。结果 通过RT-PCR扩增获得1个2593bp的DNA片段,测序分析表明为TAPl基因。结论 通过RT-PCR等技术成功克隆出人类TAP1基因并成功构建了表达载体peDNA3．1／VS-His TOPO TA-TAP1。     

小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)原核表达载体pQE31-MIF的构建

目的 :获得小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)全长基因克隆 ,并构建重组表达载体pQE3 1 MIF。方法 :用RT PCR技术 ,以特异性寡核苷酸为引物 ,从小鼠脾脏总RNA中扩增MIF基因 ,插入pMD1 8 T载体 ,用限制性核酸内切酶和DNA序列分析鉴定重组克隆。构建并鉴定原核表达载体pQE3 1 MIF。结果 :成功克隆了小鼠MIF基因 ,构建了重组质粒pMD1 8 MIF及重组原核表达质粒。序列分析显示获得的MIF基因cD NA序列与文献报导一致。结论 :成功构建了重组表达质粒pQE3 1 MIF ,为进一步深入研究MIF蛋白的生物学活性奠定了基础     

慢性粒细胞白血病MGMT基因的克隆及逆转录病毒表达载体的构建

目的：从慢性粒细胞白血病病人外周血中克隆人MGMT基因，并进行逆转录病毒表达载体的构建。方法：用RT－PCR方法从慢性粒细胞白血病病人外周血白细胞中克隆得到长为684bp MGMTcDNA。将该片段与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5后得到重组质粒pGEM-T-MGMT，进行限制性内切酶酶切分析、PCR及测序鉴定。再将MGMTcDNA亚克隆到GlNa逆转录病毒载体EcoRI和xhoI位点之间，并进行酶切、PCR鉴定。结果：成功克隆了人MGMT基因，经酶切分析、PCR初步筛选及测序鉴定证实序列正确，并成功构建到逆转录病毒载体上。结论：通过克隆人MGMT基因，并构建逆转录病毒载体GlNa-MGMT，为探讨将耐药基因导入造血干细胞对烷化剂类化疗药物抗性的研究奠定了基础。     

人类TAP2基因克隆及真核表达质粒的构建

目的 克隆抗原处理相关转运体亚基TAP2基因片段并构建真核表达载体。方法 从EB病毒刺激的人B淋巴母细胞系(B-LCL)中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出TAP2 cDNA。将TAP2 cDNA插入表达载体pcDNA3．1／VS-His-TOPO中,构建重组表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO-TAP2,并进行测序分析。结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人TAP2 cDNA。结论 获得了人TAP2 cDNA并构建了重组真核表达载体,对TAP2基因产物在体外表达、进一步研究TAP2分子在肿瘤基因治疗方面的作用具有重要的意义。     

RT-PCR 扩增MUC1检测胃癌微转移研究

目的 以ＲＴ－ＰＣＲ检测胃周淋巴结胃癌转移细胞并评价其临床应用价值。方法 以ＭＵＣ１ｃＤＮＡ的特异旬为ＲＴ－ＰＣＲ引物,酶切分析法及系列稀释该法的特异性和敏感性进行分析,对临床收集的胃周淋巴样品作ＲＴ－ＰＣＲ检测及产物ＤＮＡ点杂交验证。结果 （１）胃及胃癌组织均存在ＭＵＣ１ｍＲＮＡ的表达;（２）该扩增体系具有较好的特异性;（３）敏感性可达１ｐｇＲＮＡ,相当于从１０＾５个淋巴细胞中检出１个胃癌细胞;     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。     

丙型肝炎病毒Core基因重组表达载体Pet32a-Core的构建

目的扩增丙型肝炎病毒核心区（HCV-Core）基因，并构建HCV-Core基因的重组表达载体。方法设计合成HCVCore基因全长引物，提取丙型肝炎患者血清中的HCVRNA，应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增c区基因片段，用限制性内切酶BamH1和SaL1双酶切后，连接到Pet32a表达载体中，并转化到BL21大肠杆菌中：然后PCR和双酶切鉴定转化茵落。结果扩增得到目的基因长度约600bp，经测序证实为HCV-Core基因，表明HCV-Core基因重组表达载体Pet32a-Core构建成功。结论成功构建HCV-Core基因表达载体Pet32a-Core，为下一步Core蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定基础。