冷冻保存血小板的研究进展

冷冻保护剂和添加液的正确选择是保证冷冻血小板质量的重要因素。冷冻血小板体内即刻止血功能明显优于液体保存血小板。为更好地保证冷冻血小板的质量,了解二甲亚砜(DMSO)在冷冻血小板保存过程中的作用及其作用机理、DMSO冷冻血小板止血功能增强的机理及不同因素对冷冻保存血小板的影响具有重要意义。本文就冷冻血小板的长期保存及质量标准、DMSO引起冷冻血小板分子改变及抑制激活作用的机理、不同因素对冷冻血小板保存效果的影响、保存效果的检测、冷冻血小板在灾害救援和军事行动中的应用及犬冷冻血小板的研究进行综述。     

未洗脱二甲亚砜冰冻复融血小板的功能及其临床应用研究

目的 探讨未洗脱二甲亚砜(DMSO)冰冻复融血小板的功能及其临床应用的可行性.方法 采用简单抽样法选择2015年1月至12月山东省东营市中心血站制备和保存的60份(每份为200 mL)未洗脱DMSO冰冻复融血小板作为研究对象,纳入复融后血小板原液组(n=60).取复融后血小板原液组血小板10 mL与复融后的新鲜冰冻血浆30 mL,按照体积比为1∶3的比例混匀后,纳入血小板混合液组(n=60).并随机选择同期本血站采集的60份新鲜液态血小板原液,纳入对照组(n=60).采用简单随机抽样法选择同期于东营市第二人民医院接受未洗脱DMSO冰冻复融血小板输注的150例患者作为输血反应的观察对象.3组血小板均进行血栓弹力图及复钙后凝血时间检测,比较各组血小板凝血功能.回顾性分析150例患者输注未洗脱DMSO冰冻复融血小板后输血反应发生情况;并比较150例输注未洗脱DMSO冰冻复融血小板患者输注前及输注后1、24、48和72 h的外周血血小板计数,分析输注未洗脱DMSO冰冻复融血小板的临床应用效果.本研究临床试验遵循的程序符合东营市第二人民医院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该伦理会批准,征得受试对象本人的知情同意,并与之签订临床研究知情同意书.结果 ①血小板混合液组血栓弹力图凝血指数(CI)为2.5±0.2,高于对照组的1.0±0.1和复融后血小板原液组的0.9±0.2,并且差异均有统计学意义(t=16.69、23.02,P＜0.05).②血小板混合液组、复融后血小板原液组及对照组血小板复钙后凝血时间分别为(6.3±0.5)、(9.0±0.8)、(11.7±1.1)min,3者比较,差异有统计学意义(F=27.38,P＜0.05).复融后血小板原液组血小板复钙后凝血时间较对照组显著缩短,并且差异有统计学意义(q=-7.38,P＜0.05).血小板混合液组血小板复钙后凝血时间较对照组及复融后血小板原液组亦显著缩短,并且差异均有统计学意义(q=-3.36、-2.29,P＜0.05).③本组150例患者共计输注未洗脱DMSO冰冻复融血小板319个治疗量,无1例发生输血不良反应.血小板输注48 h后血小板计数较输注前增加(7.6±1.1)×109/L,较输注1、24 h后的增加值[(16.3±2.5)×109/L和(13.5±2.5)×109/L]低,并且差异有统计学意义(t=-24.87、-25.92,P＜0.05).结论 未洗脱DMSO冰冻复融血小板与新鲜冰冻复融血浆(体积比为1∶3)混合物凝血功能明显提高,快速止血效果好,未洗脱DMSO冰冻复融血小板临床输注无输血不良反应,可满足急性止血需求.     

血清δ胆红素的二甲亚砜重氮试剂测定法

血清δ胆红素的二甲亚砜重氮试剂测定法孙明洪（江西新余钢铁总厂第二职工医院，江西新余３３６５１３）血清δ－胆红素（Ｂｉｌｉδ）含量的检测以及Ｂｉｌｉδ占血清总胆红素（ＢｉｌｉＴ）的比率分析，对黄疸类型的鉴别及肝功能的恢复判断有重要的临床价值［１］．作者...     

二甲亚砜双试剂法测定血清胆红素

血清标本的色泽及脂浊度对胆红素测定结果有较大干扰，用双试剂两点终点法是消除此类干扰的理想方法。二甲亚砜（ＤＭＳＯ）是胆红素的优良溶剂，可破坏非结合胆红素的氢键，加速胆红素与重氮试剂的反应。通过实验我们建立了双试剂测定血清胆红素的自动分析方法，具有除干扰能力强，重复性好，与改良Ｊ－Ｇ法有较好的一致性，试剂配制简单，稳定期长等优点，现介绍如下。１材料和方法１．１仪器日立７１７０全自动生化分析仪，ＵＶ－７５４分光光度计。１．２试剂配制１．２．１总胆红素（ＴＢ）测定试剂配制试剂Ｉ（Ｒ１）：量取ＤＭＳＯ …     

血小板冷冻保存的实验研究

本研究研制新型的血小板冷冻保存液,观察血小板在不同保存液冻存前、后的形态改变,以及体外受凝血酶作用下的活化状态,同时比较添加UDP-Gal对保存液保存效果的影响。在以往单一应用较高浓度的DMSO为血小板低温保存液的基础上,自行研制新型保存液：2%DMSO＋thrombosol＋UDP-Gal,在不同时间分别观察血小板形态及测定血小板膜表面糖蛋白CD62P的表达。结果显示,在圆形、树突形、不规则形态的百分比方面冷冻保存对血小板形态有显著影响,2%DMSO＋thrombosol组和2%DMSO＋thrombosol＋UDP-Gal组保护作用优于5%DM-SO组;与新鲜血小板相比,冻存后血小板表达CD62P明显下降,保存1月与3月时CD62P表达无明显差异,3种保存液组之间CD62P表达无明显差异。结论：3种冷冻保存液中2%DMSO＋thrombosol和2%DMSO＋thrombosol＋UDP-Gal对血小板形态的保持效果相似,均优于5%DMSO组。冷冻保存后血小板对凝血酶的反应下降,3种保存液组之间无明显差异。在保存液中添加UDP-Gal对保存效果没有明显影响。     

二甲亚砜对血小板冻存中功能保护作用的实验研究

本研究探讨二甲亚砜（DMSO）对血小板冻干保存中激活的抑制作用。以CD62p和PAC-1表达作为血小板的激活标志，CD62p和PAC-1再表达和血小板最大聚集率作为评价血小板功能的指标。对血小板经离心、洗涤及海藻糖负载等顸处理过程中加与不加DMSO的实验组，分别进行血小板膜表面糖蛋白CD62p和PAC-1表达及再表达的流式细胞术（FCMs）分析，血小板最大聚集率和血小板平均体积（MPV）的测定，研究DMSO对血小板激活抑制作用的可逆性。结果显示，血小板经预处理后，不含DMSO组的CD62p和PAC-1表达率显著增高，分别达30．37％和15．01％；含DMSO的组，CD62p表达率为10．72％，PAC．1几乎不表达（0．11％），显著低于不含DMSO组（P〈0．01）。DMSO稀释后，血小板CD62p再表达为54．39％，显著低于对照组（71．69％）和高于不含DMSO组（35．98％）（P均〈0．01）；PAC-1再表达率为49．28％，与对照组（54．48％）无显著差异，显著高于不含DMSO组（P〈0．叭）。在含DMSO组，血小板用原血浆稀释后，血小板聚集功能恢复，对restocetin，thrombin和propylgallate诱导的血小板聚集率分别为92．76％，91．24％和89．66％，与对照组和无DMSO组比无显著性差异，对ADP诱导的聚集率有34．33％，显著高于无DMSO组（P〈0．01），但仍显著低于对照组（P〈0．01）。结论：DMSO对体外处理所致的血小板膜表面CD62p和PAC-1表达具有抑制作用，且该抑制作用是可逆的，DMSO稀释后血小板仍具有CD62p和PAC．1表达能力和聚集反应功能，提示DMSO具有抑制激活损伤和低温保护的双重功能，这一生物学特性使DMSO在血小板的冻干保存中发挥重要作用。     

低温保存血小板的制备与质控效果的观察

本研究探讨建立系统的二甲亚砜 (DMSO)低温保存血小板的制备及质控的技术和方法 ,以保证低温保存血小板的质量。采取的方法 :①DMSO在使用前进行超滤替代消毒 ;②采血后 6小时内对血液进行离心 ,将血袋管道系于套桶上方 ;③以 4 80×g的相对离心力 ,离心加速 9档 ,减速 4档 ;④分离血小板时流速不能太快 ,80 - 10 0ml富含血小板血浆应在 1分钟左右分完 ;在加入DMSO时速度以 1毫升 /分钟为宜 ;加好DMSO后放入 - 80℃冰箱保存 ;临床输注前将血小板置于 38- 4 0℃的循环水浴中 ;⑤融化后进行血小板计数、白细胞和红细胞计数 ,检测HBsAg、抗 HCV、抗 HIV、梅毒特异性抗体 ,测定丙氨酸氨基转移酶 (ALT)并进行细菌培养。结果表明 :共制备14 80 0单位低温保存血小板 ,其中机采血小板 80单位。对其中 30 0单位进行质控。手工分离血小板计数≥ 2 .4×10 10 /单位 ,平均得率在 70 %以上。机采血小板计数≥ 2 .5× 10 11/单位。手工分离血小板红细胞污染数≤ 1× 10 9个/单位 ,白细胞污染数≤ 5× 10 7个 /单位。融化后进行细菌培养 ,无细菌生长 ;ALT均在正常范围内。患者输注后具有明显的止血作用。结论 :本方法制备的手工分离和机采低温保存血小板质量可靠 ,临床应用效果良好。     

2%二甲亚砜在血细胞抗凝血保存中的实验探讨

目的探讨用2%二甲亚砜(DMSO)和乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)组成复合型抗凝剂用于血细胞分析仪标本保存。方法制备含有2%DMSO复合抗凝剂的抗凝管,随机抽取患者血液及已知血小板小于50×109/L患者血液各45份,每份标本分别装于1号管(含EDTA-K2国产抗凝管)、2号管(制备含2%DMSO的复合抗凝管)、3号管(无抗凝剂采集管)。将3号管立即在美国雅培CD1800血细胞分析仪上测定,将1号管和2号管标本分别于室温下1、4、8、12 h测定,数据用x±s表示并采用配对t检验。结果 1号管标本,其平均血小板体积于8h,其值增大,与2、3号管比较,差异有统计学意义(P<0.05),已知血小板小于50×109/L患者的标本在4~8 h与之比较差异均有统计学意义(P<0.05)。2号管在12 h内,随机抽取患者血液及已知血小板小于50×109/L患者的标本各项参数与3号管比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论初步试验探讨表明,制备2%DMSO和EDTA-K2组成的复合抗凝剂更适用于血细胞分析的血液标本保存,在常规医学检验中为医疗纠纷提供了有利的凭据。     

人血小板冻干前海藻糖负载技术的优化

本研究以建立血小板负载海藻糖基本技术为基础，进一步优化海藻糖负载技术，包括负载温度、负载时间、海藻糖负载浓度和负载溶液。通过比较缓冲液和血浆负载效果，比较生理温度（37℃）和相变温度（16℃）下血小板胞内海藻糖浓度与负载时间曲线、血小板平均体积（MPV）与负载时间、海藻糖负载浓度的曲线、计算海藻糖的负载率，优选负载率较高的负载溶液、负载温度、负载时间和海藻糖浓度等血小板海藻糖负载技术参数。结果表明：37℃血浆负载率高于缓冲液负载率，且血浆负载4小时，在37℃海藻糖负载率可高达19.51％，明显高于16℃的负载率6、16％；血小板MPV在16℃比在37℃明显增大43、2％，随海藻糖负载时间（1—4小时）延长和负载浓度（0—100mmol／L）增加未见明显改变；血小板MPV在37℃与海藻糖负载时间和负载浓度呈正相关性，且海藻糖负载时间与负载浓度存在协同效应，海藻糖负载浓度高于50mmol／L，MPV随浓度（0—100mmol／L）、负载时间（1—4小时）增加而增大。结论：在原血浆中负载海藻糖、温度37℃、时间4小时、浓度低于50mmot／L可以作为优化后血小板海藻糖负载技术基本参数，负载浓度需根据冻干保存需要进行调整。     

Review of In Vivo Studies of Dimethyl Sulfoxide Cryopreserved Platelets

A literature review was conducted to assess the efficacy and safety of dimethyl sulfoxide (DMSO) cryopreserved platelets for potential military use. In vivo DMSO cryopreserved platelet studies published between 1972 and June of 2013 were reviewed. Assessed were the methods of cryopreservation, posttransfusion platelet responses, prevention or control of bleeding, and adverse events. Using the Department of Defense's preferred 6% DMSO cryopreservation method with centrifugation to remove the DMSO plasma before freezing at ? 65°C and no postthaw wash, mean radiolabeled platelet recoveries in 32 normal subjects were 33% ± 10% (52% ± 12% of the same subject's fresh platelet recoveries), and survivals were 7.5 ± 1.2 days (89% ± 15% of fresh platelet survivals). Using a variety of methods to freeze autologous platelets from 178 normal subjects, mean radiolabeled platelet recoveries were consistently 39% ± 9%, and survivals, 7.4 ± 1.4 days. More than 3000 cryopreserved platelet transfusions were given to 1334 patients. There were 19 hematology/oncology patient studies, and, in 9, mean 1-hour corrected count increments were 11 100 ± 3600 (range, 5700-15 800) after cryopreserved autologous platelet transfusions. In 5 studies, bleeding times improved after transfusion; in 3, there was either no improvement or a variable response. In 4 studies, there was immediate cessation of bleeding after transfusion; in 3 studies, patients being supported only with cryopreserved platelets had no bleeding. In 1 cardiopulmonary bypass study, cryopreserved platelets resulted in significantly less bleeding vs standard platelets. In 3 trauma studies, cryopreserved platelets were hemostatically effective. No significant adverse events were reported in any study. In summary, cryopreserved platelets have platelet recoveries that are about half of fresh platelets, but survivals are only minimally reduced. The platelets appear hemostatically effective and have no significant adverse events.     

深低温保存血小板的功能变化及新特性的研究

目的明确血小板冰冻保存后功能指标的变化并对冰冻血小板新亚群的产生和其新特性进行初步探讨。方法对冰冻保存前后的单采血小板进行回收率、黏附率、聚集强度和血小板第3因子(PF3)活性进行检测,同时采用流式细胞术比较分析不同保存条件下单采血小板膜表面功能分子表达变化的差异。结果冰冻保存后的回收率(%)为70.94±15.48,黏附率(%)为34.03±10.07,聚集强度(%)为53.82±12.73,PF3活性为(17.81±1.68)s。冰冻血小板CD62p再表达率(%)为51.8±7.7,根据表达和再表达CD62p能力不同可分为三个亚群,新鲜血小板CD62p再表达率(%)为98.4±0.6。结论冰冻保存后的单采血小板仍具有良好的功能活性,且血小板通过冰冻保存后产生了新亚群。新亚群膜表面功能分子的变化可能与即刻止血功能增强有关。     

以海藻糖为添加剂冷藏保存血小板悬液的研究

本研究探讨以海藻糖(trehalose)为添加剂的血小板悬液冷藏保存方法。采用核素标记法检测血小板生存时间,用比浊法测定血小板聚集率,诱导剂为终浓度11.2μmol/L的ADP。采集兔心脏血,按常规方法制备浓缩血小板悬液(PCs),在悬液中加入50mg/ml的海藻糖,37℃水浴4小时后,放于4-8℃冰箱保存,冷藏12天后,测定血小板聚集功能和输入自身体内后的生存时间。结果表明:常温和冷藏储存24小时后的PC血小板聚集率分别为(75.3±9.8)%和(80.5±12.5)%;输入兔体内24、48和72小时时的血小板存活率分别为(78.1±7.9)%、(65.4±6.7)%、(57.5±7.2)%和(5.1±2.5)%、(2.8±2.0)%、(0.9±0.8)%。加入海藻糖的PC冷藏保存12天后,血小板聚集率为(77.8±9.5)%;输入体内24、48和72小时时的血小板存活率分别为(75.7±11.0)%、(67.0±8.5)%、(56.8±8.0)%,与常温保存24小时对照相比,两者相近,P值均>0.05。结论:海藻糖能保护冷藏储存的兔血小板,延长冷藏血小板在体内的生存时间,经海藻糖冷藏储存的兔血小板功能完好。     

低温保存血小板在外科手术的应用

目的　研究低温保存血小板在外科应用的有效性和安全性。方法　输注对象为外科患者术中、术后出血或血小板减少引起出血以及有严重出血倾向患者。观察指标①输注前、后 2h出血时间 ;②输后伤口停止出血时间 ;③输注前、后 1h患者血小板计数 ;④根据①、②和③的结果判断输注低温血小板是否有效 ;⑤术前、术后血小板计数 ;⑥不良反应。结果　出血时间 :输前 (9± 3)min ,输后 (4± 2 )min(P <0 .0 1) ;输后 1h比输前血小板升高 (5～42 )× 10 9/L ;止血有效率为 95 % (2 2 6 / 2 38)。血小板计数 ,术后比术前下降 (130± 6 9)× 10 9/L。过敏反应 4例 ,发热反应 5例。结论　输注低温保存血小板具有明显止血和提高外周血血小板计数的效果。     

冻干血小板再水化后聚集

本研究旨在观察冻干血小板再水化后聚集反应性变化。以4种不同浓度的凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原作诱导剂,使用APACT2型血小板聚集仪,检测冻干再水化和新鲜血小板的最大聚集率,以ADP为诱导剂,检测胞内外海藻糖对再水化冻干血小板最大聚集率的影响。结果表明当凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1U/ml、1.6mg/ml、20μmol/L、2μg/ml时,新鲜血小板最大聚集率达100%左右,冻干再水化血小板最大聚集率分别达(70.17±7.36)%、(15.3±2.81)%、(68.67±6.86)%、(64.67±11.6)%。胞内外海藻糖组、胞外海藻糖组、空白对照组冻干再水化血小板最大聚集率分别达(66.0±4.69)%、(25.3±2.42)%、(11.5±1.87)%(P<0.01)。结论凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1U/ml、1.6mg/ml、20μmol/L、2μg/ml可作为血小板聚集实验的合适浓度,胞内外海藻糖使冻干再水化血小板最大聚集率显著提高。     

低温保存的血小板胞内冰晶形成温度测定

血小板胞内冰晶形成（ⅡF）的温度是指导血小板低温保存最重要的物理参数之一。本研究通过生物学和物理学的两种方法同时测定血小板ⅡF温度范围，在分步降温法中，每降5℃取出血小板样本，测定37℃直接复温（T37℃）和经液氮处理后再37℃复温（LN）两种方法处理的血小板样本磷脂酰丝氨酸（PS），血浆乳酸脱氢酶（LDH）和血小板聚集功能的变化，同时利用差式扫描量热计（DSC）记录加和不加5%DMSO的血小板在降温过程中的放热峰。结果表明，PS，LDH和血小板聚集功能在-35℃左右不再发生变化，DSC测定结果表明，代表血小板ⅡF的第二个小放热峰在-35℃左右。结论：血小板ⅡF温度在-30℃至-40℃之间（-35℃左右）。     

血小板保存3天后再冷冻保存的实验研究及临床应用

本研究探讨血小板常温保存3天后再进行-80℃冰箱内冷冻保存及临床应用的可行性。对当天冷冻和保存3天后再冷冻血小板进行了计数，并检测聚集力、黏附力以及CD62p的表达，并通过可对比性病例观察保存3天后再冷冻与当天冷冻血小板，临床应用的可能性。结果表明：在保存期3天之内血小板数量、低渗性休克反应、黏附功能无显著差异性改变（P〉0．05），但聚集功能和CD62p的表达率的变化有显著性差异（P〈0．05）。当天保存并冷冻的血小板与保存3天后再冷冻的血小板各项指标的变化都无显著性差异。CD62p的再表达率（CD62p凝血酶激活后阳性率-CD62p激活前的阳性率）也无显著性差异，分别是51．1±4．5和51．1±4．4（P〉0．05）。临床应用当天冷冻和保存3天后再冷冻血小板的CCI值分别是48％和49％，无显著性差异（P〉0．05）。结论：血小板保存3天后可以再-80℃冷冻保存，其临床应用效果与当天冷冻血小板比较后无明显差异。     

改良血小板添加液低温液态保存血小板的形态及功能研究

本研究探讨使用改良的血小板添加液替代70％自体血浆在低温（10℃）液态条件下对血小板的保存效果。采集6名供者单采血小板,每一名供者单采血小板平均分为3组,A组（常规保存组）加入100％血浆、22℃保存：B组（添加液10℃保存组）加入70％PAS—ⅢM／30％血浆、10℃保存;C组（冰冻保存组）加入100％血浆和海藻糖、-85℃保存;另设D组（血浆4℃保存组）加入100％血浆、4℃保存,作为扫描电子显微镜对照组。A、B组在第1、5、7、9天取样,C组在20天后复苏取样,分别检测CD62p、HSR、PAgT、LDH的变化。血浆常温组、添加液低温组于保存后第3、9天取样扫描电镜观察,血浆低温组于保存后第3天取样观察．冰冻组在20天后复苏取样观察,同时使用新鲜血小板作为对照。结果表明,保存期内随保存时间延长,A组和B组CD62p表达增加,HSR和最大聚集率降低;A组的LDH释放、CD62p表达、HSR、血小板最大聚集率与B组比较有显著统计学差异（P〈0．05）。C组LDH释放明显较其他两组增多,但CD62p表达较少（P〈0．05）。A、B组血小板形态保持较好,C组血小板形态保持差。结论：改良的PAS—ⅢM保存液能够替代血浆用于血小板的保存,在低温条件下能够很好地保护血小板的功能,保存效果优于血浆常温保存。