WT1-反义寡核苷酸对人脑胶质瘤细胞的促凋亡作用

应用缺陷型重组腺病毒介导WT1-反义寡核苷酸（ASODN）转染人脑胶质瘤（U251）细胞,逆转录聚合酶链反应检测WT1 mRNA的表达,Western blot检测WT1蛋白的表达;观察转染前后半胱天冬氨酸酶（caspase）3活性的变化及细胞凋亡情况.结果发现WT1-ASODN可使U251细胞中WT1 mRNA和蛋白表达下降;caspase3活性明显增加（P＜0.05）;细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）.     

45℃热能联合顺铂对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响

[目的]观察45℃热能联合顺铂对人脑胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响.[方法]将传代的U251细胞随机分为四组,A组置于37℃温箱中,B、C、D组分别置于45℃温箱、37℃温箱并加入顺铂0.01 mL、45℃温箱并加入顺铂0.01 mL,培养24h后,用甲基台盼蓝染色法行细胞形态学检测,用MTT法测算U251细胞增殖率,用流式细胞术及DNA断端原位末端标记(TUNEL)法检测U251细胞凋亡率.[结果]培养24、48 h时,细胞增殖抑制率D组＞C组＞B组＞A组(P均＜0.05).培养24、48 h时,流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡率均为D组＞C组＞B组＞A组(P均＜0.05).[结论]45℃热能联合顺铂可抑制人脑胶质瘤U251细胞增殖,并诱导其凋亡.     

RNA干扰靶向XIAP对人脑胶质瘤细胞U251的生物学行为影响

目的 采用RNA干扰技术(RNAi)抑制X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP),观察抑制前后人脑胶质瘤细胞U251的生物学行为.方法 DNA重组技术合成针对人脑胶质瘤U251细胞XIAP基因三条siRNA(siRNA1,siRNA2,siRNA3),以脂质体2000作为载体进行转染,RT-PCR法检测XIAP的mRNA表达,选择特异性较高的siRNA,以此 siRNA为标准建立20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L3个浓度梯度,转染细胞,Western blot 检测XIAP基因的蛋白表达,选出最低有效浓度;流式细胞仪检测抑制前后细胞周期和凋亡率.结果 siRNA成功转染了人脑胶质瘤细胞U251,转染率达到80%以上;RT-PCR检测siRNA2特异性较高;Western-blot检测终浓度为30 nmol/L的siRNA抑制效率较高;流式细胞仪检测停滞在G0/G1期的细胞增多,在S期的细胞减少,并且细胞的凋亡率增加.结论 通过RNA干扰可以抑制人脑胶质瘤U251细胞XIAP的表达,促进人脑胶质瘤细胞凋亡,从而抑制细胞的生长.     

人参皂甙Rh2对人脑胶质瘤细胞株U251凋亡的影响及机制探讨

目的观察人参皂甙Rh2（GS-Rh2）对人脑胶质瘤细胞株U251凋亡的影响,并探讨其机制。方法人脑胶质瘤细胞株U251经GS-Rh2处理后,采用MTT法测算细胞抑制率,用流式细胞术测算细胞凋亡率,用RT-PCR检测U251中Bcl-2、Caspase-3 mRNA,用Western blot法检测U251中Bcl-2、Caspase-3蛋白。结果 GS-Rh2对U251具有抑制作用,并呈剂量依赖性;根据细胞增殖抑制曲线计算出GS-Rh2作用于细胞的抑制浓度（IC）,求得IC30、IC50、IC70值分别为10.6、22.3、70.2μg/ml;GS-Rh2可诱导U251凋亡,并呈剂量依赖性。在GS-Rh2作用下,U251中Bcl-2 mRNA、蛋白呈明显低表达,随着GS-Rh2作用时间延长,Caspase-3 mRNA、蛋白表达逐渐增高。结论 GS-Rh2可明显抑制U251增殖,诱导其凋亡,其机制与GS-Rh2下调U251中Bcl-2 mRNA及蛋白表达、上调Caspase-3 mRNA及蛋白表达有关。     

RNA干扰抑制EZH2基因表达对人胶质瘤细胞凋亡及对卡莫司汀敏感性的影响

目的观察RNA干扰技术抑制EZH2基因表达对人胶质瘤U251细胞凋亡及其对卡莫司汀敏感性的影响。方法针对EZH2 mRNA序列设计合成小干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建pRNAT-EZH2重组表达载体,并用其转染人胶质瘤U251细胞。用RT-PCR法检测pRNAT-EZH2转染前后U251细胞中内源性EZH2表达;激光共聚焦显微镜观察转染后及加入卡莫司汀后U251细胞凋亡情况;MTT法检测转染前后U251细胞对化疗药物卡莫司汀敏感性;用分光光度法检测转染前后以及加入卡莫司汀后U251细胞中Caspase-3活性。结果成功构建pRNAT-EZH2重组质粒,并成功转染U251细胞。pRNAT-EZH2重组质粒转染后U251细胞中EZH2 mRNA表达量降低（P〈0.01）;卡莫司汀组及卡莫司汀加pRNAT-EZH2组U251细胞凋亡明显;与卡莫司汀联合时,pRNAT-EZH2组U251细胞生长抑制率明显增高（P〈0.01）;Caspase-3活性明显高于空白对照组和阴性对照组（P均〈0.01）。结论pRNAT-EZH2可抑制EZH2在人胶质瘤U251细胞中的表达,并增强U251细胞对卡莫司汀敏感性。     

木犀草素对胶质瘤细胞的抗增殖作用及其机制研究

目的 研究木犀草素对人胶质瘤U251细胞增殖的抑制作用及其机制.方法 将体外培养的胶质瘤U251细胞分为对照组、木犀草素组(依木犀草素浓度不同分为3个亚组),CCK-8法测定细胞增殖率,流式细胞仪测定细胞凋亡率,Hoechst PI核染色法观察细胞核凋亡,Western blot法检测胶质瘤U251细胞内B淋巴细胞瘤-...     

HCMV感染对神经胶质细胞NGF表达的影响

目的 探讨人巨细胞病毒(HCMV)感染时神经胶质细胞内源性神经生长因子(NGF)的表达变化.方法 采用免疫荧光法检测HCMV即刻早期蛋白(IE),RT-PCR技术检测正常培养和感染HCMV的神经胶质瘤(U251)细胞的NGF.结果 HCMV能够感染U251细胞,U251能够表达NGF,感染HCMV后初期NGF表达没有变化,后期明显下调(P＜0.05).结论 HCMV能够诱导U251细胞中的NGF表达异常.     

Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中的作用及机制探讨

目的 观察Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖和凋亡中的作用,并探讨其机制.方法 将U87细胞随机分为A、B、C组,分别加入Notch信号激活剂rhNF-κB、抑制剂DAPT及PBS共培养48 h.用MTT法检测细胞吸光度值(A值)观察细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR、Western blot法分别检测U87细胞中的Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白.结果 培养24、48、72、96 h,A组细胞A值分别为0.185±0.007、0.398±0.012、0.735±0.015、1.083±0.031,B组分别为0.102±0.003、0.130±0.004、0.161±0.006、0.194±0.003,C组分别为0.167±0.005、0.265±0.008、0.496±0.011、0.737±0.016,A、B组与C组比较,P均＜0.05.A、B、C组细胞凋亡率分为0.96％±0.17％、26.51％±3.74％、8.76％±1.40％,A、B组与C组比较,P均＜0.05.与C组比较,A组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著增加(P均＜0.05),B组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著降低(P均＜0.05).结论 Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中发挥了重要的调控作用,其机制可能与调节靶基因Hes1、抗凋亡蛋白Bcl-2表达有关.     

人参皂甙单体Rh2对人脑胶质瘤细胞U251增殖和凋亡的影响及其机制探讨

目的观察人参皂甙单体Rh2（GS-Rh2）对人脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制。方法用GS-Rh2处理人脑胶质瘤U251细胞,采用MTT法检测U251细胞增殖抑制率,流式细胞仪和Annexin V-FITC/PI双染法观察U251细胞凋亡情况,TRAP-ELISA法检测U251细胞端粒酶活性,RT-PCR法检测U251细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA的表达。结果 5、10、20、40、80μg/ml GS-Rh2组U251细胞增殖抑制率分别为20.42%、32.19%、45.09%、57.37%、73.82%。根据细胞增殖抑制曲线计算出IC30、IC50、IC70值分别为9.7、25.2、68.4μg/ml。FITC和PI荧光双参数点图显示实验组细胞分布区域与对照组相比出现明显改变,随着药物浓度的增加,早期凋亡、晚期凋亡或坏死的区域细胞数量逐渐增多。9.7、25.2、68.4μg/ml GS-Rh2处理12、24、48、72 h后U251细胞端粒酶活性随GS-Rh2浓度增加和作用时间的延长而降低。浓度为25.2μg/ml GS-Rh2作用24、48、72 h的U251细胞hTERTmRNA与β-actin灰度值比为0.964 9±0.004 2、0.401 8±0.001 4、0.297 8±0.001 8,对照组为0.976 4±0.005 1。作用48、72 h U251细胞hTERT mRNA与β-actin灰度值比与对照组相比P均〈0.05;作用48、72 h者相比P〈0.05。结论 GS-Rh2能够诱导人脑胶质瘤U25l细胞凋亡,抑制U25l细胞增殖。其机制与其抑制hTERT基因表达,降低端粒酶活性有关。     

RNAi沉默PTTG基因对恶性胶质瘤U251细胞的影响

目的探讨垂体瘤转化基因（PTTG）siRNA干扰质粒对人脑胶质瘤细胞株U251体外增殖、周期和凋亡的影响。方法利用脂质体将pGenesi1-2 PTTG siRNA干扰质粒转染U251细胞，通过MTT法观察转染后24h,48h和72h细胞增殖的变化、流式细胞术PI单染观察转染后48h细胞凋亡和细胞周期的变化。结果pGenesi1-2 PTTG siRNA干扰质粒转染U251细胞48h后。PTTG mRNA和蛋白的抑制率分别约为69％和71％；阻滞U251细胞由G1期进入S期，抑制细胞的生长，增加了细胞的凋亡。结论PTTG siRNA表达载体可以特异高效地抑制胶质瘤U251细胞PTTG基因的表达，从而调控肿瘤细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖。     

中药抗癌灵诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其机制研究

目的 探讨复方中药抗癌灵对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及凋亡相关基因survivin和caspase-3表达的影响.方法 肝癌SMMC-7721细胞,以含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液,在37℃、5%CO2的培养箱中培养,细胞生长至对数增殖期,更换含0、10、20、40 ml/L 抗癌灵新鲜培养液,用DDP(25 mg/L)为阳性对照组,药物作用时间均为48 h.采用MTT法检测细胞抑制率,TUNEL法检测细胞凋亡率,半定量RT-PCR检测survivin和caspase-3 mRNA表达.结果 与正常对照组相比,抗癌灵各浓度组细胞抑制率显著升高(P＜0.001),细胞凋亡率明显上升(P＜0.01),Caspase-3 mRNA表达显著上升(P＜0.05,P＜0.01),Survivin mRNA表达明显下降(P＜0.05,P＜0.01).结论 复方中药抗癌灵具有诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用,其分子机制可能与上调caspase-3和下调survivin基因表达有关.     

香丹注射液对脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡与FADD mRNA表达的影响

目的 研究香丹注射液对脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡及其相关基因表达的影响.方法 线栓法制备脑缺血再灌注大鼠损伤模型,缺血2h后再灌注3、6、12、24h,采用TUNEL检测(原位末端转移酶标记技术)检测细胞凋亡,提取脑组织RNA检测Fas死亡结构域相关蛋白(FADD) mRNA的表达变化.结果 治疗组大鼠缺血再灌注后FADD mRNA表达水平较模型组均降低(P＜0.05),第24小时与假手术组比较无统计学意义(P＞0.05);治疗组大鼠凋亡细胞凋亡率较模型组明显降低(P＜0.01).结论 香丹注射液能降低脑缺血后脑组织中FADD mRNA蛋白的表达,减轻细胞凋亡.     

脑胶质瘤细胞MGMT甲基化状态与细胞对烷化剂耐药性的关系

目的探讨脑胶质瘤细胞O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子甲基化状态与细胞对烷化剂药物(TMZ)耐药性的相关性。方法取处于对数生长期的人脑胶质瘤细胞系U87-MG、T98G和U251,利用MTT法检测不同浓度TMZ对上述三种胶质瘤细胞系的作用。提取细胞基因组DNA,用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测胶质瘤细胞中MGMT基因甲基化状态。结果与对照组(0.1%DMSO)相比,TMZ仅能抑制U87-MG细胞的活性(P0.05),而不能抑制T98G和U251细胞的活性(P0.05);运用MS-PCR检测到U87-MG存在MGMT启动子甲基化,而T98G和U251均不存在MGMT启动子甲基化。结论 U87-MG、T98G和U251人脑胶质瘤细胞系MGMT启动子甲基化状态与细胞对烷化剂的敏感性存在相关性。     

婴幼儿血管瘤组织中Caspase-3和survivin的表达及其与细胞凋亡的关系

目的 探讨凋亡调控基因Caspase-3和survivin在婴幼儿血管瘤组织中的表达及与细胞凋亡的关系.方法 采用原位杂交法检测血管瘤及正常皮肤组织中Caspase-3 mRNA的表达;用免疫组化SP法检测survivin;用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的d-UTP生物素缺口末端标记技术(TUNEL)检测凋亡细胞.结果 Caspase-3 mRNA阳性表达率在增生期和消退期分别48.4%和87.5%,两者相比,P＜0.01,增生期与正常皮肤组织表达相比,P＞0.05.survivin阳性表达率在增生期和消退期分别77.4%和45.8%,两者相比,P＜0.01,消退期与正常皮肤组织相比,P＞0.05.Caspase-3 mRNA和survivin蛋白表达呈负相关(r=-0.018,P＜0.01).婴幼儿血管瘤增生期和消退期凋亡指数(AI)分别为30.15±10.62和80.16±6.88.AI与Caspase-3 mRNA的表达呈正相关(r=0.405,P＜0.01),AI与survivin的表达呈负相关(r=-0.362,P＜0.01).结论 Caspase-3基因与凋亡抑制基因survivin参与了血管瘤中细胞凋亡的调节.     

辛伐他汀体外对人U251脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的观察辛伐他汀体外对人U251胶质瘤细胞增殖及诱导其凋亡的作用。方法对照组和实验组分别行辛伐他汀干预,培养24、48、72、96 h,采用MTT比色法和流式细胞仪检测不同浓度及不同时间干预后人U251胶质瘤细胞增殖活性和细胞周期的变化;采用TUNEL法检测干预后细胞凋亡的情况及RT-PCR检测对照组和实验组在干预48 h后检测Caspase-3的表达。结果辛伐他汀体外可明显降低人U251胶质瘤细胞增殖活性及诱导其凋亡,浓度到达1.0μmol/L时抑制作用明显,与对照组相比具有显著性差异(P0.05)。此外,辛伐他汀对人U251胶质瘤细胞的生长抑制呈明显的量-效关系。人U251胶质瘤细胞凋亡随药物浓度增加而显著,Caspase-3的表达亦呈剂量依赖关系。结论辛伐他汀在体外可一定程度上抑制人U251胶质瘤细胞的增殖及诱导其凋亡,Caspase-3参与细胞的凋亡过程。     

节律基因Bmal1对胃癌细胞BGC-823增殖及凋亡的影响

目的 探讨节律基因Bmal1对胃癌细胞BGC-823增殖及凋亡的影响.方法 构建针对Bmal1序列的shRNA,用脂质体介导转染入胃癌细胞BGC-823,G418筛选稳定细胞株(转染组),同时设对照组(空白组).用克隆形成率检测细胞生长,用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,RT-PCR及Western blot法检测相关基因及蛋白表达.结果 转染组克隆形成率低于对照组(P＜0.05).与对照组比较,转染组Bmal1总凋亡率升高(P＜0.05),其细胞周期再分布出现G1期缩短(P＜0.05),G2期延长(P＜0.05),同时发现Bcl-2 mRNA表达下调(P＜0.05),c-Myc mRNA表达上调(P＜0.05).结论 Bmal1可以抑制胃癌细胞BGC-823增殖,促进细胞凋亡,有可能成为诱导胃癌细胞凋亡的新靶点.     

PRDXⅢ在胶质瘤的表达及其与细胞凋亡的关系

用免疫组化、TUNEL法检测过氧化物酶Ⅲ(PRDXⅢ)在胶质瘤的表达与凋亡,利用RT-PCR法测定PRDXⅢmRNA表达水平.结果胶质瘤与正常脑组织中PRDXⅢ的蛋白表达有明显差异;随胶质瘤病理级别的增高,PRDXⅢmRNA表达也逐渐增强,Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤PRDXⅢmRNA的表达明显高于正常脑组织和Ⅱ级胶质瘤.认为PRDXⅢ可能与肿瘤的生长和恶性表型有关,具有抑制胶质瘤细胞凋亡的作用,从而使其生长加快.     

siRNA下调S100A4基因表达对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨应用小干扰RNA(siRNA)下调人胶质瘤U251细胞中S100A4基因表达和对U251细胞增殖及凋亡的影响。方法脂质体法U251细胞转染化学合成的针对S100A4基因的特异性siRNA,RT-PCR和Western印迹方法分别检测S100A4 mRNA和蛋白表达水平。分别应用CCK-8法、流式细胞术和酶标仪检测下调S100A4表达对U251细胞增殖、凋亡能力及细胞内含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3活性的影响。结果与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA转染48 h后,siRNA-S100A4组细胞中S100A4 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01),U251细胞的增殖受到抑制,细胞凋亡率明显增加(P<0.05),且沉默S100A4表达可以上调caspase-3活性(P<0.01)。结论 S100A4 siRNA能有效下调S100A4基因的表达,抑制U251细胞的增殖,诱导细胞凋亡,参与脑胶质瘤的生物学行为。     

大蒜素对人脑胶质瘤U251细胞侵袭与迁移的影响及其机制探讨

目的探讨大蒜素对人脑胶质瘤U251细胞体外迁移侵袭作用的影响及可能机制,为大蒜素在脑胶质瘤治疗中的应用提供依据。方法用高度纯化的大蒜素制剂处理人脑胶质瘤U251细胞（大蒜素组）,应用划痕试验、Tran—swell迁移与侵袭试验、Westernblotting法测定药物处理后U251细胞迁移、侵袭能力变化以及侵袭相关蛋白MMP2、MMP9表达;并与未做干预的对照组比较。结果大蒜素能明显抑制细胞生长,抑制细胞侵袭与迁移,呈量效和时效关系（P〈0．001）,大蒜素组较对照组明显增加（P〈0．001）,有浓度依赖性。结论大蒜素能抑制U251细胞侵袭与迁移,该抑制作用具有时间、浓度依赖性。其作用机制可能为下调人脑胶质瘤U251细胞MMP2、MMP9表达。     

CXCL8/PI3K-Akt信号通路在缺氧诱导的人脑胶质瘤细胞血管生成拟态中的作用

目的探讨CXCL8/PI3K-Akt信号转导通路在缺氧诱导的人脑胶质瘤细胞株U87MG和U251血管生成拟态中的作用。方法用氯化钴(Co Cl2)模拟缺氧环境,将人脑胶质瘤细胞株U87MG和U251置中培养。分别加入PI3K-Akt信号通路激动剂CXCL8及PI3K-Akt信号通路抑制剂LY294002干预48 h,体外成管实验检测各组细胞成管能力;Western印迹检测各组Akt、P-Akt蛋白的表达情况。结果缺氧可导致U87MG细胞和U251细胞形成的管腔样结构明显增加,Akt蛋白的磷酸化活化表达显著增加(P0.05)。加入CXCL8干预可使管腔样结构直径进一步增长,而加入LY294002干预48 h则可使其管腔样结构在数量和直径上显著少于缺氧组(P0.05)。CXCL8能够有效激活Akt磷酸化,LY294002则显著抑制其磷酸化活化(P0.05),而总Akt蛋白表达无差异(P0.05)。结论 CXCL8/PI3K-Akt信号转导通路在缺氧诱导的人脑胶质瘤细胞株U87MG和U251血管生成拟态中发挥重要的促进作用,可望成为胶质瘤治疗有效靶点。