肺癌靶向血栓蛋白hu3D3V_H-tTF的表达及活性鉴定

目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF,并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因,克隆至表达载体pET22 b(+),在E.coliBL21(DE3)中表达,镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性,凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性,并能活化FⅩ、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,hu3D3VH/tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性,为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。     

增强型绿色荧光蛋白与IgG抗体亲和肽融合蛋白的制备

目的构建、表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与IgG抗体亲和肽融合蛋白,并对其生物学功能进行研究。方法将EGFP基因与IgG抗体亲和肽基因重组,构建原核分泌表达载体pSpA-EGFP-His,通过竞争ELISA和荧光光谱测定,考察其在大肠杆菌中表达产物SpA-EGFP融合蛋白的生物学活性。结果SpA-EG-FP融合蛋白的相对分子质量42kD,与理论值相近,荧光光谱与文献报道一致,且能与SpA-Peroxidase竞争结合反应体系中的兔IgG抗体。结论SpA-EGFP融合蛋白在E.coliDH5α中正确表达,且具有EGFP的荧光特性和与哺乳动物IgG抗体结合的生物学活性。     

葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化

目的构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA-ZZ的pET-32a-ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化。方法用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ,构建重组表达质粒pET32-ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE),并用Q-Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化。结果得到了高效表达SPA-ZZ的pET32-ZZ表达载体,表达产物经SDS-PAGE检测相对分子质量为41 000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白。结论SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA-ZZ的应用奠定了一定的基础。     

肺癌靶向血栓蛋白hu3D3VH-tTF的表达及活性鉴定

目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF，并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因，克隆至表达载体pET22b（＋），在E．coli B121（DE3）中表达，镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性，凝血实验和FX活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH／tTF／pET22b（＋）重组子，融合蛋白在E．coli B121（DE，）中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性，并能活化FX、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH／tTF／pET22b（＋）重组子，hu3D3VH／tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性，为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。     

人源抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的：探讨抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母(P．Pastoris)中的表达以及初步的纯化、活性鉴定方法。方法：用PCR将目的蛋白基因从质粒PGEM7Zf( )-HBScFv-IL-2上扩增出来，再亚克隆到酵母表达载体pPICZaA中，转化P．Pastoris宿主菌GS 115，菌落：PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子，重组酵母经甲醇诱导后，通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物；再通过亲和层析法纯化目的蛋白；用间接ELISA实验鉴定其活性。结果：表达的重组蛋白分子质量约为44ku，表达量可达12％；纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95％；重组融合蛋白能与HBsAg、鼠抗IL-2单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建了抗HBsAg单链抗体与IL-2融合蛋白酵母表达工程菌，并初步建立了对目的蛋白的纯化及活性鉴定方法。     

EGFR/HER2联合多肽表位疫苗的构建及体液免疫学分析

构建以乙肝病毒核心抗原(HBcAg)为载体的带有1个EGFR和2个HER2的模拟B细胞表位多肽的融合表达质粒pET28a/HBcAg-△n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫BALB/c小鼠获得抗目的蛋白的抗体。采用PCR法将3个模拟表位插入HBc序列的第78～79位,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21(DE3)作宿主菌表达出融合蛋白HBHE,纯化后免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的体液免疫应答。测序结果表明,重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白表达正确,ELISA检测到高滴度抗体。以HBcAg为载体的B表位被成功表达和纯化,获得高滴度的与3个B表位结合的抗体,为进一步研究HER家族成员联合多肽表位疫苗的广谱抗肿瘤作用奠定了基础。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因(VH),并构建其原核表达载体.方法 从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出VH cDNA,用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT-PCR产物和原核表达载体pET28a( ),在T4 DNA连接酶作用下室温连接.重组质粒经酶切鉴定,阳性克隆测序并进行序列分析.结果 扩增出VH cDNA片段,大小约为370bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致.VH基因序列长度为366bp,编码122个氨基酸.VH基因属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ亚类.结论 成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因,并成功构建其原核表达载体.     

Daxx-C626-740原核细胞表达载体的构建与诱导表达

目的为了研制Daxx-C抗体并观察其在宫颈癌细胞中的应用效果,构建原核表达载体pET28a／DM626-740,将其在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物,鉴定其抗原性。方法用PRIMER5．0软件设计Daxx-C基因片段（氨基酸626-740）特异性引物,引入BamHl和SalI酶切位点,PCR扩增目的基因。将PCR产物连入载体pMD18-T,构建pMD18-T／DM626-740;然后,将BamHI和Sail酶切产物连入载体pET28a,经酶切鉴定及DNA序列分析后,构建原核表达载体pET28a／DM626-740。将其转化E．coliBL21,IPTG诱导表达,利用Ni琼脂糖凝胶层析柱纯化表达产物,Western-blot检测表达物与纯产物。结果双酶切和DNA测序结果显示,PCR正确扩增了Daxx-C基因片段并成功连入载体pET28a,构建了原核表达载体pET28a／DM626-740,该质粒在E．coli中诱导表达分子量约19kDa目的蛋白,且该蛋白能被抗Daxx抗体检出。结论构建的原核表达载体pET28a／DM626-740能在E.coli中表达目的的蛋白6His-DM626-740,并具有良好的抗原性。     

Fas胞外区基因的构建、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的构建Fas胞外区(eFas)基因的表达载体,表达纯化重组蛋白,进行多克隆抗体的制备,为进一步功能研究奠定基础。方法通过重叠PCR获得eFas基因的编码序列,构建pET-22b(+)/eFas表达载体,转化大肠杆菌Rosetta-gami,IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度。将纯化的eFas融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,通过ELISA方法检测多克隆抗体的效价。结果获得了eFas的编码序列与表达载体,目的蛋白主要在包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度达95%以上。结论eFas融合蛋白基因的构建、表达、纯化以及多克隆抗体的制备,为进一步研究Fas提供了材料。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

融合头的改变对抑制重组抗菌肽毒性的影响

为进一步完善G13结构域的原核表达系统,人工合成编码G13的基因片段,PCR扩增后克隆于原核表达载体pET28a中,构建的重组质粒pET28a-G13转化于E.coli BL21(DE3)中.另外对pET28a-G13进行突变,改变其G13片段N端上游处的融合头的电荷数,转化于E.coli BL21(DE3)中.构建pThiohisA突变体并与pET28a-G13共转化于E.coli BL21(DE3)中.用诱导剂诱导所构建的各个工程菌,然后比较A_(600)值变化及蛋白表达量,分析不同的融合头对G13毒性抑制效果,发现融合头对G13毒性抑制效果与其净负电荷数及酸性氨基酸的相对位置有关.     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

舟山眼镜蛇毒细胞毒素的克隆及原核表达

目的构建舟山眼镜蛇毒细胞毒素（Cytotoxin,CTX）原核表达载体（pET42α（＋）-CTX）,并在大肠杆菌中表达CTX重组蛋白。方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素（CTX）,测定N-末端氨基酸序列并据此设计引物,以提取的舟山眼镜蛇毒腺总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增细胞毒素基因序列（CTXcDNA）。将CTXcDNA定向克隆到原核表达载体pET42α（＋）中,双酶切图谱、PCR和DNA测序鉴定,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导,SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物,GSTrap FF亲和层析纯化融合蛋白CTX;Western-blotting鉴定。结果成功合成CTXcDNA,并构建原核表达质粒pET42α（＋）/GST-CTX,在大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中表达融合蛋白CTX,SDS-PAGE凝胶浓度扫描显示表达量占菌体总蛋白的28.9%,Western-blotting证实纯化蛋白为重组CTX融合蛋白（rCTX）。结论成功构建CTX基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得rCTX具有眼镜蛇毒CTX的抗原性。     

HPV6bL1-TpN15嵌合基因原核表达系统的构建

目的 分别从梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)临床菌株和尖锐湿疣(cA)组织中扩增人乳头瘤病毒(HPV)6b型L1和TpN15基因,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因及其原核表达系统.方法 采用PCR分别从CA组织及Tp临床菌株中扩增HPV6b L1和TpN15基因片段,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)构建重组质粒pET32a(+)/HPV6b L1-TpN15,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21 (DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后表达的融合蛋白用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、蛋白质印迹法分析鉴定.结果 HPV6b L1-TpN15融合蛋白在原核表达系统中得到了较高表达.结论 原核表达的HPV6bL1-TpN15融合蛋白具较强的抗原性.     

pET15b-pep-1-p27mt的构建、表达及意义

构建细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)PEP-1和细胞周期抑制蛋白p27mt的重组体,并在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因,克隆入pET15b-pep-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性的表达。PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡提供了理论基础。     

重组蛋白A在大肠杆菌中的分泌表达及活性测定

利用大肠杆菌表达系统表达金黄色葡萄球菌蛋白A,根据大肠杆菌密码子偏好性对金黄色葡萄球菌蛋白A的基因序列进行密码子优化,在N端加入L-门冬酰胺酶(L-AsPsII)信号肽简并基因序列使其分泌表达,将全合成的蛋白A基因片段插入到pET-28a载体中,转化入BL21(DE3)。乳糖诱导使其表达,其中80%以上目的蛋白位于胞外,表达量达到375 mg/L,剩余目的蛋白位于周质。将胞外目的蛋白超滤浓缩,通过DEAE阴离子交换剂,一步纯化后得到的蛋白,在SDS-PAGE上显示为约32 k的单一条带,纯度达95%以上。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白A活性较高,能与小鼠、兔及羊IgG抗体高效结合,且沸水煮10 min后仍能保持同IgG结合的活性。     

PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建PML-RAR o[融合基因相关重组表达质粒,在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)以PML-RAR α全长质粒为模板分别扩增出长度均为1 200 bp的PML和RAR o[序列,并将它们分别插入PET32a(+)质粒中,构建重组表达质粒,化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆,菌落PCR筛选阳性转化子,双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性.正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a(+)和Flag-RARα-PET32a(+).将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用表达蛋白的组氨酸“标签”(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质.结果 PCR扩增获得目的基因,重组表达质粒经EcoRI/HindⅢ双酶切和测序鉴定证明构建正确.转化感受态BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白.结论 成功构建重组表达质粒,并经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步的抗体制备等实验奠定了基础.