GST-hSesn2融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建GST-h Sesn 2融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法从COS-7细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hSesn2基因全长,通过BamHI和SalI酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hSesn2,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDSPAGE电泳和Western blot鉴定。结果酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒GST-h Sesn2,并用Western blot方法证实了GST-h Sesn2融合蛋白在原核细胞大肠埃希菌中阳性表达。结论 GST-h Sesn2原核表达载体成功构建为进一步纯化Sesn2及研究其结构与功能提供了前提基础。     

GST-hVinexin融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建GST-hVinexin融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法从COS-7细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hVinexin基因全长,通过BamHI和SalI酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hVinexin,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。结果电泳后酶切结果证实hVinexin大小为990bp,测序证明成功构建了原核表达质粒GST-hVinexin,并诱导表达GST-hVinexin融合蛋白,进一步用Western blot方法验证了其融合蛋白的表达。结论成功构建了GST-hVinexin原核表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌表达,为进一步纯化Vinexin及研究其结构与功能提供了前提基础。     

组蛋白脱乙酰化酶GST-HDAC1融合蛋白载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建GST-HDAC1融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法以质粒pcDNA3.1- HDAC1为模板进行PCR,通过EcoR1单酶切位点将HDAC1插入p GEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-HDAC1,并转化点coli DH5 α,通过利用载体上的BamH1酶切位...     

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RUNX3为模板,通过Kpn1和Xho1酶切位点将RUNX3定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3,并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coliBL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果双酶切获得1300bp片段,证明RUNX3片段被成功导入pGEX-4T-2,并在测序后与GenBank进行同源性比对,比对进一步证实原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3构建成功,并用IPTG诱导,SDS-PAGE方法证实了GST/RUNX3融合蛋白在大肠杆菌中的表达。结论成功构建了RUNX3原核表达载体,并证实了融合蛋白在大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化RUNX3蛋白和研究RUNX3的生物学功能奠定了基础。     

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达

目的 构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 利用Kpn1和Xho1位点酶切pcDNA3.1-RUNX3质粒,将获得的1300bp RUNX3编码序列插入到pGEX-4T-2中,构建pGEX-4T-2-RUNX3质粒,并转化Ecoli DH5α,筛选阳性重组子,酶切鉴定和...     

人钾离子通道调节蛋白的原核表达及纯化

目的:探讨人钾离子通道调节蛋白(KCNRG)的原核表达体系和纯化条件,为该蛋白的功能机制研究提供工具。方法:以pc DNA3. 1-KCNRG-2ex重组质粒为模板,采用特异引物扩增KCNRG基因编码区。PCR产物双酶切后克隆入p ET28a-MBP-His和p GEX-4T-1载体中。重组的p ET28a-KCNRG-MBP-His和p GEX-4T-1-KCNRG质粒转化Top10感受态细胞。鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化Rosetta(DE3)蛋白表达菌株,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western blot检测重组融合蛋白的表达。结果:PCR扩增产物长度为819 bp。经双酶切和测序,鉴定重组质粒p ET28a-KCNRG-MBP-His和p GEX-4T-1-KCNRG构建成功。SDS-PAGE检测,KCNRG-MBP融合蛋白在菌液的上清中表达,KCNRG-GST融合蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot检测,重组KCNRG-MBP蛋白和重组KCNRG-GST蛋白分别能被抗6×His抗体和抗GST抗体识别。经镍柱亲和层析纯化,获得纯化的KCNRG-MBP融合蛋白(凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度90%)。结论:成功构建重组质粒p ET28a-KCNRG-MBP-His,并实现KCNRG-MBP融合蛋白的可溶性原核表达。     

白斑综合症病毒极早期蛋白IE3的原核表达、纯化和鉴定

目的:构建对虾白斑综合症的极早期基因IE3的原核表达载体,制备纯化重组蛋白IE3。方法:以感染白斑综合症病毒的对虾心脏组织为模板,PCR法扩增极早期基因IE3基因的编码序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX-4T-2-IE3。质粒经双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达GST-IE3融合蛋白,并利用SDS-PAGE和Western blot对表达的蛋白进行鉴定。结果:PCR产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是IE3,DNA序列测定进一步证实与GenBank报道的序列完全一致。成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-2-IE3,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约33000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白。结论:成功构建了重组表达载体pGEX-4T-2-IE3,并表达出重组蛋白GST-3。为进一步研究对虾白斑综合症的防治提供了平台。     

重组人BMP-2的基因克隆及原核表达

目的 构建重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)的原核表达质粒并在大肠埃希菌中诱导表达.方法 采用RT-PCR法,从骨髓细胞总RNA中扩增获得人BMP-2成熟肽cDNA,将其克隆入表达载体pBV220,构建BMP-2的重组原核表达质粒.重组质粒经酶切和测序鉴定后,在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白,表达产物采用Western印迹和ELISA进行鉴定.结果 测序表明,重组基因序列与人BMP-2成熟肽基因完全一致.Western印迹和ELISA检测显示,表达产物的相对分子量(Mr)与预期结果相符,与相应抗体有结合活性.结论 获得了人BMP-2成熟肽的编码基因,并构建了含有该基因的重组质粒pBV220/BMP-2,在大肠埃希菌中可高效表达人BMP-2.     

尿激酶型纤溶酶原激活因子cDNA的克隆与原核表达

目的构建尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21中表达,为进一步研究uPA奠定基础。方法应用逆转录RT—PCR,从人肝细胞cDNA中扩增人尿激酶型纤溶酶原激活因子基因序列,与原核表达质粒pET32a重组,获得表达质粒uPA—pET32a。用氨苄青霉素平板筛选转化子。双酶切与DNA测序进行鉴定,用IPTG诱导表达,并用Westernblotting进行鉴定。结果从肝细胞cDNA中扩增的uPA基因片段长1296bp,酶切及DNA测序证实uPA-pET32a重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为68900Mr,经Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒uPA—pET32a。并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期的相一致．为进一步的研究奠定了基础。     

VLDL-R配体结合结构域的克隆与表达

目的构建含VLDL-R配体结合结构域融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达与纯化。方法利用PCR技术扩增LBR1-8的DNA片段,将其克隆至原核表达载体pET28a( )中,随后将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌Rosetta中,利用IPTG诱导蛋白表达并优化其表达条件,表达产物经Ni -NTA亲和层析柱纯化回收,并采用SDS-PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR,酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主经过IPTG诱导成功表达了LBR1-8,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建pET28a( )-LBR1-8表达质粒,表达并经纯化得到了LBR1-8。     

重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN(1～4)的构建及表达

目的 将人类Tudor-SN(tudor staphylococcal nuelease)蛋白SN(1～4)基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与(;"蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN(1～4)重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN(1-4)质粒成功构建和表达.     

单纯疱疹病毒Ⅰ和Ⅱ型共同抗原gD在大肠埃希菌中的重组表达

目的克隆人单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ(HSV-Ⅰ、Ⅱ)型共同性抗原gD基因,构建重组表达载体pMAL-c2/gD,诱导融合蛋白MBP-gD的表达.方法提取病毒DNA,PCR扩增出gD基因,克隆于原核表达载体pMAL-c2并转化大肠埃希菌DH5α.PCR、双酶切及测序证实插入的gD基因序列正确后,IPTG诱导表达融合蛋白MBP-gD,并进行免疫学鉴定.结果构建的重组表达质粒pMAL-c2/gD在大肠埃希菌中能高效表达.经SDS-PAGE分析,表达产物约占菌体总蛋白35.5%,其中39%以可溶蛋白形式存在于胞质中,61%以包涵体形式存在.结论构建了pMAL-c\+2/gD表达质粒,Western blot证实,HSV-Ⅰ gD单克隆抗体DL6可特异识别表达的gD蛋白,该蛋白具有天然gD的抗原性.     

人八聚体结合蛋白4(Oct4)cDNA的克隆及其在大肠杆菌和HEK293T细胞的表达

目的克隆人八聚体结合蛋白4(Oct4)c DNA,研究其在原核及真核系统中的表达。方法提取人宫颈癌He La细胞中的总RNA,经反转录PCR获得c DNA,PCR扩增Oct4 c DNA并将其分别克隆入表达载体p ET-22b(+)原核质粒和pc DNATM3.1(+)真核质粒,构建含该序列的重组原核表达载体p ET-22b(+)-Oct4和真核表达载体pc DNA3.1(+)-his-Oct4。然后分别进行双酶切和测序鉴定。前者在E.coli BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至HEK293T细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测细菌和细胞中OCT4蛋白的表达水平。结果 PCR扩增得到约1100 bp目的 DNA片段;重组表达质粒p ET-22b(+)-Oct4和pc DNA3.1(+)-his-Oct4经双酶切鉴定和测序分析证明载体构建成功;p ET-22b(+)-Oct4经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达后SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主E.coli BL21(DE3)中高效表达OCT4融合蛋白,相对分子质量(Mr)约38 000,与其理论Mr基本相符;pc DNA3.1(+)-his-Oct4转染HEK293T细胞经Western blot法检测,证实导入的Oct4成功表达。结论在大肠杆菌和HEK293T细胞成功表达OCT4蛋白。     

程序死亡蛋白1基因的克隆及原核表达

目的 克隆人程序死亡蛋白(PD-1)基因并构建PD-1蛋白的原核表达质粒,在大肠埃希菌中进行表达.方法 用RT-PCR的方法从慢性乙肝患者外周血淋巴细胞总RNA中逆转录得到PD-1基因的cDNA,构建PD-1基因的原核表达质粒,在大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达并纯化.用SDS-PAGE、DNA测序、氨基酸测序等方法对表达蛋白进行鉴定.结果 克隆到PD-1基因编码区全长序列cDNA,经DNA测序与已报道的序列同源性达99.8%.构建得到PD-1的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达,纯化获得纯度较高的PD-1蛋白.氨基酸测序证明表达蛋白的正确性.结论 成功克隆人PD-1基因,在大肠埃希菌中获得表达,得到纯化的PD-1蛋白,为进一步研究PD-1蛋白的功能及应用打下基础.     

人外周血CD8＋T细胞Runx3的基因克隆及其原核表达

目的:克隆人Runx3基因全长编码区的cDNA,进行鉴定和测序分析,并利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人Runx3基因全长序列,为从转录水平探讨Runx3基因与免疫相关性疾病以及肿瘤发生发展的关系奠定基础.方法:MACS分离外周CD8+T细胞;采用RT-PCR方法从人外周血CD8+T细胞获得Runx3基因的cDNA,并连接pMD19-T载体导入大肠埃希菌DH5α,选择阳性克隆,应用M13 F/R通用引物进行双向反应测序,以作序列鉴定.利用PCR技术从克隆载体pMD19-T/Runx3获得人Runx3的全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pQE30,形成重组表达质粒pQE30/Runx3;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌M15,测序鉴定后经IPTG 30%诱导4 h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白并进行Western blot鉴定.结果:扩增获得的Runx3基因CDS区全长1 248 bp,编码415个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致.成功构建了原核表达载体pQE30/Runx3,并在工程菌M15中获得大量表达.结论:获得了人Runx3基因的克隆,并成功原核表达和制备出人Runx3融合蛋白.     

转移相关基因ABCE1编码蛋白的表达及鉴定

目的构建谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的ATP结合盒转运子E1(ABCE1)基因的原核表达载体pGEX-4T-1-ABCE1,通过转化技术,诱导GST-ABCE1重组蛋白表达。方法通过基因克隆技术构建融合ABCE1基因的原核表达载体,经酶切和测序等方法进行检测。通过转化技术,在E.coli BL21(DE3)中诱导GST-ABCE1重组融合蛋白表达。经酶切,Western blot和质谱测序等方法对该重组蛋白进行鉴定。结果 ABCE1基因片段成功插入pGEX-4T-1原核表达载体中,双酶切和测序后,经Gen Bank blast比对验证,证实ABCE1基因插入载体部位正确,碱基序列正确。凝血酶酶切检测重组蛋白GST-ABCE1得到72 000大小的特异条带,该条带可以被ABCE1抗体识别,质谱检测得到ABCE1蛋白的特异性序列,该序列评分138分(P0.05)。结论 pGEX-4T-1-ABCE1原核表达载体质粒构建成功,并成功诱导GSTABCE1重组蛋白表达,为继续研究ABCE1在肺癌中的作用机制奠定基础。     

单纯疱疹病毒I和Ⅱ型共同抗原gD在大肠埃希菌中的重组表达

目的 克隆人单纯疱疹病毒I、Ⅱ（HSV－I、Ⅱ）型共同性抗原gD基因，构建重组表达载体pMAL-c2/gD,诱导融合蛋白MBP－gD的表达。方法 提取病毒DNA，PCR扩增出gD基因，克隆于原核表达载体pMAL-c2并转化大肠埃希菌DH5α。PCR、双酶切及测序证实插入的gD基因序列正确后，IPTG诱导表达融合蛋白MBP－gD，并进行免疫学鉴定。结果 构建的重组表达质粒pMAL-c2/gD在大肠埃希菌中能高效表达。经SDS－PAGE分析，表达产物约占菌体总蛋白35．5％，其中39％以可溶蛋白形式存在于胞质中，61％以包涵体形式存在。结论 构建了pMAL-c^2/gD表达质粒，Western blot证实，HSV－I gD单克隆抗体DL6可特异识别表达的gD蛋白，该蛋白具有天然gD的抗原性。     

GST-hMunc18-1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建hMunc18-1的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:从人HEK293细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hMunc18-1基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-6p-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-6p-1-hMunc18-1。异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在E.coli BL21大肠杆菌中诱导GST-hMunc18-1融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western Blot鉴定结果。结果:hMunc18-1编码序列克隆至pGEX-6p-1载体中,双酶切鉴定片段大小为1785 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为67 000 Da,成功纯化出GST及GST-hMunc18-1蛋白,Western Blot检测到蛋白表达。结论:成功地构建了hMunc18-1基因原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化Munc18-1及研究其结构与功能奠定了基础。     

HSV-1 UL15 exon-Ⅱ的原核表达及抗体制备

目的 构建pQE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ原核表达载体,在大肠埃希菌中高效表达并免疫家兔制备抗体.方法 以HSV-1感染后的Vero细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增HSV-1 UL15 exon-Ⅱ基因,克隆入原核表达载体pQE-31;重组质粒经酶切、测序鉴定无误后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;SDS-PAGE检测蛋白表达情况;表达蛋白用Ni-NTA亲和层析纯化及透析复性处理后免疫家兔制备特异性抗体,抗体的免疫原性用Western blotting进行检测.结果 通过RT-PCR扩增获得了HSV-1 UL15 exon-Ⅱ全长基因;构建的pOE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ重组质粒经酶切及测序鉴定无误;阳性转化菌株经WIG诱导后SDS-PAGE电泳显示表达蛋白的相对分子质量约为43 000,与理论值一致,蛋白表达率约为35%～40%;表达蛋白经纯化及透析复性后免疫家兔获得的抗血清经Western blotting鉴定具有较好的特异性和敏感性.结论 成功构建了pQE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ原核表达载体,诱导蛋白表达并进一步用表达的蛋白制备了特异性抗体,为HSV-1末端酶全长基因表达情况的鉴定及最终构建抗病毒组装药物的分子筛选模型奠定了前期实验基础.     

小鼠B7-DC胞外段原核表达载体的构建及表达

目的: 构建小鼠B7-DC胞外段基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21中诱导表达.方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(DC)中提取总RNA, 经RT-PCR扩增B7-DC胞外段, 并将其克隆至原核表达载体pET32a( )中, 构建重组表达质粒pET32a( )-B7-DCECD.重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达目的蛋白, 并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7-DC胞外段基因, 经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的B7-DC胞外段蛋白.结论: 成功地构建了小鼠B7-DC胞外段基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中进行表达, 为进一步研究B7-DC的功能奠定实验基础.