达格列净对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞凋亡及氧化应激的影响

目的:探讨达格列净对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞(HRVECs)凋亡、氧化应激的影响及其对FOXO4的调控作用.方法:采用高糖诱导HRVECs建立细胞损伤模型(高糖组),实验分组:高糖+达格列净低剂量组(1ng/L)、高糖+达格列净中剂量组(5ng/L)、高糖+达格列净高剂量组(10ng/L)、高糖+达格列净高剂量+p...     

高糖条件下miR-615-5p对人视网膜内皮细胞的影响研究

目的 探讨高糖条件下miR-615-5p对人视网膜内皮细胞(hRECs)迁移能力、成管能力、愈合能力的影响及其机制.方法 取对数生长期的hRECs,将细胞分为低糖(LG)组、高糖(HG)组、miR-615-5p模拟物(mimic)组、miR-615-5p模拟物阴性对照(mi-nc)组、miR-615-5p抑制剂(inh...     

FOXO4对高糖环境下视网膜血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响

目的：研究叉头框转录因子O4(FOXO4)对高糖环境下视网膜血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响。

方法：以高糖培养人视网膜血管内皮细胞,Real-Time PCR和Western blot检测细胞中FOXO4表达变化。以FOXO4 RNAi慢病毒、对照载体慢病毒感染视网膜血管内皮细胞,以高糖培养液培养,Real-Time PCR和Western blot检测干扰效率。收集培养液上清和细胞,用试剂盒检测培养液上清中超氧化物歧化酶(superoxide orgotein dismutase,SOD)活性、丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量和细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。流式细胞术测定细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表达变化。

结果：高糖处理后的视网膜血管内皮细胞中FOXO4表达上调,FOXO4 RNAi慢病毒感染下调高糖环境下视网膜血管内皮细胞中FOXO4表达水平,对照载体慢病毒对细胞中FOXO4表达水平没有影响。高糖诱导视网膜血管内皮细胞中ROS水平升高,降低细胞培养液中SOD活性,提高MDA含量,增加细胞凋亡率,促进细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达。下调FOXO4表达的视网膜血管内皮细胞经高糖诱导后,细胞培养液中的SOD活性升高,MDA水平降低,细胞中ROS水平降低,细胞凋亡减少,细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平降低,与未干扰FOXO4表达的视网膜血管内皮细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：高糖诱导视网膜血管内皮细胞表达FOXO4,敲低其表达降低高糖诱导的细胞氧化应激和凋亡水平。     

银杏叶提取物对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞增殖、凋亡的影响

目的:研究不同浓度的银杏叶提取物(ginkgo biloba ex-tract,GBE)对体外培养的高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells,HRCECs)增殖和凋亡的影响。方法:体外培养从角膜移植术后新鲜人眼球提取的HRCECs。取生长良好的第3～4代细胞用于实验,实验分为低糖对照组、高糖对照组、高糖+不同浓度GBE组,用噻唑蓝(MTT)比色法检测HRCECs的增殖。吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)荧光双染色、流式细胞术检测HRCECs的凋亡率,并在荧光显微镜下观察荧光染色后HRCECs凋亡形态学改变。结果:MTT比色法结果显示:用12.5,25.0,50.0,100.0mg/L的GBE处理高糖环境下HRCECs,作用24,48,72h,高糖+不同浓度GBE组与高糖对照组相比具有显著性差异(P<0.05),高糖+不同浓度GBE组之间两两比较均具有显著性差异(P<0.05)。AO/EB荧光染色法、流式细胞术检测细胞凋亡率显示:高糖+不同浓度GBE组与高糖对照组比较均有显著性差异(P<0.05),高糖对照组显著高于低糖对照组(P<0.05)。荧光显微镜下观察到活细胞,早期凋亡细胞,晚期凋亡细胞,非凋亡的死亡细胞生物学形态改变的特征。结论:GBE促进高糖环境下HRCECs的增殖,抑制其凋亡。     

miR-221对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡的作用机制

目的：研究miR-221对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞(HRCECs)凋亡的影响，并探讨其作用机制。

方法：用葡萄糖30mmol/L处理HRCECs 48h建立高糖诱导的HRCECs细胞； 将HG+miR-NC组(转染miR-NC)、HG+miR-221组(转染miR-221 mimics)、HG+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、HG+anti-miR-221组(转染anti-miR-221)、HG+miR-221+pcDNA 3.1组(共转染miR-221 mimics和pcDNA 3.1)、HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2组(共转染miR-221 mimics和pcDNA 3.1-MDM2)，用脂质体法转染至HRCECs细胞，再进行高糖处理； qRT-PCR法检测细胞中miR-221、p53、MDM2的表达； Western blot检测细胞中p53、MDM2的蛋白表达； 流式细胞术检测细胞的凋亡。

结果：与NG组相比，高糖诱导的HRCECs细胞中miR-221、p53的表达显著升高，MDM2的表达显著降低，细胞凋亡率显著升高； 过表达miR-221可使高糖诱导的HRCECs细胞的凋亡率升高更明显，抑制miR-221可下调高糖诱导的HRCECs细胞的凋亡并下调p53，上调MDM2； 过表达MDM2则可逆转抑制miR-221对高糖诱导的HRCECs细胞的抗凋亡作用及对p53、MDM2的调控。

结论：miR-221可促进高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡，其机制与p53/MDM2信号通路有关。     

沉默GFAP基因调控高糖诱导的视网膜微血管内皮细胞增殖与凋亡

目的：研究沉默胶质纤维酸性蛋白(GFAP)基因对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)增殖和凋亡的影响及其机制。

方法：采用qRT-PCR法检测高糖(30mmol/mL)和低糖(5mmol/mL)处理的hRMECs中GFAP的表达。通过慢病毒介导法建立GFAP基因稳定沉默的高糖诱导的hRMECs细胞模型,用SRI-011381(TGF-β信号通路特异性激活剂)、二甲基亚砜(DMSO)处理该细胞模型,采用Western blot法检测细胞中GFAP、转化生长因子-β1(TGF-β1)、转录激活因子2(Smad2)、Smad3蛋白的表达,并分别采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。

结果：高糖处理的hRMECs中GFAP表达水平显著升高。通过慢病毒介导法可成功构建GFAP基因沉默的高糖诱导的hRMECs细胞模型,且沉默GFAP后,细胞的增殖能力明显提高,凋亡率明显抑制,TGF-β信号通路关键基因TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表达均明显抑制,而激活TGF-β信号通路可逆转沉默GFAP对高糖诱导的hRMECs细胞的增殖促进和凋亡抑制作用。

结论：沉默GFAP基因可促进高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞增殖,抑制细胞凋亡,其机制可能与TGF-β信号通路失活相关。     

miR-146a对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞增殖和新生血管生成的影响及其机制

目的　探讨miR-146a对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）增殖和新生血管生成的影响及其机制。方法　选取对数生长期的HRMEC,将细胞分为正常组、高渗组、高糖组、阴性对照组、miR-146a mimics组、miR-146a mimics+IL-17A组。正常组细胞用含5.5 mmol·L^-1 D-葡萄糖的培养基培养24 h,高渗组细胞用含5.5 mmol·L^-1 D-葡萄糖和50 mmol·L^-1甘露醇的培养基培养24 h;其余各组细胞先用含30 mmol·L^-1 D-葡萄糖的培养基培养24 h后,阴性对照组、miR-146a mimics组、miR-146a mimics+IL-17A组分别转染阴性对照序列+pcDNA3.1空质粒、miR-146a mimics质粒、miR-146a mimics+pcDNA3.1-IL-17A质粒。采用MTT法检测细胞活力,细胞划痕实验检测细胞迁移活性,Matrigel法检测细胞管腔形成情况,Western blot法检测相关蛋白表达。结果　与正常组相比,高糖组细胞活力、细胞迁移率和细胞环状结构数量均升高,VEGF、VEGF受体2、白细胞介素-17A、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT)蛋白表达亦均升高（均为P<0.05）;而miR-146a mimics组上述指标则较高糖组均降低（均为P<0.05）;miR-146a mimics+IL-17A组上述指标均高于miR-146a mimics组（均为P<0.05）。结论　上调miR-146a表达可有效地降低高糖诱导的HRMEC增殖和新生血管生成,其作用机制可能与降低IL-17A表达进而抑制PI3K/AKT通路激活有关。     

miR-519d-3p靶向HIF-1α抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能障碍及血管生成

目的:明确miR-519d-3p对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)功能障碍与血管生成的影响,并阐明其对低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的调控机制。方法:通过5、30mmol/L葡萄糖分别诱导HRMEC建立正常(NG)和高糖(HG)细胞模型。将HRMEC分为对照组(HG细胞模型转染阴性对照模拟物)、甘露醇组(对照组加入25mmol/L甘露醇)、miR-519d-3p过表达组(HG细胞模型转染miR-519d-3p模拟物)、miR-519d-3p联合HIF-1α过表达组(HG细胞模型共转染miR-519d-3p模拟物和HIF-1α过表达载体)。实时荧光定量PCR法检测各组miR-519d-3p的表达情况。Western blotting法检测各组HIF-1α蛋白的表达情况。荧光素酶报告基因实验检测miR-519d-3p和HIF-1α的结合位点情况。CCK-8法检测各组细胞增殖情况。Hoechst 33342染色法检测各组细胞凋亡情况。ELISA法检测各组细胞外液炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6蛋白的表达情况。小管形成实验检测各组新生...     

高糖诱导培养的牛视网膜血管周细胞凋亡

目的探讨高糖对牛视网膜血管周细胞的影响。方法将不同浓度的葡萄糖与周细胞孵育5d，应用四唑盐比色试验描绘高糖状态下牛视网膜血管周细胞数目。应用Tunnel法和透射电镜研究高糖培养对的牛视网膜血管内皮细胞的影响。结果高糖以剂量依赖的方式抑制周细胞的增殖。电镜下，高糖培养的周细胞内发现典型的凋亡小体。高糖培养的周细胞Tunnel阳性细胞显著增加。结论高糖能减少牛视网膜周细胞数目，其机制可能在于其诱导了周细胞的凋亡。     

高糖条件下血管内皮细胞增殖与凋亡的研究

目的 观察高糖对血管内皮细胞增殖、凋亡的影响。 方法 用高糖(10、20、30、40、50 mmol/L)作用培养的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),第2、4、6、8、10、12、14 d,用氚-标记脱氧胸苷(tritium-labelled thymidine deoxyribose,³H-TdR)掺入法测定每分钟计数(counts per minute,cpm),流式细胞术检测细胞的凋亡指数、增殖指数及细胞周期变化。 结果 高糖作用下,HUVEC cpm值和增殖指数低于对照组(P<0.05),凋亡指数高于对照组(P<0.05),随作用浓度增加、时间延长更为明显。各高糖组G-1期细胞百分率升高,S期百分率降低(P<0.05)。 结论 高糖使培养的HUVEC凋亡加速,同时抑制了细胞增殖。细胞可能被阻滞在G-1/S转变期。(中华眼底病杂志,2000,16:177-180)     

miR-218在高浓度葡萄糖诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞凋亡中的作用

目的 探讨miR-218 在高浓度葡萄糖诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞(rat retinal microvascular endothelial cells,rRMECs)凋亡中的作用及其相关机制.方法 将rRMECs 分为对照组、高糖组、miR-218 阴性抑制组和miR-218 抑制组.对照组细胞用DMEM低糖培养...     

脂联素对高糖条件下视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的作用

目的：观察脂联素(APN)对高糖培养条件下恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A细胞)增殖、迁移和管腔形成的影响。

方法：将体外培养的RF/6A细胞随机分为空白对照组(正常培养基培养)、甘露醇对照组(含20mmol/L甘露醇的培养基培养)、高糖组(含25mmol/L D-葡萄糖的培养基培养)和高糖+APN组(含25mmol/L D-葡萄糖+10μg/mL APN的培养基培养)。分别采用CCK-8法检测细胞增殖,Transwell小室检测细胞迁移,基质胶(Matrigel)法检测细胞管腔形成能力。

结果：空白对照组与甘露醇对照组细胞增殖率(100.00%±0.00% vs 99.09%±0.46%)、迁移数(121.60±6.02个 vs 119.60±9.39个)及管腔形成数(12.11±0.84个 vs 12.22±0.96个)均无差异(P>0.05)。高糖组细胞增殖率(71.42%±2.29%)明显低于空白对照组和甘露醇对照组,细胞迁移数(144.20±9.65个)和管腔形成数(16.00±2.90个)均明显高于空白对照组和甘露醇对照组(P<0.05)。高糖+APN组细胞增殖率(90.87%±1.68%)明显低于空白对照组和甘露醇对照组,明显高于高糖组; 细胞迁移数(73.00±6.04个)和管腔形成数(7.89±0.38个)均明显低于空白对照组、甘露醇对照组及高糖组(P<0.05)。

结论：APN可以促进高糖条件下RF/6A细胞存活及增殖,抑制细胞迁移和管腔形成,提示APN对高糖导致的RF/6A细胞损伤具有一定的保护作用,抑制病理刺激条件下的血管生成。     

视网膜血管内皮细胞高糖模型糖浓度及培养时间的筛选

目的:筛选Wistar大鼠视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells,RVEC)高糖模型糖浓度及培养时间.方法:取出生1～3d的Wistar大鼠,分离RVEC进行原代培养,Ⅷ因子抗体免疫组化鉴定细胞;设立葡萄糖浓度0mmol/L为正常对照组(C组),按不同葡萄糖浓度依次分为10mmol/L(A组)、15mmol/L(B组)、25mmol/L(D组)、35 mmol/L(F组),分别在24、48、72h的3个时间点用MTT法检测各组细胞OD值,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.结果:RVEC纯度达94％;MTT法检测不同浓度葡萄糖对Wistar大鼠RVEC的影响:培养24h,各组的OD值比较差异无统计学意义(F=0.42,P=0.7411);培养48h,五组OD值比较差异有统计学意义(F=45.2,P=0.000),五组间两两比较,除A组、B组、C组间差异无统计学意义外(Q48AB=44.0427,Q48AC=36.4701,Q48BC=27.7953,均P＞0.05),其余各组两两比较差异均有统计学意义(其中Q48CF=11.0715,Q48AF=14.0794,Q48AF=12.2964,Q48BD=23.4698,Q48BF=12.7016,Q48DF=10.2013,均P＜0.05;Q48CF=6.4701,P＜0.01).培养72h后,五组OD值比较差异有统计学意义(F=37.46,P=0.000),五组间两两比较,同样A、B、C三组间差异无统计学意义(Q72AB=27.7338,Q72AC=25.0054,Q72BC=33.3797,均P＞0.05),其余各组差异均有统计学意义(其中Q72AD=13.4793,Q72BD=12.7546,均P＜0.05;Q72CD=7.3743,Q72Cr=8.3465,Q72AF=4.7455,Q72BF=3.9471,Q72DF=3.2649,均P＜0.01).不同浓度葡萄糖在不同时间点对RVEC凋亡率的影响:培养24h后各组间差异无统计学意义(P＞0.05).培养48h后,五组间两两比较,Q48AB=31.1704,Q48AC=33.5947,Q48BC=29.3968,Q48AD=30.4097,Q48BD=28.8164,均P＞0.05;Q48CF=12.5032,Q48AF=11.7531,Q48BF=14.1076,Q48DF=13.9372,均P＜0.05;Q48CF =7.0953,P＜0.01.培养72h后,五组间两两比较,Q72AB=26.3392,Q72AC=24.9142,Q72BC=30.2976,均P＞0.05,其余各组差异均有统计学意义(其中Q72AD=14.1983,Q72BD=12.9356,均P＜0.05;Q72CD=6.8752,Q72CF=7.6745,Q72AF=5.0545,Q72BF=4.0741,Q72DF=3.8876,均P＜0.01).结论:葡萄糖浓度为25mmol/L培养48h是RVEC高糖模型最佳葡萄糖浓度及干预时间.     

葛根素对体外培养的视网膜血管内皮细胞增殖的影响

目的观察不同浓度葛根素对体外培养的视网膜血管内皮细胞增殖的影响。方法取第7代牛视网膜血管内皮细胞用于实验。葛根素组中加入含不同浓度葛根素的培养液,对照组加入等量空白培养液。24h及48h后采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测视网膜血管内皮细胞的增殖情况。结果与空白对照组比较,0.05mg·L-1、0.50mg·L-1、5.00mg·L-1、50.00mg·L-1和500.00mg·L-1葛根素组作用24h及48h后视网膜血管内皮细胞增殖明显。24h葛根素组OD值(按照葛根素浓度由低到高分别为:0.283±0.060、0.337±0.030、0.349±0.030、0.405±0.030、0.352±0.020)明显高于对照组(0.161±0.060),差异均有统计学意义(均为P<0.01);48h葛根素组OD值(按照葛根素浓度由低到高分别为:0.371±0.030、0.377±0.040、0.410±0.040、0.400±0.020、0.310±0.040)也明显高于对照组(0.279±0.050),差异均有统计学意义(均为P<0.01)。结论葛根素对体外培养的视网膜血管内皮细胞有明显的促增殖作用,其作用与葛根素的剂量有关。     

白藜芦醇对高糖环境下视网膜血管内皮细胞增殖及HMGB1乙酰化的影响

目的：探讨白藜芦醇对高糖环境下视网膜血管内皮细胞增殖的影响,并对其机制进行探讨。

方法：人视网膜血管内皮细胞培养于低糖或高糖环境,通过MTT法测定各组细胞增殖,研究白藜芦醇对高糖培养的视网膜血管内皮细胞增殖的影响。通过Western-blot及免疫共沉淀检测SIRT1表达及HMGB1的乙酰化。

结果：白藜芦醇对高糖环境下的视网膜血管内皮细胞增殖具有显著抑制作用(P<0.05),且随白藜芦醇剂量增加,抑制作用增强。高糖抑制SIRT1表达,提高HMGB1的乙酰化,白藜芦醇能逆转上述改变。

结论：白藜芦醇可能通过SIRT1-HMGB1通路抑制高糖环境下的视网膜血管内皮细胞增殖。     

Inhibition of proliferation of retinal vascular endothelial cells more effectively than choroidal vascular endothelial cell proliferation by bevacizumab

AIM: To evaluate the differential inhibitory effects of bevacizumab on cell proliferation of vascular endothelial growth factor (VEGF)-stimulated choroidal vascular endothelial cells (CVECs) and retinal vascular endothelial cells (RVECs) in vitro. METHODS: VEGF (400 ng/mL) enriched CVECs and RVECs were treated with escalating doses of bevacizumab (0.1, 0.5, 1, 1.5 and 2 mg/mL). Cell proliferation changes were analyzed with WST-1 assay and trypan blue exclusion assay at 48, 72h and 1wk. Morphological changes were recorded with bright field microscopy. RESULTS: VEGF enriched RVECs showed significantly more decline of cell viability than CVECs after bevacizumab treatment. One week after treatment, RVEC cell proliferation decreased by 29.7%, 37.5%, 52.8%, 35.9% and 45.6% at 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 and 2 mg/mL bevacizumab respectively compared to CVEC proliferation decrease of 4.1%, 7.7%, 2.4%, 4.1% and 17.7% (P<0.05) by WST-1 assay. Trypan blue exclusion assay also revealed similar decrease in RVEC proliferation of 20%, 60%, 73.3%, 80% and 93.3% compared to CVEC proliferation decrease of 4%, 12%, 22.9%, 16.7% and 22.2% respectively (P<0.05). The maximum differential effect between the two cell types was observed at bevacizumab doses of 1.0 and 1.5 mg/mL at all time points. RVECs were 22 fold more sensitive (P<0.01) compared to CVECs (52.8% vs 2.4%) at concentration of 1.0 mg/mL, and 8.7 fold more at 1.5 mg/mL (35.9% vs 4.1%) 1wk after treatment (P<0.05 respectively). CONCLUSION: VEGF-enriched RVECs are more susceptible to bevacizumab inhibition than CVECs at clinically used dosage of 1.25 mg and this differential sensitivity between two cell types should be taken into consideration in dosage selection.