LDLR DNA甲基化在Hcy致泡沫细胞形成中作用机制的研究

目的探讨低密度脂蛋白受体（LDLR）DNA甲基化在同型半胱氨酸（Hcy）致泡沫细胞形成中的作用机制。方法原代培养单核细胞,采用佛波酯（PMA）和ox-LDL刺激复制泡沫细胞模型,用50、100、200、500μM Hcy干预72h,油红O染色半定量分析泡沫细胞数量,酶免法检测泡沫细胞中ox-LDL含量;同位素法测定LDLR活性,分析Hcy对LDLR的影响,巢式降落式PCR（nMS-PCR）法检测LDLR甲基化的变化,观察Hcy对LDLR的作用。结果泡沫细胞与0、50、100、200、500μM Hcy培养72h后,泡沫细胞数量明显增加,细胞中ox-LDL含量和LDLR活性明显增加,LDLR DNA呈低甲基化改变,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）。结论 Hcy引起泡沫细胞形成除了氧化应激外,LDLR DNA甲基化异常也可能是泡沫细胞形成和Hcy引起AS的又一重要机制。     

基因组DNA甲基化在同型半胱氨酸致平滑肌细胞增殖的作用机制研究

目的 探讨基因组DNA甲基化变化在Hcy致VSMCs增殖的作用机制.方法 原代培养VSMCs并鉴定,用0、50、100、200、500μM浓度Hcy干预,MTF法检测VSMCs活性;Sssl甲基转移酶法分析基因组DNA甲基接受能力,甲基化敏感性限制性内切酶法分析基因组DNA甲基接受能力及DNA甲基转移酶活性.结果 MTT法表明在50μM Hcy时,VSMCs活性明显增加,其余活性下降,与各浓度组并不呈量效依赖关系;Hcy可增加DNA甲基接受能力,以50μM Hcy组效应最显著(P＜0.05);HpalI限制核酸内切酶消化,与对照组比较,基因组DNA甲基化接受能力减少了50.1%、41.7%、46.1%和25.5%(50、100、200、500μM Hcy组),BssHll限制核酸内切酶消化后,基因组DNA甲基化接受能力减少了约25.5%、18.1%、17.4%和18.0%(50、100、200、500μM Hcy组).结论 Hcy引起VSMCs基因组DNA去甲基化是平滑肌细胞增殖的重要机制之一,其效应偏重发生于CpG二核苷酸序列,CpG岛所受影响相对较小,其最大效应在50μM Hcy组,且无明显的量-效依赖关系.     

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶在同型半胱氨酸致平滑肌细胞增殖中作用机制的研究

目的 探讨S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine；SAH)水解酶(SAHH)在同型半胱氨酸(Homocysteine；Hcy)致平滑肌细胞增殖中的作用机制。方法 原代培养平滑肌细胞(VSMCs)，用0、50、100、200、500μM浓度Hcy干预VSMCs，高效液相色谱法(HPLC)检测S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)和SAH含量的变化；实时RT-PcR和Western blot检测SAHH表达的变化；MTT法检测Hcy对VSMCs增殖的影响。结果 HPLC结果表明，VSMCs与0、50、100、200、500μM Hcy培养72h后，细胞中SAH的含量明显增加，而细胞中SAM的含量和SAM/SAH的比值下降，与对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)，实时RT-PCR．和Western blot结果显示，SAHH mRNA和蛋白水平下降，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)，MTT显示，在50μM Hcy组，VSMCs数量明显增加，而100、200、500μM Hcy组VSMCs数量反较对照组减少。结论 SAHH表达下调致使SAM/SAH的比值下降可能是Hcy引起VSMCs增殖的重要机制之一。     

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响及叶酸的拮抗作用

目的探讨不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和细胞周期分布的影响及叶酸对Hcy的拮抗作用。方法正常人脐动脉VSMCs体外培养,随机分为6组:空白对照组、不同浓度Hcy干预组(50、100、2005、00μmol.L-1)和叶酸治疗组(Hcy100μmol.L-1+叶酸30μmol.L-1)。应用MTT法及流式细胞仪检测各组VSMCs增殖率及细胞周期。结果随着Hcy浓度的增加VSMCs的增殖率增加;Hcy作用后VSMCs G0/G1期细胞数降低;S期和G2/M期细胞数增加,处于DNA合成期的细胞数明显增加,而叶酸治疗组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),叶酸治疗组与Hcy 100μmol.L-1组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Hcy可通过对细胞周期的影响促进VSMCs的增殖,并在一定时间和浓度范围内呈明显的剂量依赖关系;叶酸对Hcy有拮抗作用。     

同型半胱氨酸诱导人血管平滑肌细胞组织因子的表达

目的研究同型半胱氨酸(Hcy)诱导人血管平滑肌细胞(VSMCs)表达组织因子(TF)的作用。方法采用组织贴块法培养人脐动脉 VSMCs,应用α-actin 免疫组化法鉴定细胞；将不同浓度的 Hcy 与 VSMCs 孵育,采用半定量 RT-PCR 检测细胞 TF mRNA 表达,流式细胞技术(FCM)检测细胞表面 TF 蛋白水平。结果终浓度分别为0、10、100、 500、1000μmol/L 的 Hcy 作用4 h,Hcy 浓度为10μmol/L 时,TF 表达开始升高,500μmol/L 达峰值,Hcy 呈剂量依赖性诱导 VSMCs 表达 TF mRNA；100μmol/L Hcy 作用0、1、2、3、4、8、24 h,2 h 时 TF 表达明显增加,8 h 达峰值,24 h 表达回到基础水平,Hcy 呈时间依赖性诱导 VSMCs 表达 TF mRNA；VSMCs 细胞膜表面有低水平的 TF 蛋白表达,终浓度分别为0、 10、100、500、1000μmol/L Hcy 作用4 h,10μmol/L 即可诱导 VSMCs 表达 TF 蛋白,1000μmol/L 达高峰,Hcy 呈剂量依赖性诱导 VSMCs 表达 TF 蛋白；终浓度为100μmol/L Hcy 作用0、1、2、4、8、16、24 h,2 h 时 TF 开始表达升高,Hcy 呈时间依赖性诱导 VSMCs 表达 TF 蛋白。结论 Hcy 呈时间依赖性和剂量依赖性诱导 VSMCs 表达 TF,可能是 Hcy 导致 AS 和冠心病等疾病发生发展的重要机制。     

长链游离脂肪酸对滋养细胞线粒体三羟基酰基辅酶A脱氢酶基因启动子区甲基化程度的影响

目的 探讨长链游离脂肪酸对胎盘滋养细胞线粒体β氧化循环长链三羟基酰基辅酶A脱氢酶(LCHAD)基因启动子区甲基化程度影响,以及对甲基化修饰的时间效应.方法 体外培养原代人绒毛滋养细胞及HTR-8/SVneo永久性人滋养细胞,研究组采用长链游离脂肪酸孵育滋养细胞(LC-FFA组),并以短链游离脂肪酸(SC-FFA组)和中链游离脂肪酸(MC-FFA组)作为不同链长游离脂肪酸对照组,空白对照组无脂肪酸(F-FFA组).分别在孵育24、48及72 h收集细胞并提取DNA.在LCHAD基因转录起始位点上游2 000 bp区域内序列预测CpG岛位置,设计甲基化检测位点和引物.采用Sequenom MassArray甲基化DNA定量分析平台检测不同组CpG岛各CpG位点的甲基化程度后进行各甲基化位点和CpG岛的统计学分析.结果 (1)在LCHAD基因转录起始位点上游2 000bp区域内的17个CpG位点中获得11个位点(65％)的甲基化程度,8个为单独位点,3个为复合位点(-984、-960、-899、-853、-811、-796、-774、-727、-615、-595、-579).在不同研究组中每个位点的甲基化变化程度各不同,其中-899位点变化最明显.(2)LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度变化分析:①长、中链游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度影响伴随时间的延长呈现升高趋势:LC-FFA组孵育72 h(0.55±0.08)比孵育48 h(0.35±0.12)及24 h(0.31±0.04)均明显升高(P＜0.05),48 h虽比24 h升高,但差异无统计学意义(P＞0.05).MC-FFA组孵育72 h(0.44±0.05)比孵育24 h(0.31±0.04)明显升高(P＜0.05).②不同链长游离脂肪酸在不同作用时间影响LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度比较:LC-FFA组孵育72 h的甲基化程度比MC-FFA、SC-FFA组及F-FFA组的72、48及24 h均明显升高(P＜0.05).(3)作用72 h游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区11个CpG位点甲基化程度影响比较:在LC-FFA组和MC-FFA组-899位点甲基化程度明显高于其他位点(P＜0.05).(4)长链游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区-899位点甲基化程度影响伴随时间的延长呈现升高趋势(P＜0.05).LC-FFA组孵育72 h比MC-FFA、SC-FFA组及F-FFA组的72、48及24 h均明显升高(P＜0.05).结论 长链游离脂肪酸比中链和短链游离脂肪酸呈现较大的滋养细胞LCHAD基因启动子区甲基化的修饰作用,并伴随作用时间延长表现出明显的时间依赖效应;甲基化程度改变主要发生在LCHAD基因启动子区-899位点.     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞增殖与细胞凋亡的影响

目的观察同型半胱氨酸(Hcy)对人血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及凋亡的影响。方法采用组织贴块法体外培养人VSMCs,将不同浓度Hcy与VSMCs孵育不同时间,应用MTT法检测VSMCs细胞增殖、流式细胞术(FCM)检测VSMCs细胞凋亡。结果体外培养的人VSMCs在终浓度为500μmol/L Hcy的培养液中孵育0h、6h、12h、24h、48h后的A值分别为0．504±0．053、0．586±0．043、0．625±0．031、0．683±0．087、0．812±0．147,细胞凋亡率分别为2．39％±0．47％、2．45％±0．96％、7．58％±2．02％、13．37％±4．71％、17．69％±3．13％,表明Hcy呈时间依赖性诱导人VSMCs细胞增殖和细胞凋亡；在终浓度分别为0、100、200、500、1000μmol/L Hcy的培养液中孵育24h后的A值分别为0．549±0．067、0．616±0．121、0．644±0．095、0．685±0．139、0．846±0．142,细胞凋亡率分别为2．68％±0．23％、2．79％±0．89％、8．45％±2．41％、13．41％±4．98％、17．75％±5．56％,表明Hcy呈浓度依赖性诱导人VSMCs细胞增殖和细胞凋亡。结论Hcy可以诱导VSMCs增殖和细胞凋亡,这一双重作用可能是Hcy致动脉粥样硬化作用的机制之     

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞增殖周期的影响

目的研究表明,动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的独立危险因子,同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）,能通过促进血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）增殖而影响AS的发生,但Hcy与VSMCs增殖之间的关系,目前并不清楚。本研究采用不同浓度的Hcy刺激原代培养的脐静脉VSMCs,分析Hcy对VSMCs增殖周期的影响。方法常规培养人脐带VSMCs,将培养的VSMCs分为,0、50、100、200、500及1000μmol／LHcy组,其中Opmol／LHcy组为对照组。当VSMCs细胞长满80％瓶底时,各组加入不同浓度的Hcy,继续培养细胞24h和48h,采用倒置显微镜观察细胞的生长状态,采用MTT法检测VSMCs的增殖活力,采用流式细胞技术分析VSMCs的增殖周期。结果当Hey刺激VSMCs24h和48h后,VSMCs的数目增多,细胞的活力增加（P〈0．05）;同时VSMCsS期细胞减少,G2／M期细胞增多,G0／G1细胞基本不变。结论1．Hcy可直接诱导VSMCs的增殖;2．Hcy促进VSMCs从S期向G2／M期转变。     

同型半胱氨酸对大鼠血管平滑肌细胞MMP-2表达、细胞迁移的影响及瑞舒伐他汀的逆转作用

目的 观察瑞舒伐他汀对同型半胱氨酸（Hcy）诱导大鼠血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达以及对血管平滑肌细胞迁移的影响,探讨Hcy致动脉粥样硬化以及他汀药物逆转的可能机制.方法 体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞,加入不同浓度的Hcy分别作用 24、48和72h;在1 000μmol/L Hcy浓度下分别加入不同浓度的瑞舒伐他汀干预,采用免疫印迹法和明胶酶谱法检测细胞培养上清液中MMP-2的表达及酶的活性.在Transwell小室外室中加入1 000μmol/L浓度的Hcy,内室加入定量的大鼠平滑肌细胞悬液,培养48h,观察Hcy对平滑肌细胞迁移侵袭力的影响;同时加入不同浓度瑞舒伐他汀溶液,48h,观察瑞舒伐他汀对Hcy诱导平滑肌细胞迁移侵袭力的影响.结果 Hcy浓度在50～5 000μmol/L时促进血管平滑肌细胞MMP-2蛋白的表达（P＜0.05）;Hcy浓度在50～1 000μmol/L时增强血管平滑肌细胞MMP-2的酶活性（P＜0.05）,浓度在5 000μmol/L时抑制血管平滑肌细胞MMP-2的活性（P＜0.05）.瑞舒伐他汀浓度在10-9～10-5mol/L时,能抑制Hcy对血管平滑肌MMP-2表达和酶活性的增强作用（P＜0.05）.Hcy在50～1 000μmol/L浓度下能刺激血管平滑肌细胞迁移（P＜0.05）;瑞舒伐他汀可以抑制Hcy对血管平滑肌细胞迁移的刺激作用（P＜0.05）.结论 Hcy能影响血管平滑肌细胞MMP-2蛋白的表达,瑞舒伐他汀能抑制Hcy对血管平滑肌细胞MMP-2的表达和酶的活性增强作用,并能抑制Hcy对血管平滑肌细胞迁移的刺激作用,这可能是瑞舒伐他汀抗动脉粥样硬化的作用之一.     

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞CTCF表达的影响

目的以动脉粥样硬化(AS)的独立危险因子同型半胱氨酸(Hcy)处理人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMCs),观察Hcy对VSMCs多价核因子CTCF表达的影响,探讨Hcy致AS发病的可能机制。方法 将培养的VSMCs分为0、50、100、200、500及1000 mol/L Hcy处理组,以0 mol/L Hcy组为空白对照。在VSMCs覆盖瓶底70%时,将不同浓度的Hcy加入培养液,继续培养VSMCs 48 h,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫组织化学方法分别检测VSMCsCTCF的mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较,Hcy刺激48h后,VSMCs CTCF的mRNA和蛋白表达皆明显增加,以高浓度组为著(500、1000 mol/LHcy,<0.05)。CTCF免疫组织化学阳性染色以细胞核为主。结论 Hcy升高可诱导VSMCs CTCF的表达上调。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

肝干细胞－卵圆细胞的研究进展

卵圆细胞是肝脏干细胞的代表细胞,主要存在于幼肝及成人受损的肝脏中,是一种双潜能的肝脏干细胞,多种因素调节其分化,在此过程中动态表达一系列表面标志物。卵圆细胞的分化异常与肝癌的发生关系密切。在体外大量扩增卵圆细胞并使之分化为成熟的 有功能的肝细胞,为终末期肝病、肝脏的组织工程研究及基因治疗开辟了新的途径。 