SIRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HEPG-2细胞的实验研究

目的 观察针对HIF1 岬腟IRNA表达载体Genesil-HIF1a与阳离子脂质体复合物对EPG-2细胞增值及其对HIFl a表达的影响.方法 以pGenesil表达载体分别设计阳性对照(pG-shRNA-Hif-1a),阴性对照(pG-shRNA-HK),未处理细胞为空白对照(KB).用3ug:15ul配比的pGenesil-SIRNAc与阳离子脂质体的复合物转染HEPG-2细胞,Q418 400mg/ml培养转染后的细胞10天,拍荧光照片.37℃,5%CO2,5%O2、90%N2培养36小时,用RT-PCR测定HIF-1a mRNA的表达,用cck-8测细胞增殖.结果 培养36小时的阳性对照组Hif-1a m RNA表达明显减低(P＜0.05),对Hepg-2细胞增殖抑制作用明显(P＜0.05);结论 3ug:15ul计量配比组pGenesil-hif-1a与阳离子脂质体复合物可有效转染 Hepg-2细胞,能有效抑制HEPG-2细胞Hif-1a的表达,并抑制其增殖.     

SIRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HEPG-2细胞的实验研究

目的 观察针对HIF1 α的SIRNA表达载体Genesil-HIF1 α与阳离子脂质体复合物对HEPG-2细胞增值及其对HIF1 α表达的影响.方法 以pGenesil表达载体分别设计阳性对照(pG-shRNA-Hif-1 α),阴性对照(pG-shRNA-HK),未处理细胞为空白对照(KB).用3 μg:15μl配比的pGenegil-SIRNA与阳离子脂质体的复合物转染HEPG-2细胞,G418 400mg/ml培养转染后的细胞10天,拍荧光照片.37℃、5%CO2、5%O2、90%N2培养36小时,用RT-PCR测定HIF-1 α mRNA的表达,用cck-8测细胞增殖.结果培养36小时的阳性对照组Hif-1 α mRNA表达明显减低(P<0.05),对Hepg-2细胞增殖抑制作用明显(P<0.05);结论 3μg:15 μl计量配比组pGenesil-hif-1 α与阳离子脂质体复合物可以有效转染Hepg-2细胞,能有效抑制HEPG-2细胞Hif-1 α的表达,并抑制其增殖.     

siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究

目的:观察针对HBV X的siRNA表达载体pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物对HepG2.2.15细胞转染效果及其对HBVM表达的影响。方法:以pGenesil-siAFP表达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组,用不同配比浓度pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜下观察并计算转染阳性细胞百分率,筛选出最佳转染效率的剂量配比。于转染后24h、48h、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中HBsAg和HBeAg。结果:pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物8μL∶2.5μg剂量配比组的平均转染率达到了(55.1±4.3)%,且不影响细胞活性;转染后48h和72h后该siRNA表达载体对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg抑制作用显著(P<0.05)。结论:8μL:2.5μg剂量配比组的pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比,能有效抑制HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg。     

新型阳离子核酸载体的细胞转染效率研究

目的新型阳离子核酸载体LW13-2进行研究,分析其细胞毒性和基因转染效率,探讨其作为核酸载体的可能性。方法使用MTT比色法分析LW13-2与DNA在不同比例下的细胞毒性。选用绿色荧光蛋白表达质粒EGFP为报告基因,以人胚胎肾HEK293细胞为工具细胞,在荧光显微镜下观察计数,计算转染效率。结果当LW13-2与DNA的质量比为(1~3)∶1时,细胞毒性最低。LW13-2与DNA的质量比为3∶1时,转染作用4 h,在无血清培养基中继续培养48 h,得到LW13-2的最大转染效率为87.6%。结论通过与市售成熟转染试剂Lipofectamine 2000的对比,新型阳离子核酸载体在大幅提高基因转染效率的同时并没有增加其细胞毒性,有望成为核酸转移的有效载体,为相关研究及基因的靶向治疗研究提供基础。     

阳离子脂质体的研究进展

基因治疗面临的首要技术问题是基因药物的载体,目前用于基因治疗的载体主要分为两大类:病毒载体和非病毒载体.病毒载体虽然在基因转移方面具有一定的优点,但在体内具有较大的潜在危险,限制了它在临床基因治疗上的应用.非病毒载体中最具典型的是阳离子脂质体(cationic liposomes)载体,它具有可自然降解、无免疫原性、可重复转染等优点,近年来备受研究者的重视,至今已有数10种阳离子脂质体被研制合成出来.现就其进展综述如下.     

HBV DNA疫苗阳离子脂质体复合物转染小鼠实验研究

目的:评价阳离子脂质体作为基因输送载体的效果及初步探讨其作用机理。方法:将二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)与1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)用超声法或挤压法制成阳离子脂质体多片层囊泡(MLV)或小单层囊泡(SLV)。MLV或SLV与DNA(pS2.S/pFP,1∶1)直接混合形成正负电荷比为3∶1或1∶3的阳离子脂质体/DNA复合物MLV-DNA或SLV-DNA。25只BALB/c平均小鼠分成五组:A,B,C,D,E。分别用4种阳离子脂质体/DNA复合物(A,B,D,E组)和10μg裸DNA(C组)一次性肌肉注射免疫接种小鼠。裸DNA、MLV-DNA(3∶1)和SLV-DNA(3∶1)分别与DNase I反应30 min后,1％琼脂糖凝胶110V电泳2 h分离鉴定DNA。结果:免疫接种后第2周,A组和B组血清转阳率均为40％;免疫接种后第4周,A组和B组血清转阳率均达到100％,并保持至第8周以后。免疫接种后第4周,A组血清平均抗-HBs滴度比对照的C组血清平均抗-HBs滴度高27倍(2.3706,0.9370,P<0.02)。免疫接种8周后,A组和B组小鼠血清抗-HBs水平仍呈上升趋势,平均抗体滴度分别是2.5687,1.9533。D组与E组小鼠血清未见转阳。与DNase温育30 min后,裸DNA(C组)被完全降解,而MLV-DNA(3∶1)和SLV-DNA(3∶1)中DNA基本保持完整。结论:阳离子脂质体是一种高效的非病毒基因输送介质;免疫接种后抗体持续高水平,可能是阳     

阳离子脂质体介层的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

目的：探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。方法：用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lac Z报告基因的质粒pCAGGS-lacZ按3种方法转染小鼠脾细胞，（1）常规方法直接转染；（2）脾细胞经刀豆球蛋白A（ConA)活化后再按常规方法转染；（3）用黏附辅助脂质体法（adhesion-assisted lipofection,AAL）转染脾细胞。转染效率用X－gal染色法测定。结果：上述3种方法的转染效率依次为＜0．010，0．057及0．199，经方差分析，3种方法转染效率的差异有显著性（P＜0．01，n=3).结论：AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

阳离子脂质体转染效率影响因素的研究进展

目前用于基因转染的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体的转染效率最高,但由于其容易造成感染和致癌性等安全性问题限制了它在临床中的应用。阳离子脂质体(cationic liposomes)是一种非常具有发展前景的非病毒基因载体。其生物膜特性,能使其转运的基因保持生物活性,保护基因免受溶酶体的降解,且具有无免疫原性、操作简单、对转移基因大小没有限制、重复性好、可自然降解等优点,而成为世界性的研究热点。     

阳离子脂质体的转染机制和影响转染效率的因素

阳离子脂质体以其制备简单、无毒、无免疫原性、可生物降解等优点,成为了近年来基因转移中的常规载体。简述了阳离子脂质体的结构及特性、转染机制、影响转染效率的因素、应用及存在的问题。     

自制多聚胺阳离子脂质体转染效率及细胞毒性的评价

目的: 评估制备的多聚胺阳离子脂质体转染哺乳动物细胞的转染效率及细胞毒性. 方法: 多聚胺阳离子脂质TC-Chol与中性磷脂DOPE以3: 1摩尔比,制备多聚胺阳离子脂质体,通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入HeLa细胞, Hep2细胞,倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达,通过MTT法,检测细胞存活分数,并以Lipofectamine2000为对照,评价制备阳离子脂质体转染效率及细胞毒性. 结果: 多聚胺阳离子脂质体转染效率略低于Lipofectamine 2000,但细胞毒性较低,为一种相对高效低毒的阳离子脂质体. 结论: 多聚胺阳离子脂质体为一种相对高效低毒的阳离子脂质体,在基因转染和基因治疗方面具有较广阔的前景.     

电穿孔转染法与脂质体转染法对K562和HepG2细胞转染效率的影响

目的通过对电穿孔转染法和脂质体转染法在K562、HepG2细胞中的转染效率比较,探索最佳的细胞转染方法和条件。方法以K562、Hep G2细胞为研究对象,采用电穿孔转染法和脂质体转染法分别转染带有绿色荧光的质粒PEGFP-N1和无荧光的质粒p CDNA3.1、p CDNA3.1-EOS基因,荧光显微镜下观察PEGFP-N1转染效果,计算转染效率;收集各培养组细胞,裂解后提取蛋白,采用Western blot方法检测基因转染后的蛋白表达。结果当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压150 V时进行电穿孔,转染质粒PEGFP-N1,K562细胞可以得到较高的转染率;当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压250 V时,转染质粒PEGFP-N1,Hep G2细胞可以得到较高的转染效率。在K562细胞和Hep G2细胞中,电穿孔转染法的转染效率均显著高于脂质体转染法(P<0.05)。电穿孔转染法转染PEGFP-N1后K562细胞和Hep G2细胞的存活率显著低于脂质体法(P<0.05)。Western blot结果显示电穿孔转染法蛋白表达量高于脂质体转染法(P<0.05)。结论最佳条件下电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法,对比较难转染的悬浮细胞效果更佳。     

寡肽阳离子脂质体作为基因载体的体外研究

采用阳离子寡肽脂质材料赖氨酰化谷氨酸双十四醇酯(T2GL)制备阳离子脂质体(CL),与增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)静电结合形成复合物(CL/pDNA),CL/pDNA粒径和表面电位分别为(132.3±1.0)nm和+(31.35±2.99)mV。考察CL/pDNA对肝素及脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase I)的稳定性,结果表明,CL/pDNA可被适宜浓度的肝素竞争性解组装释放pDNA,其对DNase I的稳定性明显优于市售制剂Lipofectamine 2000。研究CL与pDNA的比例(N/P)及质粒用量对转染效率的影响,结果显示当N/P为3,质粒用量4μg时,CL/pDNA的转染效率最佳。采用CL/pDNA对3种不同的细胞进行转染,发现CL/pDNA在人源非小细胞肺癌A549细胞中转染效果最好,与Lipofectamine 2000相比,转染效率相当但细胞毒性更低,因此为进一步研究其体内行为提供了良好的基础。     

阳离子脂质体介导小干扰RNA转染EOMA细胞时转染条件的优化

目的 优化在阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000介导下将小鼠NF-κB的小干扰RNA（siRNA）转染入EOMA细胞时的转染条件.方法 将1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000与20 pmol、30 pmol、40 pmol、50 pmol 、60 pmol的带荧光标记的siRNA分别组合,制备成相应的转染混合物,转染小鼠血管瘤内皮细胞（EOMA细胞）,于转染24 h后在荧光显微镜下计数阳性细胞率、MTT法检测各转染条件下EOMA的细胞活性.结果 在siRNA量相同的情况下,分别采用1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000进行转染其转染效率、细胞毒性无明显差异（P＞0.05）;转染混合物中siRNA浓度为50 pmol时,转染效率最高达到86%,继续增加siRNA的浓度,转染效率提高并不明显;siRNA浓度为60 pmol时转染混合物表现出较高的细胞毒性.结论 以1.0 μl Lipofectamine^TM2000与50 pmol的siRNA组成转染混合物可以实现对EOMA细胞高效转染并保持较高的细胞活性.     

阳离子脂质体介导的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

【目的】探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。【方法】用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lacZ报告基因的质粒 pCAGGS lacZ按 3种方法转染小鼠脾细胞 ,①常规方法直接转染 ;②脾细胞经刀豆球蛋白A(ConA)活化后再按常规方法转染 ;③用黏附辅助脂质体法 (adhesion assistedlipofection ,AAL)转染脾细胞。转染效率用X gal染色法测定。【结果】上述 3种方法的转染效率依次为 <0 0 10 ,0 0 5 7及 0 199,经方差分析 ,3种方法转染效率的差异有显著性 (P <0 0 1,n =3)。【结论】AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

新型阳离子脂质体的制备及其转染效率的测定

目的制备以新型细胞转染素为阳性成分的阳离子脂质体,作为基因载体,用于基因转染的实验研究和肺部疾病的基因治疗.方法用薄膜法制备N4-精胺胆固醇羰酰氨阳离子脂质体,通过电镜观察和电泳,检测其形态、结构和细胞转染条件,并对SPC肿瘤细胞进行转染,评估其转染效率.结果制备的新型阳离子脂质体具有良好的微囊形态,当脂质体∶质粒为(6～8)∶1时,其转染效率可达60%.结论成功制备了新型阳离子脂质体,在适当条件下其具有较高的转染活性,为以后的基因转染和基因治疗打下基础.     

阳离子脂质体基因载体的研究进展

肿瘤基因治疗的最大挑战之一是研制安全有效的基因转染载体。基因治疗载体一般分为病毒性载体和非病毒性载体。由于病毒型载体存在安全性问题,目前非病毒性载体的研究越来越受到人们的重视。脂质体作为常用的非病毒性载体容易制备,安全性高,但亦存在质控要求高,体内基因导入效率较低,且无靶向性,使得其应用受到限制。pH敏脂质体、阳离子脂质体等大大提高了脂质体的转运效率,也为非病毒载体在临床上的应用开辟了广阔的前景,本文就阳离子脂质体作为基因载体的研究予以综述。     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

脂质体介导转染bcl-2反义核酸进入HL60细胞的动力学模式和生物学效应

bcl- 2基因是重要的抗凋亡和耐药基因 ,在造血系统恶性肿瘤细胞中普遍高表达。利用 bcl- 2反义核酸有望抑制bcl- 2基因的表达 ,促进细胞凋亡 ,提高肿瘤对化疗的敏感性。　目的　应用阳离子脂质体介导或寡核苷酸直接转染技术 ,建立 HL6 0细胞摄入荧光素标记的 bcl- 2寡核苷酸的动力学模式 ,研究脂质体介导下 bcl- 2反义核酸对 HL6 0细胞的生物学效应 ,初步探讨脂质体的生物学作用。　方法　应用荧光素标记的寡核苷酸 ,凝胶电泳观察脂质体寡核苷酸复合物的形成 ,流式细胞仪测定细胞内的平均荧光强度和 bcl-2蛋白的表达 ,荧光显微镜观察细胞内荧光物质的分布 ,3H-Td R掺入法和 MTT法检测 HL6 0细胞的生长 ,RT- PCR法检测细胞内 bcl- 2 m RNA的表达水平。　结果　 (1)当脂质体与寡核苷酸的质量比合适时 ,两者可形成复合物。(2 )脂质体介导转染法显著提高 HL6 0细胞对寡核苷酸的摄入 ,当脂质体与寡核苷酸的质量比 (μg/ μg)为 2 .0 / 1时 ,细胞内相对平均荧光强度可达寡核苷酸直接转染时的 40倍 ,而且 HL6 0细胞对寡核苷酸的摄入与其浓度和作用时间有关 ,未标记的寡核苷酸竞争性抑制细胞对标记寡核苷酸的摄取。 (2 )细胞内的寡核苷酸可向胞外转运 ,脂质体介导转染后 ,胞内荧光强度衰减缓慢 ,t1 /2 约为 4h,     

阳离子脂质体介导BEL-7402、QBC、BXPC-3瞬时转染率比较

目的: 探讨阳离子脂质体瞬时转染消化道肿瘤细胞的差异.方法: 采用pEGFP-N1质粒为报告基因,流式细胞仪技术(FACS)来分析阳离子脂质体介导3种细胞的瞬时转染率,设立裸质粒的转染为空白对照组,将转染的细胞在倒置荧光显微镜下观察并摄像;采用MTT法检测3种细胞的倍增时间,并绘制细胞生长曲线;分析细胞倍增时间和阳离子脂质体介导的转染之间的联系.结果: BEL-7402,QBC,BXPC3 3系细胞阳离子脂质体介导的瞬时转染率分别为26.99%、2.25%和30.36%,BEL-7402和BXPC-3同QBC细胞有显著差异(P＜0.05);3个细胞系裸质粒的转染率分别为0.22%、0.29%和0.18%,3者之间差异无显著性(P＞0.05);BEL-7402、QBC、BXPC-3的倍增时间分别是34.48 h、64.94 h和26.29 h,QBC细胞同BEL-7402及BXPC-3相比差异有显著性(P＜0.05).结论: 阳离子脂质体对高度恶性的消化道肿瘤细胞有更好的转染效率.