基因修饰的神经干细胞脑内移植后TH表达和神经递质的变化

目的：探讨经TH基因修饰的神经干细胞脑内移植后，PD模型动物脑内TH表达和神经递质的变化。方法：构建pN2ATH逆转录病毒载体质粒，用PA317细胞包装，G418筛选阳性克隆，病毒上清感染神经干细胞，将神经干细胞和表达TH的神经干细胞植入PD大鼠纹状体内，观察移植后TH的表达情况以及DA和DOPAC含量变化。结果：TH基因修饰的神经干细胞移植2月内，TH在纹状体内的表达增加，纹状体DA和DOPAC含量增高，好于单纯神经干细胞移植组和对照组，但比正常水平低，结论：TH基因修饰的神经干细胞，脑内移植能增加纹状体内TH的表达以及DA和DOPAC含量，为其脑内移植治疗PD提供了理论基础。     

面神经损伤大鼠脑内移植绿色荧光蛋白转基因胎鼠神经干细胞的

背景：目前面神经损伤后的修复主要集中在外周神经干,但面神经损伤后会导致部分中枢运动神经元凋亡。现阶段关于干细胞植入面神经损伤大鼠脑后对面神经核团内凋亡神经元的影响相关报道甚少。 目的：观察大鼠面神经损伤后,脑内移植绿色荧光蛋白转基因胎鼠的神经干细胞的成活和迁移情况。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-07/12在昆明医学院神经科学研究所完成。 材料：孕14~16 d的绿色荧光蛋白转基因蛋白小鼠1只,用于制备转基因神经干细胞。清洁级SD雄性大鼠24只,随机分为3组：面神经损伤转基因细胞组12只、面神经损伤细胞培养液组6只、面神经正常转基因细胞组6只。 方法：面神经损伤转基因细胞组、面神经损伤细胞培养液组大鼠建立面神经切断模型。造模后1周,行转基因神经干细胞立体定向移植,注射点为前囟后方11.30 mm、背侧9.00 mm、正中线位置。面神经损伤转基因细胞组、面神经正常转基因细胞组各注入10 μL转基因神经干细胞悬液(含5×106 个细胞),面神经损伤细胞培养液组注入10 μL神经干细胞培养液,4周后制作脑组织冰冻切片。 主要观察指标：荧光显微镜观察移植部位绿色荧光蛋白阳性神经干细胞的存活情况,及其向损伤侧面神经核团周围迁移的情况。 结果：①移植处：面神经损伤转基因细胞组、面神经正常转基因细胞组均可见数量不等的绿色荧光蛋白阳性细胞,其中部分绿色荧光蛋白阳性细胞位于血管内;面神经损伤细胞培养液组未见绿色荧光蛋白阳性细胞。②面神经核团周围：仅面神经损伤转基因细胞组可见数量不等的绿色荧光蛋白阳性细胞迁移于损伤侧面神经核团周围,而健侧面神经核周围未见绿色荧光蛋白阳性细胞;余2组双侧面神经核周围均未见绿色荧光蛋白阳性细胞。③移植处与面神经核团周围之间：未见绿色荧光蛋白阳性细胞相连。 结论：神经干细胞移植入面神经损伤大鼠脑内后,可以向损伤侧面神经核周围迁移。     

BDNF修饰神经干细胞的建立及脑内移植研究

奠定基础.     

基因转染神经干细胞移植治疗脑胶质瘤的研究进展

脑胶质瘤发病率占颅内肿瘤的第一位,目前采用手术、放疗、化疗等综合治疗,但其预后仍差。其治疗难点在于肿瘤细胞的浸润性生长方式,而基因治疗将成为将来治疗方案的最佳选择之一。神经干细胞具有在中枢神经系统内迁移分化能力,是基因治疗的良好载体细胞。胞嘧啶脱氨酶基因和自介素-4基因、白介索-12基因、TRAIL基因修饰神经干细胞移植治疗脑胶质瘤是当前脑胶质瘤基因治疗的前沿。     

脑源性神经营养因子促进bHLH基因的表达和神经干细胞的定向分化

目的观察脑源性神经营养因子(BDNF)对bHLH基因表达和神经干细胞(NSCs)定向分化的影响,探索NSCs分化的机制。方法取孕14 d的胚胎大鼠脑组织,以无血清培养基培养获得NSCs,然后随机分为2组,实验组加入5％胎牛血清(FBS)和20 ng/mL BDNF诱导其定向分化,而对照组仅加5％FBS,用免疫荧光及流式细胞仪的方法来检测分化得到的神经元细胞及其比例,采用RT-PCR技术分析bHLH基因表达的动态变化。结果实验组MAP-2阳性神经元的比例在分化培养后第3 d达高峰,约为60％,而同期对照组仅为30％,差异有统计学意义(P<0．05)。分化后bHLH基因MASH-1、neumD和neurogenin2表达均高于分化前,相同时间段实验组bHLH基因的表达强于对照组(P<0．05)。结论BDNF促进了NSCs向神经元定向分化;bHLH基因参与了NSCs的定向分化过程,其高表达可能有利于NSCs向神经元方向分化。     

神经干细胞移植入Alzheimer病模型鼠脑内的存活和分化

目的　研究神经干细胞移植治疗AD的可行性。方法　将从新生大鼠海马齿状回分离、培养的神经干细胞注入AD模型大鼠海马 ,4周后研究干细胞在体内存活和分化的情况。结果　神经干细胞在体内可以存活 ,部分可以分化 ,大部分分化为胶质细胞 ,小部分分化为神经元。结论　神经干细胞移植对AD有治疗作用。     

人神经干细胞移植到缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的存活及分布★

目的：新生儿缺氧缺血性脑病是导致脑性瘫痪的重要原因，至今缺乏有效疗法。将体外培养的人神经干细胞经脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生鼠，观察植入细胞在宿主脑内的存活、迁移及分化。 方法：实验于2005-01/09在解放军海军总医院儿科实验室完成。①对象：神经干细胞来源于孕12周流产的人胎儿脑组织，孕妇签署知情同意书，符合医院伦理委员会规定。清洁级SD新生鼠80只，随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组，40只/组，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取人胚胎脑组织，机械分散法分离单个核细胞，接种于添加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中，获取生长旺盛的人神经干细胞球，制成单细胞悬液，浓度约为5.0×1011 L-1，培养6 d后行PKH标记用于植入后示踪。两组新生鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型，造模后3 d，细胞移植组损伤侧脑室缓慢注入5 μL人神经干细胞悬液，模型对照组于相同部位注入等量生理盐水。③实验评估：取未经PKH标记的细胞球， 通过免疫细胞化学染色鉴定巢蛋白的表达及其向神经元、星形胶质细胞的分化情况。分别于细胞移植后1，2，4周及3个月，常规取脑组织，行免疫组织化学和荧光分析，观察植入后细胞存活及分布情况。 结果：在造模及细胞移植过程中，因麻醉、出血细胞移植组新生鼠死亡5只，模型对照组死亡7只，存活率85%~90%。①神经干细胞的鉴定及分化：80％活细胞巢蛋白呈阳性表达，并可分化为神经元、星形胶质细胞。②神经干细胞植入后存活及分布情况：植入后1周，神经丝蛋白阳性细胞多位于损伤侧皮质及海马处，纹状体、脑干、小脑、嗅球也有少量分布。植入后2周，海马和皮质可见神经丝蛋白阳性细胞，胞体伸出的神经微丝更长，细胞数量与1周时基本相似。植入后4周及3个月时PKH阳性细胞数量明显减少。 结论：在含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中形成的人神经干细胞球，具有良好的增殖能力，可分化为神经元，移植至缺血缺氧新生鼠脑中能够向损伤区迁移，分布范围广。     

神经干细胞在脑出血大鼠脑内移植后对IL-6、TNF-α表达的影响

目的 探讨神经干细胞(NSCs)移植入脑出血模型大鼠脑内后对脑组织内IL-6、TNF-α表达的影响.方法 体外培养大鼠NSCs;选取SD大鼠180只,随机取60只大鼠为健康对照组(A组),余120只采用Ⅳ型胶原酶诱导法建立脑出血模型,并随机分成两组:B组60只为单纯脑出血组;C组60只为脑出血+NSCs移植组,三组大鼠分别在NSCs移植后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d进行肢体运动功能评分后,处死取脑组织匀浆,以EHSA方法分别检测三组大鼠脑组织内5个时间点IL-6、TNF-a的表达,并用统计学的方法分析.结果 与单纯脑出血组比较,脑出血+NSCs移植组能够显著降低IL-6、TNF-a表达(P＜0.05)和促进肢体功能恢复(P＜0.05).结论 大鼠NSCs脑内移植能有效降低脑出血模型大鼠脑内IL-6、TNF-a的表达,并能够改善运动神经功能缺损.     

脑组织移植和神经干细胞研究进展

综述了近年来广泛开展的神经组织和细胞移植的各种主要方法及其进展。着重对神经干细胞这一神经科学的前沿课题进行了详细的复习。并对神经干细胞的研究方法,神经营养因子和神经干细胞的关系,神经干细胞的分化诱导及共临床方面的应用前景作了阐述。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法 原代培养．培养细胞生长状况观察用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）检测以作细胞鉴定。结果 成功培养出大鼠胚胎神经干细胞，了解其生长规律，并对其进行传代、冻存及复苏，培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论 大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏，并具有多向分化潜能。     

体内外不同环境对大鼠胚胎神经干细胞分化的影响

目的 探讨体内外不同环境条件对大鼠胚胎神经干细胞分化影响。方法 孕龄16天的大鼠胚胎神经干细胞体外扩增后移植至大鼠脑内尾状核出血部位；同时体外将其与新生大鼠Schwann细胞共培养，应用免疫组织化学和免疫荧光方法分另检测神经细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性标志蛋白tubulin-β、MAP2，GFAP和GalC的表达。结果 移植到脑内的BrdU阳性细胞环绕脑出血区域分布，大部分细胞GFAP阳性，少部分细胞tubulin-β或ＧalC阳性；而与Ｓchwann细胞共培养后，神经干细胞大部分呈tubulin-β和ＭＡＰ２免疫荧光阳性，少部分呈ＧＦＡＰ或ＧalC免疫荧光阳性。结论 脑内尾状核出血环境诱导神经干细胞主要分化成神经胶质细胞；而体外与Ｓchwann细胞共培养主要诱导其分化成神经细胞。     

骨髓基质细胞源神经干细胞移植对脑出血大鼠行为及神经细胞凋亡的动态影响

目的 探讨骨髓基质细胞源神经干细胞对实验性脑出血大鼠行为及神经细胞凋亡的影响.方法 采用自体血注入法建立大鼠脑出血模型.32只健康Sprague-Dawley(SD)大鼠分为假手术组、出血对照组、出血骨髓基质细胞移植组和出血骨髓基质细胞源神经干细胞移植组.分别于移植后1d、7d、14d对大鼠进行神经功能缺损评分和空间学习能力检测,并在移植后7d和14d,分别应用TUNEL法检测神经细胞凋亡.结果 移植后7d各组神经功能均有不同程度的恢复(P<0.05),BMSCs源神经干细胞移植组大鼠的神经功能评分显著优于BMSCs移植组(P<0.01).移植7d后可提高大鼠空间学习能力,且各时间点BMSCs源神经干细胞移植组的空间学习能力改善优于BMSCs组(P<0.05).BMSCs源神经干细胞移植组出血边缘区凋亡细胞数明显少于BMSCs移植(P<0.05).结论 骨髓基质细胞源神经干细胞移植可改善脑出血大鼠神经行为,减少神经细胞凋亡,显著优于BMSCs移植.

Abstract：

Objective To study the effects of bone marrow stromal cells ( BMSCs) derived neural stem cells on behavior and celluar apoptosis in experimental intracerebral hemorrhage (ICH) . Methods The model was established by ster-otactic infusing autologous caudate artery blood into right nucleus caudatus of SD rats. 32 Sprague-Dawley rats were divided into sham-operated group,ICH control group,BMSCs transplanted group and BMSCs derived neural stem cells transplanted group. The neurogenic behavior of the rats were evaluated on 1,7,14 days after transplantation. The rats were killed separat-edly on 7,14days after transplantation. The brain sections were used for TUNEL staining. Result The neurological function of rats were recovery on 7 days later after transplantation( P < 0. 05 ) . The recovery of neurological function in BMSCs derived neural stem cells transplantation group was much evidentl than BMSCs transplantation group( P < 0. 01). The abilities of spatial learning and memory of rats on 7 days later after transplantation got improved (P < 0. 05). More satisfactory outcome got in BMSCs derived neural stem cells transplanted group than in BMSCs transplanted group ( P < 0. 05 ) . The number of apoptotic cells in the group of BMSCs derived neural stem cells transplanted group decreased evidently compared with that of the BMSCs transplantation group (P <0.05). Conclusion BMSCs derived neural stem cells may make the neurogenic behavior recovery, and decrease the infarct volumes and the number of apoptotic cells in ICH.     

大鼠胚胎神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究

目的 研究大鼠胚胎神经干细胞移植治疗脑出血的可行性。方法 从孕龄16天的大鼠胚胎脑组织中分离、培养神经干细胞并诱导其分化，通过免疫组化学技术研究其特性。制作大鼠脑出血模型，3天后将未分化的神经干细胞注入血肿同侧或对侧的尾状核内，记录损伤和移植后的大鼠运动功能。不同时间杀死大鼠，研究移植后的干细胞在体内分化和迁徙的情况。结果 实验中分离、培养的神经干细胞体外能够被诱导分化成神经元、光突胶质细胞和星形胶质细胞，血肿同侧移植干细胞的大鼠运动功能的改善显著好于血肿对侧移植干细胞组及未移植干细胞的对照组。免疫组化方法证实移植后的干细胞在体内可分化成神经元和胶质细胞，并向损伤区域迁徙。结论 大鼠胚胎神经干细胞体内、体外均具有多向分化潜能，其分化成各种类型神经细胞的比例与所处的外界环境有关，在脑内靠近损伤部位移植胚胎神经干细胞后能够有效改善脑出血动物的运动功能。     

神经干细胞转染酪氨酸羟化酶基因后的分化

目的 探讨神经干细胞（NSCs）转梁酪氨酸羟化酶（TH）基因后的分化。方法 从胚胎16天Wistar大鼠室管膜前下周围区分离、增殖、鉴定NSCs；将TH基因和缺陷性逆转录病毒载体N2A构建成真核表达质粒，以电穿孔将其转入PA317包装细胞内；收集PA317包装产生的逆转录病毒颗粒，感染体外培养的NSCs，经G418筛选，获得成功转染TH基因的NSCs克隆；分别以0.4ng/ml bFGF和5％胎牛血清诱导转染及未转染TH基因的NSCs分化，比较TH基因转染及不同诱导方式对NSCs分化的影响，同时在分化细胞内检测TH的表达。结果 以0.4ng/ml bFGF诱导可使95％以上的NSCs分化为神经元，而5％FBS诱导则大多分化为神经胶质细胞，无论是否转染TH基因，神经元及神经胶质细胞的分化比例不成生改变；TH基因转染后能在神经干细胞的子代细胞内高效、稳定表达。结论 TH基因转染不影响NSCs的分化潜能，TH能在神经干细胞的子代细胞中有效表达0.4ng/ml bFGF诱导可以促使NSCs分化为神经元。     

Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression

The identification of strategies for the isolation of neural stem cells (NSCs) has important implications for the understanding of their biology and the development of therapeutic applications. It has been previously described that human neural stem and progenitor cells (NSPCs) can be isolated from the central nervous system (CNS) using antibodies to prominin (CD133) and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Although this antigen displayed an identical membrane topology in several human and murine tissues there was uncertainty as to the relationship between human and mouse prominin because of the low level of amino acid identity. Here we show that prominin expression can be used to identify and isolate also murine NSPCs from the developing or adult brain. Prominin is co-expressed with known neural stem markers like SOX 1-2, Musashi and Nestin. Moreover, neurosphere-forming cells with multipotency and self-renewal capacity reside within the prominin-positive fraction. Transplantation experiments show that CD133-positive cells give rise to neurons and glial cells in vivo, and that many neurons display appropriate phenotypic characteristics of the recipient tissues. The demonstration that CD133 is a stem cell antigen for murine NSPCs as it is for human NSPCs is useful for the investigation of mammal neurogenesis and development of preclinical tests of NSPCs transplantation in mouse analogues of human diseases.     

大鼠胚胎脑皮层神经干细胞的分离和培养

目的探讨分离、培养、纯化大鼠胚胎神经干细胞(neuralstem cell,NSCs)的最佳条件,以获得充足的神经干细胞来源,用于中枢神经系统疾病的治疗.方法分离孕13～15 d胎鼠大脑皮层,在无血清含神经生长因子N2培养液中培养,利用有限稀释法单克隆培养和改良法连续传代纯化并扩增NSCs,免疫组织化学法对NSCs及分化细胞进行鉴定.结果可以通过体外培养获得大量神经源性干细胞,在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能.结论NSCs的存活和分裂依赖于神经生长因子和N2添加剂的浓度,胚胎脑组织和神经球分离方法影响NSCs的形成速度和数量.掌握NSCs的体外纯化培养和鉴定手段可为进一步研究NSCs生物学特性及神经系统损伤的治疗提供新方法.     

成人骨髓源性神经干细胞高迁移能力的基因分析

目的 检测成人骨髓源性神经干细胞(Md-NSCs)中与细胞侵袭转移相关基因的表达情况,研究Md-NSCs在中枢神经系统中具有高迁移能力的基因基础. 方法 自正常成人志愿者获取成人骨髓基质细胞(BMSCs),于体外诱导培养获得Md-NSCs,应用寡核苷酸基因芯片检测Md-NSCs中与细胞侵袭转移相关基因的表达情况;应用实时定量PCR(RT-PCR)检测验证基因芯片的结果.结果 基因芯片检测结果显示,与新鲜正常成人骨髓细胞去红细胞相比较,Md-NSCs中与细胞侵袭转移相关基因(MMP1、MMP2、MMP17、ITGA3、RhoB、RhoC及RhoD)均呈高度表达:RT-PCR检测结果显示.MMP2、ITGA3、RhoC在Md-NSCs中高度表达,分别为新鲜正常成人骨髓细胞去红细胞含量的2.84×100倍、2.22×102倍及4.92×100倍. 结论 Md-NSCs在中枢神经系统中具有高迁移能力可能与该细胞中促进细胞侵袭转移相关基因的高度表达相关.另外.这些高度表达的基因属于重要的癌基因.因此对Md-NSCs致瘤性问题的深入研究值得重视.     

人胚脊髓神经干细胞的分离培养和鉴定

目的:探讨人胚脊髓神经干细胞的体外培养和分化的方法,观察其增殖和分化特点。方法:利用无血清培养和单细胞克隆技术从人胚脊髓组织中分离培养出神经干细胞并用血清诱导其分化,应用免疫荧光细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定。结果:从人胚脊髓组织分离的细胞在EGF单独存在时无法形成神经球,在bFGF单独存在时只形成少量神经球,在EGF和bFGF共同存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球,表达神经干细胞的标志物Nestin,经血清诱导后分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞并表达特异性抗原NSE、GFAP和CNP。结论:在体外培养条件下可从人胚脊髓组织中培养出神经干细胞,它可为神经干细胞的基础研究和临床应用提供材料。     

大鼠雪旺氏细胞支持人胚胎神经干细胞的生长并诱导其分化

目的 探讨大鼠雪旺氏细胞对人胚胎神经干细胞生长和分化的作用。方法 实验分为三组：组一：干细胞生长于培养雪旺氏细胞1天后的培养液中；组二：干细胞与雪旺氏细胞共培养；组三：干细胞生长于DMEM／F12培养液中，观察干细胞的形态学变化和免疫荧光的.组一的神经球分化生长，绝大多数细胞tubulin-β阳性，少数为GalC或GFAP阳性；组二中，在雪旺氏细胞生长密集和稀少的地方，干细胞分别表明为不分化和明显分化两种状态；组三的神经干细胞无法正常生长。结论 大鼠雪旺氏细胞分泌物支持人胚胎神经干细胞的生长并诱导其分化。