Wnt抑制因子-1对肝星状细胞活化的影响

目的观察wnt抑制因子-1（WIF）对转化生长因子β1（TGF-β1）活化肝星状细胞（HSC）的影响。方法构建真核表达质粒pEGFP-C1-WIF并通过脂质体介导方法,将pEGFP-C1-WIF转染体外培养的HSC-T6细胞株,用TGF-β1刺激转染（试验组）和未转染的HSC-T6细胞株（对照组）,并用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组细胞（包括正常细胞组）smad3、β-连环蛋白（β-catenin）mRNA及其蛋白质的表达。结果试验组HSC-T6细胞株smad3、β-catenin mRNA及蛋白质表达明显低于正常组HSC-T6细胞株,更低于对照组HSC-T6细胞株（P〈0.05）。β-catenin和smad3蛋白质的表达均与α-肌动蛋白（α-SMA）蛋白质的表达显著相关（r=0.800,P〈0.01;r=0.743,P〈0.01）。结论 WIF能通过下调wnt/β-catenin以及TGF-β1/smads信号通路的生物学效应抑制HSC-T6细胞的活化,从而延缓肝纤维化的发展。     

阻断Wnt-β-catenin信号通路对肝星状细胞活化的影响

目的探讨活化的肝星状细胞（HSC）内是否存在功能性的Wnt-β-catenin信号通路的激活，以及阻断该信号通路对HSC活化的影响。方法免疫细胞化学染色检测β-catenin在HSC-T6细胞内的表达。通过转染T细胞因子（T-cellfactor，TCF）依赖的荧光素酶报告质粒（pTOPFI。ASH）测定HSC—T6细胞内的Wnt-β-catenin信号。将TCF的显性负性突变体dnTCF表达质粒转染HSC-T6阻断Wnt-β-catenin信号的转导，用Western印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及Ⅰ型胶原表达变化。结果HSC-T6细胞核内有β-catenin的表达；转染pTOPFLASH的细胞荧光素酶活性显著高于转染pFOPFLASH的对照组（P〈0．01）；与转染空质粒的对照组相比，转染dnTCF的HSC-T6细胞α-SMA及Ⅰ型胶原表达分别下降52．9％和37．5％（P〈0．05）。结论活化的HSC中存在Wnt-β-catenin信号通路的激活，阻断该信号通路可抑制活化HSC的功能。     

大鼠肝星状细胞CTGF、纤维连接蛋白和整合素的表达变化及肝复康的调节作用*

目的 观察乙醛激活的大鼠肝星状细胞（HSCs）结缔组织生长因子（CTGF）、纤维连接蛋白（FN）和整合素的表达变化,以及中药肝复康对它们表达的影响。方法 制备肝复康含药血清,体外培养HSC-T6细胞,用乙醛及肝复康含药血清干预HSCs,采用RT-PCR法检测HSCs中CTGF、FN、整合素α5、整合素β1和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA的相对光密度值。结果 乙醛刺激后HSC-T6细胞CTGF、FN、整合素α5、整合素β1和α-SMA mRNA水平分别为（1.06±0.02）、（1.28±0.23）、（2.13±0.09）、（1.57±0.50）和（2.84±0.14）,与空白对照组细胞[分别为（0.46±0.05）、（0.40±0.09）、（0.37±0.10）、（0.19±0.03）和（0.18±0.03）]相比,均显著升高（P＜0.01）,而肝复康干预能显著降低它们的水平[分别为（0.59±0.02）、（0.71±0.15）、（1.55±0.04）、（0.92±0.22）和（1.99±0.10）,P＜0.01]。结论 肝复康干预HSCs活化可能与抑制CTGF、FN、整合素α5、整合素β1和α-SMA水平有关。     

肝复康药物血清对肝星状细胞核因子-κB及I、Ⅲ型胶原表达的影响

目的:通过观察中药肝复康中剂量浓度含药血清对肝星状细胞T6(hepatic stellate cell-T6,HSC-T6)细胞株中核因子-κB(NF-κB)、Ⅰ型胶原(TypeⅠCollagen,ColⅠ)及Ⅲ型胶原(TypeⅢCollagen,ColⅢ)基因表达的影响,探讨其抗纤维化的作用及分子机制。方法:常规方法制备肝复康中剂量浓度含药血清,并用肝复康含药血清干预,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-Blot方法观察分析NF-κB、ColⅠ和ColⅢ表达的变化并探讨其相关性。结果:经乙醛刺激后的HSC-T6细胞株NF-κB、ColⅠ和ColⅢ表达均上调,肝复康中剂量浓度含药血清处理后可明显下调上述基因的表达。结论:中药肝复康抗纤维化的机制可能与其抑制NF-κB及ColⅠ、ColⅢ的表达有关。     

表达持续活化型ALK3抑制大鼠肝星状细胞活化

背景肝纤维化与肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)上皮细胞间充质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)相关, TGF-β1在其中起着重要的作用,而BMP7能够拮抗TGF-β1,目前主要研究的是TGF-β/BMPs-Smad信号通路, ALK3属于BMPs的持续活化Ⅰ型受体,在肝纤维化分子研究机制中较少运用.目的观察大鼠HSCs中稳定表达持续活化型ALK3时Smad1磷酸化及纤维化相关基因E-cadherin、α-SMA、col1A2等表达情况,探讨BMP-7信号转导在肝纤维化发生发展过程中拮抗TGF-β1信号及其抗肝纤维化机制.方法建立体外培养大鼠HSCs (HSC-T6)持续活化型ALK3的稳定表达细胞株, MTT检测细胞的增殖; RT-PCR检测col1A2等相关分子mRNA水平; Western blotting检测Samd1、E-cadherin、α-SMA、col1A2蛋白表达和Smad1磷酸化;显微镜下观察细胞形态.结果稳定表达持续活化型ALK3的HSC-T6细胞增殖受到抑制, Smad1磷酸化显著升高,α-SMA, col1A2表达下调, E-cadherin表达上调.结论 BMP-7信号转导通过增强Samd1的磷酸化而拮抗TGF-β1致纤维化作用,抑制大鼠HSCs的活化.     

BMP-7过表达抑制大鼠肝星状细胞上皮-间叶转化

目的观察慢病毒介导的BMP-7高表达是否能抑制大鼠HSC-T6细胞发生上皮-间叶转化（epithelial to mesenchymal tran-sition,EMT）,并能拮抗TGF-β1的促EMT作用。方法构建大鼠BMP-7慢病毒表达载体,体外感染HSC-T6细胞株,将成功感染BMP-7重组慢病毒的细胞给予TGF-β1（5 ng/mL）或溶酶体处理。Real-time PCR检测α-SMA、S100A4、E-cadherin mRNA转录水平。Western blotting检测α-SMA、S100A4、E-cadherin、Ⅰ型胶原蛋白表达水平。结果 BMP-7慢病毒感染HSC-T6后,无论TGF-β1存在与否,real-time PCR检测到α-SMA、S100A4 mRNA转录下调,E-cadherin转录上调。Western blotting显示α-SMA、S100A4及Ⅰ型胶原蛋白表达下调,E-cadherin蛋白表达上调。实验组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义。结论 BMP-7能有效拮抗TGF-β1对HSC-T6的促EMT作用,可能成为肝纤维化治疗的新途径。     

活血软坚方对肝星状细胞Smad信号的影响及意义

目的 活血软坚方的成药制剂-和络舒肝含药血清对肝星状细胞(HSC)-T6细胞株Smad3、Smad17、前胶原α2(Ⅰ)基因表达影响,以探讨活血软坚方抗肝纤维化作用及分子机制。方法 常规方法制备和络舒肝含药血清。用不同浓度和络舒肝含药血清干预HSC-T6细胞株,并以逆转录聚合酶链反应观察分析各组间Smad3、Smad7、前胶原α2(Ⅰ)mRNA表达的变化,以western blot检测Smad3蛋白的表达。结果 经和络舒肝含药血清处理,可下调HSC-T6细胞株Smad3、前胶原α2(Ⅰ) mRNA表达以及Smad3蛋白表达水平,前胶原α2(Ⅰ)表达变化与Smad3表达改变趋势一致。不同浓度的含药血清作用强度明显不同,药物作用后前胶原α2(Ⅰ) mRNA表达改变呈现血药浓度依赖性(F=6.92,P<0.05)。药物血清对Smad7 mRNA表达影响不明显(F=1.57,P>0.05)。结论 活血软坚方和络舒肝的抗肝纤维化作用可能是通过非特异性作用干扰转化生长因子β和Smad功能,抑制前胶原α2(Ⅰ) mRNA转录,从而减少细胞外基质生成。对Smad3而言,可能其表达升高产生的是促纤维化形成效应,反之,表现为抗纤维化作用。     

肝复康药物血清对肝星状细胞核因子-kB及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

目的:通过观察中药肝复康中剂量浓度含药血清对肝星状细胞T6(hepatic stellate cell-T6,HSC-T6)细胞株中核因子-κB (NF-κB)、Ⅰ型胶原(Type Ⅰ Collagen,Col Ⅰ)及Ⅲ型胶原(Type Ⅲ Collagen,ColⅢ)基因表达的影响,探讨其抗纤维化的作用及分子机制.方法:常规方法制备肝复康中剂量浓度含药血清,并用肝复康含药血清干预,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-Blot方法观察分析NF-κB、ColⅠ和Col Ⅲ表达的变化并探讨其相关性.结果:经乙醛刺激后的HSC -T6细胞株NF-κB、Col Ⅰ和ColⅢ表达均上调,肝复康中剂量浓度含药血清处理后可明显下调上述基因的表达.结论:中药肝复康抗纤维化的机制可能与其抑制NF-κB及Col Ⅰ、Col Ⅲ的表达有关.     

罗格列酮对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织Kruppule样因子6信号通路的影响

目的观察罗格列酮对NASH肝纤维化大鼠肝组织kruppule样因子（KLF）6及其下游靶基因TGFβ1信号通路的影响。方法36只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、高脂组和罗格列酮组,24周末处死所有大鼠,留取肝组织行HE和Massson染色,检测血清TG、游离脂肪酸、AST、ALT及HA、LN、CⅣ等,RT-PCR检测核转录因子KLF6、TGFβ1以及反映HSC活化的特异性标记α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA的变化,免疫组织化学检测KLF6、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、α-SMA的蛋白表达。结果模型组大鼠24周末出现典型脂肪性肝纤维化,治疗组纤维化程度明显减轻和改善。模型组血清生物化学指标及肝纤维化指标均有不同程度增高,罗格列酮干预16周后上述各指标均见明显改善,两组间差异有统计学意义（P〈0.01）。RT-PCR显示模型组KLF6 mRNA（0.96±0.08）、TGFβ1 mRNA（0.91±0.07）和α-SMA mRNA （1.08±0.19）的相对表达量均明显上升,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;治疗组则显示增高的上述基因呈不同程度的下降,差异有统计学意义（P〈0.01）。免疫组织化学显示罗格列酮组KLF6、α-SMA蛋白的表达较模型组减少,而PPARγ的表达较模型组增加,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论罗格列酮可以激活PPARγ,降低NASH肝纤维化大鼠肝组织核转录因子KLF6及其下游靶基因TGFβ1的表达,抑制HSC的活化,阻止肝纤维化形成,这可能是其发挥抗肝纤维化的作用之一。     

β连环蛋白在大鼠酒精性肝纤维化中的表达及意义

目的 研究Wnt信号通路的核心因子β连环蛋白(β-catenin)在大鼠酒精性肝纤维化(AHF)中的表达及意义.方法 采用白酒辅以玉米油、吡唑混合食料灌胃的方法制备大鼠AHF模型,于造模12 w后,采用Masson染色法观察肝组织纤维化程度,采用Elisa法检测大鼠血清层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型胶原前蛋白(PⅢP)水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠肝组织β-catenin mRNA的表达.结果 正常肝组织中有少量β-catenin表达,12 w末模型组大鼠肝组织中β-catenin表达明显升高.β-catenin的表达量与肝组织纤维化程度,以及血清LN、PⅢP水平呈正相关(r =0.926,0.893,0.902,P＜0.01).结论 Wnt信号通路在AHF发生发展过程中可能发挥了重要的作用.     

人脐带间充质干细胞对放射线照射后人肺成纤维细胞中经典WNT/β-catenin通路的影响

目的探讨人脐带间充质干细胞(HUMSCs)对放射线照射后的人肺成纤维细胞(HLFs)影响的机制。方法 HLFs分为照射组(A)、照射+共培养组(B)和正常对照组(C),A组和B组在5Gy X射线照射后,B组与HUMSCs通过Transwell系统共培养。照射12、24、36h后western blot检测HLFs中α-SMA、GSK-3β、p-GSK-3β和胞核内β-catenin蛋白表达,ELISA法检测细胞培养液中WISP-1、SFRP-1蛋白表达。Real time PCR检测正常和B组第36h HUMSCs中SFRP-1 mRNA表达。结果放射线照射后第24h、36h,HLFs中α-SMA、p-GSK-3β、p-GSK-3β/GSK-3β、胞核内β-catenin,以及培养液中WISP-1蛋白表达水平,A组较C组明显升高,而B组较A组明显下降,差异有统计学意义(P0.01);B组培养液中SFRP-1蛋白水平较A组、C组各时间点均显著升高,差异有统计学意义(P0.05);B组第36h的HUMSCs中SFRP-1 mRNA表达明显高于正常HUMSCs,差异有统计学意义(P0.01)。结论 HUMSCs可抑制放射线导致的HLFs中经典WNT/β-catenin通路的活化,并有可能通过该途径影响肺成纤维细胞的分化。     

Wnt/β-catenin信号通路和Dickkopf-1在胰腺癌中的研究进展

Wnt/β-catenin信号通路异常是恶性肿瘤发生的重要原因。分泌型糖蛋白Dickkopf-1(DKK-1)属Dickkopf家族成员,是Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂。近年研究发现Wnt/β-catenin信号通路和DKK-1在胰腺胚胎发育中起重要调控作用,且两者异常广泛参与胰腺癌的发生和发展。本文就Wnt/β-catenin信号通路和DKK-1的生物学特性以及两者在胰腺癌中的研究进展作一综述,旨在为胰腺癌的早期诊断和治疗提供新的理论基础。     

MicroRNA-194 inhibits cell invasion and migration in hepatocellular carcinoma through PRC1-mediated inhibition of Wnt/β-catenin signaling pathway

BackgroundHepatocellular carcinoma (HCC) is a commonly occurring malignancy accompanied by significant mortality rates. More recently, extensive investigations into microRNA (miRNA) expression profiles have been conducted to identify their ability to inhibit tumors. Thus, this study explored the role of miR-194 in epithelial-mesenchymal transition (EMT), cell invasion and migration through Wnt/β-catenin signaling pathway by binding to protein regulator of cytokinesis 1 (PRC1) in HCC.MethodsInitially, HCC related microarray data were retrieved and analyzed, and regulatory miRNAs of PRC1 were predicted accordingly. Next, the roles of miR-194, PRC1, and Wnt/β-catenin signaling pathway in HCC were determined, with relationship between PRC1 and miR-194 being verified subsequently. The role of miR-194 in cell EMT, migration, proliferation and invasion was evaluated through gain- and loss- function studies. Finally, tumor xenograft in nude mice was induced to assess tumor growth of HCC.ResultsmiR-194 affected HCC development in Wnt/β-catenin signaling pathway with putative binding sites to PRC1. MiR-194 could target PRC1. MiR-194 was downregulated while PRC1 was upregulated in HCC tissues. Additionally, miR-194 elevation and PRC1 silencing could suppress EMT, growth, proliferation, invasion, and migration in HCC cells by inactivating Wnt/β-catenin signaling pathway.ConclusionTaken together, this study demonstrated that miR-194 inhibited EMT, cell invasion and migration through inactivation of PRC1-dependent Wnt/β-catenin signaling pathway.     

β-catenin／CCN1在肝纤维化患者肝组织中的表达

目的：研究β-catenin/CCN1在肝纤维化患者肝组织中的表达及其在肝纤维化过程中的作用。方法免疫组织化学检测肝纤维化患者及正常对照组肝组织中β-catenin、CCN1、α-SM A 的表达情况。统计学分析β-catenin与CCN1的相关性。结果肝纤维化患者肝组织中β-catenin、CCN1的表达明显增高,主要表达在α-SM A阳性的纤维间隔周围的肝细胞,其中部分肝细胞β-catenin发生入核移位;相关性分析结果显示,肝纤维化患者肝组织中肝细胞表达β-catenin与CCN1呈正相关。结论在肝纤维化的发生过程中,纤维间隔周围肝细胞通过β-catenin上调 CCN1参与肝纤维化的发生发展。     

胃泌素对胃癌细胞EMT和Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达的影响

目的探讨高表达胃泌素(gastrin)对胃癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响及可能机制。方法用gastrin过表达质粒pcDNA3-gastrin及空载体pcDNA3.1转染胃癌细胞SGC-7901、MKN45,48 h后收集细胞蛋白,Western印迹检测鉴定gastrin表达,检测EMT相关标志物E-钙黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、Snail及wnt/β-连环蛋白(catenin)信号通路相关基因wnt3α、β-catenin、c-myc的蛋白表达变化。结果在SGC-7901、MKN45细胞中成功过表达gastrin。与pcDNA3.1空载体转染组相比,pcDNA3.1-gastrin转染SGC-7901、MKN45细胞中上皮标志蛋白E-cadherin表达下调,间质标志蛋白N-cadherin、Snail表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);同时Wnt/β-catenin通路蛋白相关蛋白wnt3α、β-catenin及其下游基因c-myc的表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达gastrin能够激活Wnt/β-catenin信号通路和促进胃癌细胞SGC-7901和MKN45发生EMT。     

Flavonoids of Herba Epimedii regulate osteogenesis of human mesenchymal stem cells through BMP and Wnt/β-catenin signaling pathway

Herba Epimedii is one of the most commonly used Chinese herbs for treating osteoporosis. In the present study, the flavonoids of Herba Epimedii (HEF) have shown to promote the osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. They were noted to enhance the mRNA expression of BMP-2, BMP-4, Runx2, β-catenin and cyclinD1, all of which are BMP or Wnt-signaling pathway related regulators. The osteogenic effect was inhibited by the introduction of noggin and DKK-1, which is classical inhibitor of BMP and Wnt/β-catenin signaling, respectively. These results suggest that HEF exerts promoting effect on osteogenic differentiation, which plausibly functions via the BMP and Wnt/β-catenin signaling pathways. Considering the therapeutic efficiency and economical issues, HEF may be a potential candidate for promoting bone regeneration. On the other hand, osteogenic differentiation of MSCs may also be a promising and attractive tool to apply in bone repair.     

Down-regulation of transforming growth factor β1/activin receptor-like kinase 1 pathway gene expression by herbal compound 861 is related to deactivation of LX-2 cells

AIM: To investigate the effect of herbal compound 861(Cpd861) on the transforming growth factor-131 (TGFβ1)/activin receptor-like kinase 1 (ALK1, type I receptor)signaling-pathway-related gene expression in the LX-2 cell line, and the inhibitory mechanism of Cpd861 on the activation of LX-2 cells.METHODS: LX-2 cells were treated with TGFβ1(5 ng/mL) Cpd861 (0.1 mg/mL), TGFβ1 (5 ng/mL) plus Cpd861 (5 ng/mL) for 24 h to investigate the effect of Cpd861 on the TGFβ1/ALK1 pathway. Real-time PCR was performed to examine the expression of α-SMA (α-smooth muscle actin), ALK1, Id1 (inhibitor of differentiation 1). Western blotting was carried out to measure the levels of α-SMA and phosphorylated Smadl,and immunocytochemical analysis for the expression of α-SMA.RESULTS: In LX-2 cells, TGFβ1/ALK1-pathway-related gene expression could be stimulated by TGFβ1, which led to excessive activation of the cells. Cpd861 decreased the activation of LX-2 cells by reducing the expression of α-SMA mRNA and protein expression. This effect was related to inhibition of the above TGFβ1/ALK1-pathwayrelated expression of genes such as Id1 and ALK1, and phosphorylation of Smad1 in LX-2 cells, even with TGFβ1 co-treatment for 24 h.CONCLUSION: Cpd861 can restrain the activation of LX-2 cells by inhibiting the TGFβ1/ALK1/Smad1 pathway.