本期专题：中医药方法干预软骨细胞的增殖与凋亡②（本刊中文部）

5电针后血清对肿瘤坏死因子a诱导软骨细胞凋亡的影响吴明霞（福建中医药大学附属第二人民医院针灸科,福建省福州市350003）推荐理由：如何有效抑制软骨细胞凋亡可能是防治骨性关节炎的有效方法之一。电针可起到补肾益精、舒筋通络、消肿止痛的作用,其治疗作用具有多层面、多途径、多耙羔的特点,经过中枢的整合可有效调控信号转导通路采调节机体的免疫应答,以及细胞的增殖、分1匕及凋亡,从而能有数减轻患者的临床症状。为探讨电针的作用机制,     

本期专题：中医药方法干预软骨细胞的增殖与凋亡①（本刊中文部）

1鹿茸多肽干预膝骨性关节炎软骨细胞的增殖．见2011年24期4448-4452页。2透骨消痛颗粒对关节软骨细胞wnt／13一连环蛋白信号通路的调控,见2011年46期8574．8578页。3威灵仙干预体外培养兔膝关节软骨细胞增殖及转化生长因子β1mRNA基因的表达,见2010年11期1901-1906页。4六味地黄丸含药血清对软骨终板蛋白多糖的影响,见2011年46期8565-8568页。     

肢体缺血再灌注后关节软骨细胞凋亡的规律

目的：观察肢体缺血再灌注后关节软骨细胞凋亡情况，探讨其机制及凋亡对关节软骨退行性变的影响。方法：35只成年健康新西兰大白兔随机分为7组(每组5只)，行左侧后肢缺血8h(右侧为对照)，于再灌注后1，3d，1，2，4，8和12周取膝关节胫骨平台软骨组织，行透射电镜观察，原位末端标记(in situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法检测关节软骨细胞凋亡情况。结果：肢体缺血再灌注后1d，实验侧的TUNEL阳性细胞均数[(19．8&;#177;2．1)个／高倍视野)]明显多于对照侧(P&;lt;0．01)，3d组最多，达到对照侧的360％，之后逐渐回落。透射电镜下发现缺血再灌注早期大量细胞坏死。结论：肢体缺血再灌注可引起关节软骨细胞损伤，软骨细胞凋亡，导致关节软骨蜕变。     

软骨细胞凋亡与骨性关节炎

骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是人类最常见的一种关节疾病,是以关节软骨退行性变和关节周围继发性骨质增生为病理特征的慢性进行性骨关节病。多见于中老年人,女性多于男性。患者主要表现疼痛、僵硬等,给患者带来较大的痛苦,严重影响患者的生活质量。随着人口老龄化进程的加速,这一问题日益突出。但是,由于OA的病因和发病机制尚未完全阐明,目前还缺乏特异性的治疗手段。     

成人关节软骨细胞增殖与人参皂甙Rg1的促进作用

背景：人参总皂甙的主要有效成分为人参皂甙Rg1,有促进细胞增殖、抗衰老、抗细胞凋亡、抗炎及抗自由基等作用,但以往实验对象多为鼠、兔等动物的关节软骨细胞。目的：体外培养成人软骨细胞,观察人参皂甙Rg1对体外培养的成人关节软骨细胞增殖的促进作用。方法：实验分2组,Rg1组使用含质量浓度为40mg/L人参皂甙Rg1的DMEM培养液培养,对照组使用未加人参皂甙的DMEM培养液培养,每日应用倒置相差显微镜观察细胞生长情况至第7天,并进行细胞计数。同时培养至第6天检测软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：对照组自培养第2天起细胞进入对数增殖期,到第7天细胞数约为接种时的8倍。Rg1组自培养第2天起细胞增殖能力较对照组增强（P〈0.05）,到第7天细胞数约为接种时的18倍（P〈0.05）。免疫组织化学SABC法检测结果显示,Rg1组与对照组细胞胞浆均可见Ⅱ型胶原表达,两组差异无显著性意义（P〉0.05）。说明人参皂甙Rg1可促进成人软骨细胞的增殖。     

海藻酸钠载体中成年兔关节软骨细胞生长情况

目的:软骨细胞单层培养条件下增殖较快,但极易失分化,在生物载体材料构成的立体环境中培养,则能较好的维持表型。实验以海藻酸钠为载体,观察兔关节软骨细表型及增殖情况。方法:实验于2005-09/2006-12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。①实验动物和材料:6月龄新西兰大白兔24只,雌雄各半。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。海藻酸钠由青岛明月海藻公司提供。②实验方法:以培养液配制的0.4% Pronease酶、0.025%Ⅱ型胶原酶顺序消化兔软骨分离细胞,以4×109 L-1海藻酸钠的浓度制成细胞悬液。③实验评估:倒置显微镜观察细胞在海藻酸钠中的形态及增殖情况,检测细胞收获效率和存活率。苏木精-伊红染色和AB-PAS染色观察软骨细胞的生长情况及评价软骨分泌胶原的情况。免疫组织化学定性观察Ⅱ型胶原的含量变化及有无Ⅰ型胶原的产生。Alcian blue染色法测定细胞盘中蛋白多糖的含量变化。结果:①软骨经两步酶消化软骨基质逐步解离和降解,细胞被完全分离,消化分离的软骨细胞总数达到5×106,细胞成活率达95.5%。②软骨细胞与海藻酸钠复合后体外培养,细胞生长旺盛、增殖活跃,增殖成株状或岛状,株状细胞团周围有类似的软骨陷窝形成,细胞排列密集,核圆形。③Ⅱ型胶原免疫组化和AB-PAS染色均呈阳性,细胞盘中蛋白多糖含量随培养时间延长逐渐增加。结论:海藻酸钠凝胶能与软骨细胞完全嵌合,是一种良好的软骨组织工程材料。     

成人关节软骨细胞增殖与人参皂甙Rg1的促进作用☆

背景:人参总皂甙的主要有效成分为人参皂甙Rg1,有促进细胞增殖、抗衰老、抗细胞凋亡、抗炎及抗自由基等作用,但以往实验对象多为鼠、兔等动物的关节软骨细胞.目的:体外培养成人软骨细胞,观察人参皂甙Rg1对体外培养的成人关节软骨细胞增殖的促进作用.方法:实验分2组,Rg1组使用含质量浓度为40 mg/L人参皂甙Rg1的DMEM培养液培养,对照组使用未加人参皂甙的DMEM培养液培养,每日应用倒置相差显微镜观察细胞生长情况至第7天,并进行细胞计数.同时培养至第6天检测软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达.结果与结论:对照组自培养第2天起细胞进入对数增殖期,到第7天细胞数约为接种时的8倍.Rg1组自培养第2天起细胞增殖能力较对照组增强(P <0.05),到第7天细胞数约为接种时的18倍(P <0.05).免疫组织化学SABC法检测结果显示,Rg1组与对照组细胞胞浆均可见Ⅱ型胶原表达,两组差异无显著性意义(P >0.05).说明人参皂甙Rg1可促进成人软骨细胞的增殖.     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的:研究软骨组织工程中传代软骨细胞与原代的差异。方法:用5个月人胎关节软骨分离培养细胞,观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学的改变。结果:(1)软骨块在4℃下,3d 内细胞存活率可达 93.4％～97.6％。(2)原代细胞为圆形或三角形;第4代有一半转变成梭形,到第6代全部变为长梭形。(3)传代细胞贴壁时间(2～3h)短于原代(4～7h)。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为78.7％～85.5％,原代8.8％。(4)生长曲线表明,从原代到第4代都有高增殖力;到第8代时增殖降低;到第12代几乎丧失细胞增殖。结论:软骨块4℃冷藏,3d内对细胞存活率无明显影响。第4代细胞贴壁快、增殖快,适于作为组织工程用细胞。第8代以后不适合。     

揉髌手法对兔膝关节软骨细胞凋亡及增殖细胞核抗原表达的影响

背景:有研究表明手法的力学刺激作用和关节被动活动可促进促进关节周围组织的自我修复,但手法治疗对膝关节软骨细胞凋亡和增殖的影响目前未见报道.目的:用揉髌手法施术于骨内高压型动物的右下肢,探讨对兔膝关节软骨细胞凋亡和增殖细胞核抗原表达的影响.方法:将新西兰兔随机分为5组:揉髌手法组、玻璃酸钠组和模型组采用手术结扎股静脉,臀下静脉、大隐静脉方法建立右下肢骨内高压型模型;假手术组予以手术暴露但不结扎相应血管;正常对照组不作任何处理.造模1周后,揉髌手法组采用揉髌手法连续治疗5周共17次;玻璃酸钠组每周右膝关节内注射1次,连续5周.于造模后12周末分别取所有动物右膝胫骨平台软骨组织,采用原位末端标记法观察软骨细胞凋亡,免疫组化法观察增殖细胞核抗原的表达.结果与结论:揉髌手法组软骨细胞凋亡率低于模型组(P＜0.01).揉髌手法组增殖细胞核抗原表达率高于模型组(P＜0.01).结果表明揉髌手法治疗可以降低实验兔膝关节软骨细胞凋亡率及提高增殖细胞核抗原表达率.     

缺血再灌流股骨头骺影响关节软骨细胞的凋亡☆

背景：缺血再灌注后可以引起关节软骨的退行性变化,但其中具体机制尚无公识。目的：观察发育期髋关节股骨头骺关节软骨及缺血再灌注后关节软骨的退行性变化及其细胞凋亡现象。方法：80只 SD 大鼠随机分为2组,缺血再灌注组建立髋关节缺血再灌注实验动物模型,假手术组开腹暴露腹主动脉5 min 常规关腹。于模型建立后6 h,12 h,24 h,48 h,5 d,2周,4周不同时点对股骨头骺关节软骨进行光镜病理形态学观察,同时对标本进行 TUNEL 法检测股骨头骺关节软骨细胞凋亡现象。结果与结论：缺血再灌注组术后光镜观察到软骨细胞变性、减少、基质可见局限性纤维化等关节软骨退行变化,两组 TUNEL 法检测均观察到关节软骨细胞的凋亡现象,假手术组偶见有散在分布5个以下的软骨细胞凋亡,缺血再灌注组观察到48 h 可见10-30个软骨细胞发生凋亡。结果提示,缺血再灌注对髋关节股骨头骺关节软骨可引起退行性改变,发育期髋关节缺血再灌注后关节软骨的细胞凋亡可能参与关节软骨的损害,抑制关节软骨的细胞凋亡可能有助于防治早发的骨关节炎。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对软骨细胞凋亡的抑制

目的：探讨胰岛紊样生长因子-Ⅰ(IGF-I)对软骨细胞增殖及白细胞介素-Ⅰ(IL-1)诱导软骨细胞凋亡的影响，揭示其抗损伤作用机制，为关节软骨损伤治疗提供理论依据。方法：分离培养人胚胎关节软骨细胞，采用四氮甲基唑蓝(MTT)法测定不同含量软骨细胞增殖活性的变化，利用光镜、电镜、DNA电泳及流式细胞仪测定作为凋亡检测指标。结果：IGF-I呈剂量依赖式促软骨细胞增殖，当IGF-I含量达50μg／L时，促软骨细胞增殖作用达最大值。IL-1组光镜、电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变，琼脂糖凝胶电泳示特征性的DNA梯状条带，IGF-I处理组未见明显凋亡征象。流式细胞仪检测发现，IGF-I处理后软骨细胞凋亡率显著降低。结论：IGF-I能促进软骨细胞增殖，对IL-1诱导的软骨细胞凋亡具有保护作用。     

改良分步消化法培养原代软骨细胞

背景：胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂,容易污染,但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道。目的：采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,以获取大量纯净的软骨细胞。方法：将新西兰白兔6只随机分2组,酶消化法组运用酶消化法分两步获取原代软骨细胞,对照组用传统法进行原代软骨细胞培养。培养1周后观察两组培养的软骨细胞的生长状态,并进行细胞鉴定、计数,评估改良后的方法对细胞的影响。结果与结论：酶消化法组采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞,与对照组相比,可将6h以上的消化时间缩短至3h。两组原代软骨细胞培养24h均多呈圆形,悬浮状态,48h后贴壁,培养1周后,两组软骨细胞可铺满培养瓶底。结果证实,采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,在缩短了消化时间的同时其细胞生长及形态变化均无改变,可以顺利获取大量纯净的软骨细胞。     

改良分步消化法培养原代软骨细胞

背景:胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂,容易污染,但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道.目的:采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,以获取大量纯净的软骨细胞.方法:将新西兰白兔6只随机分2组,酶消化法组运用酶消化法分两步获取原代软骨细胞,对照组用传统法进行原代软骨细胞培养.培养1周后观察两组培养的软骨细胞的生长状态,并进行细胞鉴定、计数,评估改良后的方法对细胞的影响.结果与结论:酶消化法组采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞,与对照组相比,可将6 h以上的消化时间缩短至3 h.两组原代软骨细胞培养24 h均多呈圆形,悬浮状态,48 h后贴壁,培养1周后,两组软骨细胞可铺满培养瓶底.结果证实,采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,在缩短了消化时间的同时其细胞生长及形态变化均无改变,可以顺利获取大量纯净的软骨细胞.     

软骨组织工程研究中细胞源-软骨细胞和成纤维细胞

目前关节软骨仍是供软骨修复的主要软骨细胞来源,但获得关节面软骨本身是一种有创操作,且细胞的低产量,低有丝分裂率,低生物活性进一步限制了关节软骨作为供体细胞来源的实际临床应用.体内其他作为自体软骨细胞源包括耳骨、鼻中隔、肋软骨、颞颌关节髁突软骨等,而不同的软骨源具有不同的结构、组成和功能,产生具有不同生化、物理和生物力学特性的细胞及细胞外基质.目前用于软骨再生的软骨细胞主要来源于幼稚动物,这些刚出生的和幼体动物的软骨细胞较年老供体的软骨细胞增殖率高,形成软骨的潜能较强.皮肤可为组织工程提供一种侵袭性小、来源丰富的成纤维细胞源.将成纤维细胞直接置于软骨缺损的聚乳酸网格会导致纤维组织增生,然而在恰当的培养条件下,成纤维细胞可以被诱导向软骨细胞表型转化.     

应用组织工程学技术修复关节软骨缺损

目的：关节软骨缺损一直是临床上的一个难题。目前的治疗包括自体或异体骨软骨移植修复、软骨膜或骨膜移植修复、组织工程学技术的发展使体外培养软骨细胞修复关节软骨缺损进入了一个新的发展时期，通过查阅文献对体外培养软骨细胞修复关节软骨缺损进行综述。资料来源：应用汁算机检索Medline 1993-01／2004-06关于组织工程学技术修复关节软骨缺损的文章，检索词为“articular cartilage defects、tissue engineering technology”，限定语言种类为英文；同时计算机检索中国期刊数据库1993-01／2004-06相关组织工程学技术修复关节软骨缺损的文章，检索词“关节软骨缺损，组织工程学技术，体外培养”，限定语言种类为中文资料选择：对资料进行初审，纳入标准：小有关软骨细胞的结构、功能、及其体外培养的意义研究：②有关体外培养种子细胞的选择的研究：⑧软骨细胞修复关常软骨缺损的前景展望的研究。排除标准：文献中重复研究、综述、Mata分析类文章：未排除文章中资料是否应用了随机、对照和盲法。资料提炼：共收集到32篇相关文献，含追溯法查找文献6篇，18篇符合纳入标准，排除14篇文献，其中4篇系重复研究，7篇为临床应用，3篇为软骨细胞支架的研究。18篇文献中有7篇对软骨细胞的特征进行综述，5篇是理想种子细胞的选择的研究，6篇为软骨细胞修复关节软骨缺损的前景展望的研究一资料综合：软骨细胞体外培养大量扩增、分化维持其正常的表型及代谢的调控因素为组织工程化软骨修复软骨缺损、体外培养软骨细胞建立软骨细胞库开拓了一条新的途径：软骨细胞，间充质干细胞（骨髓、骨膜或软骨膜来源）、滑膜细胞或转基因细胞等均町作为种子细胞。可来源于同种异体甚至异种细胞。自体软骨细胞植入技术已经作为一个传统自体软骨细胞移植术的替代品被骨科界广泛接受：结论：体外培养软骨细胞技术，目前已经成熟。组织工程学技术修复关节软骨缺损的方法很多：组织工程学技术的发展使体外培养转骨细胞修复关节软骨缺损进入了一个新的发展时期，基质诱导的自体软骨细胞植入技术修复关节软骨缺损开辟了新的道路。     

骨关节炎的软骨细胞凋亡机制

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种退行性关节病,常见于老年人。目前ΟΑ的具体发病机制尚不明确,当骨关节软骨基质降解后,会导致骨钙质出现沉积现象;骨关节中凋亡的软骨细胞,未能全部清除,遗留在软骨中,对软骨细胞功能造成严重影响;在骨关节中的软骨细胞处于凋亡时期,若其基质合成较低,将导致ΟΑ的发生[1],故阐明软骨细胞凋亡的机制很有意义。本文将着重从信号通路、细胞因子、基因三方面对OA软骨细胞凋亡机制作一综述。     

周期性张应力促进兔髁状突软骨细胞的增殖

背景：髁状突是下颌最重要的生长区之一,终生具有生长改建能力。在体内条件下,细胞力学的功能研究因其所处生理环境的复杂性、刺激因素传导的不定向性、实验条件的不易控制性而很难得到满意结果,应力刺激对髁状突软骨细胞的直接影响需要进一步行体外研究。目的：观察周期性张应力对体外培养兔髁状突软骨细胞生长增殖的影响。方法：体外分离培养及鉴定兔髁状突软骨细胞,在细胞培养至第3代时使用细胞加力装置对细胞施加强度为10%,频率为6循环/min的周期性张应力,作用时间分别为1,6,12和24 h,并设置未加力组作为对照。应用流式细胞仪检测细胞生长周期,应用MTT法分析细胞的增殖活性。结果与结论：在周期性张应力下,髁状突软骨细胞流式细胞仪检测结果显示在加力6 h和12 h,加力组细胞生长周期开始有显著性变化,在24 h达到实验最大值,差异有显著性意义（P〈0.01）。MTT检测结果示细胞生长活跃,在6,12 h与对照组有明显变化,在24 h达到实验最大值,差异有显著性意义（P 〈0.01）。提示周期性张应力可明显促进髁状突细胞增殖,在24 h内具有持续促进作用。     

软骨细胞的老化对软骨蛋白聚糖代谢的影响

目的：探讨体外培养猪耳软骨细胞在老化过程中，软和糖（aggrecan)的代谢状况与分子结构的变化及其水解酶（aggrecanase)表达水平的改变。由此进一步阐明aggrecan在组织工程软骨构建中起决定性的作用。方法：取体外培养P1－P9各代猪耳软骨细胞及其培养液，爱茜蓝（Alcian Blue)法检测培养液中蛋白聚糖的含量和糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG)的分子结构。RT－PCR检测aggrecanase-1和－2的mRNA表达水平。结果：在P1细胞的培养液中，蛋白聚糖的含量和长链／高度硫酸化的GAG含量都是最高的。由P4细胞开始，这2项指标均显著减少（P＜0．01），且两者的变化趋势有显著的相关性（P＜0．01）。Aggrecanase-1 mRNA在前3代细胞基本无表达，P4细胞中有显著上升（P＜0．01），随后逐渐减少，P8细胞又不再表达。Aggrecanase-2 mRNA的表达呈随机状态，与细胞代数无显著性相关（P＞0．05）。结论：体外培养软骨细胞的老化对aggrecan的代谢有非常大的影响。一方面aggrecan的合成减少，大分子聚合物形成受阻；另一方面胞外基质的水解作用加剧，最终导致老化细胞的基质崩解。     

骨关节炎中影响软骨细胞凋亡的因素

目的：近年来国外对骨关节炎的发生及发展机制有许多研究成果，骨关节炎中软骨细胞凋亡影响因素的研究颇具新意。资料来源：应用计算机检索Medline 1985-01／2004—12与骨关节炎中软骨细胞凋亡相关的文献，检索词“osteoarthrltis，chondrocyte，apoptosis”，并限定文献语种为English。资料选择：对资料的摘要进行阅读初审，选取包括试验组和对照组的文献，开始查找全文。纳入标准：①随机对照试验。②试验包括对照组。排除标准：①没有设立对照组的文献。②综述类文献、Meta分析、重复研究。资料提炼：共收集到111篇关于骨关节炎中软骨细胞凋亡影响因素的试验，纳入符合标准的文献35篇。排除的文献为综述类文献28篇和重复研究48篇。35篇文献多为软骨细胞体外培养有关的试验，分别对各种凋亡影响因素进行评价。资料综合：在骨关节炎患者和老年人的软骨中，由于细胞外基质成分降解或通过高级糖基化、酪氨酸亚硝基化等修饰作用破坏了正常的细胞外基质从而使软骨细胞发生炎症反应并促进其死亡。各种机械性刺激是软骨细胞功能的重要调节因素，施加机械压力的加速率也决定软骨损伤和软骨细胞死亡的类型与程度。经某些细胞因子作用的正常软骨和分离培养的软骨细胞产生高水平的NO，而NO产物又能诱导软骨细胞死亡。肿瘤坏死因子受体超家族成员与相应的死亡配体结合能激活凋亡信号通路，当存在其他前凋亡因子或缺乏某些促存活因子时肿瘤坏死因子α能诱导软骨细胞凋亡。正是由于能量代谢受损使软骨细胞对其他的致死因子变得更加敏感。在发育和骨关节疾病相关过程中，软骨细胞的死亡虽然有p53的参与，但其精确的机制有待阐明，同时没有足够的直接证据表明c—myc能够影响软骨细胞的存活或死亡。结论：骨关节炎中影响软骨细胞凋亡的因素很多，机制复杂，许多因素导致软骨细胞凋亡的通路有待进一步阐明。     

威灵仙提取物干预膝骨关节炎软骨细胞的生长活力

背景:近年来研究显示关节软骨细胞过度凋亡是骨性关节炎开始和进展的关键因素,利用药物抑制软骨细胞凋亡来控制骨性关节炎的进展是现在的研究热点。而威灵仙在国内临床治疗骨关节炎时取得了较确切的疗效,但是其具体的作用机制是否通过抑制软骨细胞凋亡来实现尚未见相关报道。目的:观察中药威灵仙提取物对膝骨关节炎软骨细胞生长活力的影响。方法:取骨关节炎晚期行膝关节置换的关节软骨,剪碎后,采用酶消化法消化细胞,将处于对数生长期第3代细胞随机分组,实验组分别加入0.01,0.05,0.1,0.5,1.0g/L威灵仙提取物培养基,对照组仅加入普通培养基进行培养。Live/Dead染色法测定人软骨细胞活力指数,TUNEL染色法测定人软骨细胞凋亡指数。结果与结论:0.05,0.1g/L威灵仙提取物能明显提高软骨细胞活力,而0.5,1.0g/L威灵仙提取物反而降低了软骨细胞活力,其活力指数与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05);0.01,0.05,0.1g/L威灵仙提取物能有效抑制软骨细胞凋亡,1.0g/L威灵仙提取物反而促进了软骨细胞凋亡,其凋亡指数与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05)。结果可见威灵仙提取物在合适的质量浓度时能有效提高人软骨细胞活力,抑制人软骨细胞凋亡,尤以0.1g/L时效果最佳。