定点整合型基因治疗腺病毒载体的构建

目的：构建定点整合型基因治疗腺病毒载体。方法：以逐步亚克隆法将腺病毒伴随病毒的两个末端倒转重复序列与ｎｅｏ基因表达盒克隆至ｐＡｄＥ１ＣＭＶ，其中ＨＣＭＶ启动子控制下的ｎｅｏ基因表达盒位于腺病毒两个末端倒转重复序列之间，将得到的转移载体ｐＡｄＥ１ｅｍｖｉｔｒｅｘｎｅｏ ＤＮＡ和ｐＪＭ１７ ＤＮＡ以脂质体法共转染２９３细胞、Ｇ４１８法连续筛选重组腺病毒，以病毒核酸酶切及感染２９３细胞的ＣＰＥ观察鉴定是     

构建MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1表达的腺病毒载体

目的：构建串联的MYC反应元件修饰人端粒酶逆转录酶（hTERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1表达的复制缺陷型腺病毒载体。方法：将串联的MYC反应元件修饰的hTERT核心启动子及下游酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1克隆到穿梭质粒pDC316上，上辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞获得重组复制缺陷型腺病毒并在HEK293细胞中扩增重组病毒。PCR法及斑形成实验鉴定重组腺病毒和病毒滴度。结果：成功获得由6倍和18倍MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的复制缺陷型腺病毒载体。结论：MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的腺病毒载体为进一步研究骨肉瘤转录靶向基因治疗奠定了基础。     

人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备

目的：制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法：酶切pMD18T-NP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至芽梭载体构建重组pAcTrack-CMV-NP9载体，线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183，通过同源重组得到重组的pAD-NP9病毒载体将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒。结果：酶切鉴定得到阳性pAD-NP9重组腺病毒载体，该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装，转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(CFP)表达并逐渐增多、增强：结论：成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒，为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础。     

腺病毒和腺伴随病毒基因元件提高白细胞介素—6在真核细胞中 …

目的：构建高效真核表达载体以提高细胞因子在真核细胞中的表达效率方法：利用基因克隆技术构建了两个新的白细胞介素－６（ＩＬ－６）真核表达载体ｐＡｄＣＩＬ－６和ｐ３３５ＣＩＬ－６。将它们瞬时转染ＣＯＳ－７细胞后,利用ＩＬ－６依赖株７ＴＤ１对上清中的ＩＬ－６进行检测。结果：两种新建载体分别能提高ＩＬ－６在真核细胞中的表达效率５．５和３．４倍。结论：腺病毒的病毒相关Ⅰ和ⅡＲＮＡ和腺伴随病毒的倒转末端重复序列     

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建

【目的】构建小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，为T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的T-bet生物表达系统。【方法】采用内切酶从质粒T-bet／GFP-RV中切获约1．7kb的小鼠T-betcDNA片段，与穿梭质粒pShuttle连接，再通过稀有酶切位点将含T-betcDNA的表达盒与Adeno-X腺病毒载体骨架连接，构建重组载体pAdeno-T-bet，测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变，并转染HEK293细胞，出现CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒DNA行PCR鉴定。【结果】PCR及酶切证实：T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒pShuttle中，带T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区，并在HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒pAdeno-T-bet。【结论】本实验成功构建了小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒。     

2型腺伴随病毒基因治疗载体的构建

目的：构建一种适用于中枢神经系统疾病的基因治疗载体。方法：以野生型2型腺伴随病毒（AAV-2）质粒pssv9int-及逆转录病毒载体质粒plxsn为基本元件，利用重组DNA技术，构建了一种通用型AAV载体质粒pssHG-Neo。结果：该质粒除含有必备的原核细胞复制子及Amp^r筛选基因外，还含有真核细胞筛选基因——Neo^r及供插入目的基因的多克隆位点（MCS），在MCS的上游为逆转录病毒的长末端重复序列（5’LTR），具有启动子的功能，启动定向插入到MCS的外源目的基因。质粒中的AAV反向末端重复序列（ITR）具有定点整合于人基因组19号染色体S1位点的特点。结论：AAV载体是具有广阔前景的基因治疗载体。     

大鼠心肌肌钙蛋白I基因Lys184缺失突变重组腺病毒载体的构建

目的:构建SD大鼠心肌肌钙蛋白I(cTnI)赖氨酸(Lys)184缺失突变重组腺病毒载体。方法:利用PCR定点突变方法给大鼠cTn I基因引入Lys184缺失突变,将扩增片段克隆至pMD18-T载体,在C末端用PCR法加6×组氨酸(His)标签序列后,再亚克隆至Adeno-X腺病毒DNA,转染HEK 293细胞,包装形成重组腺病毒(Ad-cTnILys184del)。结果:PCR及测序结果表明,重组腺病毒序列正确,Western blot证明有融合突变蛋白表达。结论:本研究成功地构建了大鼠cTnI Lys184缺失突变重组腺病毒载体,为后续的功能研究提供了有价值的研究材料。     

构建由缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型腺病毒

目的：构建由缺氧反应元件串联重复体修饰的人端粒酶逆转录酶（hTERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒。方法：人工设计缺氧反应元件串联重复序列，克隆后插入hTERT启动子上游并经测序证实。将修饰后的hTERT启动子和酵母胞嘧啶脱氨酶基因FCY1插入穿梭质粒，与辅助质粒共转染HEK293细胞，重组产生复制缺陷型腺病毒。结果：获得了由3倍和6倍缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒。结论：基于Cre重组酶／loxP的腺病毒载体构建系统操作简便、重组效率高。     

G418抗性HEK293细胞的培育

目的　培育具有G418抗性的HEK2 93细胞 ,用于建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有neo基因的质粒pIRESneo导入HEK2 93细胞中 ,利用G418的选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行了PCR鉴定。结果　经 6 0 0 μg ml的G418压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性细胞的形态和生长速度与筛选前细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了G418抗性HEK2 93细胞 ,为建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型奠定了基础。     

人鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义腺病毒载体的构建

目的：构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)第三外显子和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)翻译起始位点双反义RNA腺病毒载体。方法：应用RT-PCR方法扩增出SAMDC mRNA翻译起始位点区205 bp的基因片断。插入PMD-18T载体中．经XbaI、XhoI酶切回收,反向插入穿梭质粒pAdTrack-CMV-ODCr,形成重组质粒pAdTrack-ODC-SAMDCr。经PmeI酶切线性化后,转入Adeasy-1细菌与pAdeasy-1质粒发生同源重组。挑选阳性重组质粒pAdeasy-ODC-SAMDCr,经PacI酶切后,转染293细胞,包装出腺病毒颗粒．经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果：利用RT-PCR方法成功地从大肠癌细胞扩增出205bp的cDNA片断,经测序证实为SAMDC翻译起始位点序列。测序证实,重组质粒pAdTrack-ODC-SAMDCr两个基因插入方向和序列均正确．转入Adeasy-1细菌获得多个阳性重组克隆。pAdeasy-ODC-SAMDCr转染293细胞进行包装扩增．可见明显病毒空斑形成,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在293细胞中表达．PCR法证实含有目的基因。结论：成功构建并扩增出ODC和SAMDC双反义RNA腺病毒载体．为以后肿瘤的基因治疗和预防研究提供了必要工具。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.     

一种重组腺病毒载体产生及操作的新方法

目的建立一种快速、高效的产生腺病毒的实验方法。方法将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)装在穿梭质粒，线性化后与腺病毒骨架载体一起电穿孔转染大肠杆菌，使之同源重组，产生病毒基因组质粒。后Pac酶切，脂质体介导转入293细胞以包装出病毒。扩增后收获病毒，氯化铯密度梯度离心纯化，空斑试验测滴度。结果52个大肠杆菌克隆，其中有1个发生同源重组，产生腺病毒基因组质粒pAdEGFP，转染293细胞，荧光显微镜下产生绿色荧光。病毒纯化后达10^11pfu／ml。结论大肠杆菌内质粒间同源重组的方法可以高效、简便、快捷地产生重组腺病毒载体，是一种很好的制备重组腺病毒载体的方法。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达及生物活性分析

采用RT PCR方法 ,从人扁桃体组织中扩增得到人胰岛素样生长因子 1 (IGF 1 )cDNA ,利用基因重组技术将该基因片段重组于pcDNA3 .1 ( +)真核表达载体上 ,成功构建了 pcDNA/I重组表达载体。应用脂质体介导的基因转移技术将重组质粒体外转染至人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。MTT法检测结果表明 :重组质粒转染能明显促进内皮细胞的分裂增生。将重组质粒通过脂质体介导 ,体外转染至人肾细胞 2 93细胞系进行表达 ,经G41 8筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆 ,表达产物经鸡胚绒毛尿囊膜试验表明有促血管生成活性。此结果为研究IGF 1对血管内皮细胞作用的分子机制 ,以及利用IGF 1基因治疗肢体及冠状动脉缺血性疾病等的研究奠定了实验基础。     

双亚基共表达人白细胞介素12重组腺病毒载体的构建与应用

目的构建双亚基共表达人白细胞介素１２（ＩＬ－１２）重组腺病毒载体,为其临床研究提供实验基础。方法利用ＲＴ－ＰＣＲ分别克隆出人ＩＬ－１２两个亚基ｐ４０和ｐ３５的全长编码ｃＤＮＡ,经脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点（ＩＲＥＳ）序列连接后置于ＣＭＶ启动子下游,将其插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘ１ｃｗ,构建成人ＩＬ－１２的双顺反子共表达重组腺病毒载体;与ＥｃｏＴ２２Ｉ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞,经同源重组制备人ＩＬ－１２的重组腺病毒。结果扩增到的人白介素１２重组腺病毒滴度为２．１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ,体外感染２９３细胞、ＨｅｐＧ２细胞和人原代皮肤成纤维细胞后,经ＥＬＩＳＡ检测证实人ＩＬ－１２的表达（３０～５０ｎｇ／１０６细胞／２４小时）,所表达的ＩＬ－１２体外能刺激人淋巴母细胞的增殖和ＩＦＮ－γ的产生。结论所制备的人ＩＬ－１２双亚基共表达重组腺病毒载体能有效表达具有生物学活性的人ＩＬ－１２,可望进一步用于临床研究。     

逆转录病毒介导人重组骨形态发生蛋白基因转染骨骼肌卫星细胞mRNA的表达

目的：探讨逆转录病毒介导重组人骨形态发生蛋白7（recombinant human bone morphogenetic protein7,rhBMP7)基因转染骨骼肌卫星细胞的可行性及目的基因的表达情况。方法：体外获取和培养大鼠骨骼肌卫星细胞，构建rhBMP7逆转录病毒载体，利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，经G418筛选后，制备含目的基因和重组逆转录病毒液，病毒液感染骨骼肌卫星细胞，使用RT－PCR方法检测rhBMP7 mRNA的表达情况。结果：成功地构建了逆转录病毒真核表达载体，逆转录病毒介导rhBM7基因转染的骨骼肌卫星细胞能有效地表达外源性rhBMP7的mRNA。结论：采用逆转录病毒介导的方法可将rhBMP7转染至骨骼肌卫星细胞中，目的基因可在mRNA水平有效表达。     

小鼠GM─CSFcDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因组中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍＲＮＡ表达，用骨髓细胞增殖法和ＣＦＵ－ＧＭ检测也表明转化细胞分泌有较多的ＧＭ－ＣＳＦ，该研究为下一步在动物体内进行ＧＭ－ＣＳＦ基因治疗的研究奠定基础     

携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体的构建

目的构建携带有凋亡素(Apoptin、VP3)、内皮抑素(Endostatin)双基因的重组腺病毒载体,为其在肿瘤治疗的应用研究打下基础。方法将VP3基因和Endostatin基因克隆入腺病毒穿梭质粒pDC316中,将该穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒颗粒Ad-vp3-IRES-sEndo-his。其后挑选病毒空斑获取克隆进行小剂量扩增并提取病毒DNA进行PCR、RT-PCR检查以筛选和鉴定毒种,之后大剂量扩增所选得的病毒克隆并进行纯化、测定病毒的滴度。结果所得腺病毒经PCR、RT-PCR检测表明重组腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-his包装成功。测定病毒50%组织培养感染剂量(TCID50)为5.7×109/ml,病毒颗粒滴度(VP)为1.9×1011/ml。结论成功构建携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体并对其进行了大剂量扩增及提纯,达到了细胞及动物实验使用的标准。     

人LIGHT基因的克隆及其在293T细胞中的表达

目的克隆人LIGHT分子的全长cDNA,构建重组真核表达质粒pCI-neo-LIGHT并在293T细胞上获得稳定表达.方法从人T细胞cDNA文库中用PCR技术克隆人LIGHT全长cDNA,装入T-Easy载体,测序证实后,将LIGHT cDNA装入质粒pCl-neo中构建真核表达载体.用电穿孔法转染293T细胞,经G418筛选后,用流式细胞仪检测LIGHT分子的表达.结果测序证实克隆的LIGHT全长cDNA阅读框正确完整,酶切证实LIGHT-pCI-neo中LIGHT插入方向正确.转染的293T细胞经G418筛选3个月后,流式细胞仪检测有78.69%的细胞表达人LIGHT分子.结论成功克隆LIGHT基因并获得稳定表达膜型LIGHT分子的293T细胞系.