胚肝细胞中树突状细胞的分离,培养和表型鉴定

本实验主要以胚肝细胞作为细胞来源，通过贴壁处理，分离ＤＣＳ的前体细胞，在含细胞因子的培养体系中培养，诱导其分化为树突状细胞，比较不同处理和不同来源细胞所得到的树突状细胞生长状况，细胞表型的异同，细胞功能，以寻找一种体外大量扩从树突状细胞的新方法。     

人外周血树突状细胞的体外分离、培养和表型鉴定

目的：建立从人外周血分离、纯化、培养树突状细胞的方法，研究细胞因子对树突状细胞体外增殖、分化成熟的影响。方法：取正常人外周血，经淋巴细胞分离液梯度分离，取中间白膜层细胞，通过贴壁处理，获得单个核细胞，加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）1μg／ml和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）410ng／ml，体外培养7d后，加入肿瘤坏死因子α（TNF-α）促进其分化成熟。第8天收获悬浮细胞，用相差显微镜和电镜观察其形态，经树突状细胞（DC）单克隆抗体染色后用流式细胞仪进行表型测定。结果：从正常人外周血分离获得的单个核细胞经rhGM-CSF、rhlL-4和TNF-α联合作用1周左右获得大量高纯度树突状细胞，树突状细胞特征：悬浮生长；具有树突状或裙褶状突起；高表达HLA-DR、CD1a、CD80、CD83、CD86和低表达CD14。结论：用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合作用可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞，经形态学观察及表型鉴定得以证实。该培养技术为进一步研究树突状细胞肿瘤疫苗的临床应用奠定了物质基础。     

Wistar大鼠树突状细胞的体外培养、扩增与鉴定

目的：探讨体外分离、培养和扩增大鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的有效方法。方法：采用改良的Chen－WoanDC培养方法，梯度离心提取骨髓单核细胞中的非粘附细胞，加入GM CSF 5?ng/ml、IL 4 5?ng/ml进行诱导扩增，对培养的目的细胞进行形态学、OX62－FITC免疫荧光检查以及功能学鉴定。结果：DC前体细胞培养10?d呈典型树突状结构，表面标志物染色阳性，流式细胞学检查OX62单抗阳性率86％，不同培养时段的DC诱发混合淋巴细胞反应以培养10?d的DC最强，培养10?d的DC诱发混合淋巴细胞反应对同源淋巴细胞有更好的活性。结论：改良的Chen－Woan法为体外诱导扩增大鼠骨髓来源DC的有效方法。     

人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定

目的从健康人外周血中分离单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell,PBMC）,经体外诱导培养获取成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）.方法取健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养.置37℃、5%CO2培养箱内静置培养2 h后除去悬浮细胞.培养液中加入rhGM-CSF和rhIL-4继续培养贴壁细胞5 d,然后加入TNF-α促进其分化成熟.倒置显微镜下观察DC形态,流式细胞仪（flowcytometer,FCM）对其进行表型鉴定.结果显微镜下观察DC细胞形态不规则,表面有大量的毛刺状突起;成熟DC细胞表面CD83、CD80分子表达明显增高.结论用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合培养可以从健康人外周血诱导培养出成熟的树突状细胞.     

分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞

目的：建立稳定的同时分离原代大鼠肝细胞（HC）、肝星状细胞（HSC）和Kupffer细胞（KC）的方法,并初步评估其在体外培养的特征。方法：通过胶原酶原位灌注获得肝脏单细胞悬液,随后行等密度离心结合选择性贴壁纯化肝脏原代细胞,细胞的产量和活力经自动细胞计数仪计算出,纯度经免疫荧光、特殊染色及吞噬等实验进行鉴定。结果：大鼠原代HC产量为（21.0±8.2）×106/g肝组织,活力为92.1%±2.1%,纯度为96.5%±2.2%;原代HSC产量为（2.5±0.8）×106/g肝组织,活力为90.1%±3.8%,纯度为93.1%±1.5%;原代KC产量为（4.1±1.2）×106/g肝组织,活力为96.2%±2.7%,纯度为95.1%±1.4%。分离的HC、HSC和KC适合体外长期培养。HSC在体外培养过程中失去维生素A,逐渐向成纤维细胞表型转变。KC在体外可增殖,至14 d时仍表达CD68,具有较强的吞噬能力。结论：成功建立同时分离和培养大鼠HC、HSC和KC的方法,为进一步研究肝脏病理生理提供细胞基础。     

树突状细胞提取与鉴定方法的研究进展

1973年,Steinman等首次从小鼠脾组织中分离出树突状细胞（dendriticcell,DC）,因其表面有许多伪足样或树状突起而得名。DC被称为机体防御病原微生物侵袭的重要“哨兵”,当机体遭遇病原微生物侵袭或体内有细胞发生恶变时,DC很快即能获知这些信息,将这些信息及时传递给免疫系统,并将病原微生物或恶变细胞从体内清除出去。本文就近年来关于树突状细胞的研究进展进行综述。     

人胚肝细胞分离培养研究

目的　探讨体外优化培养人胚肝细胞的方法。方法　采用胰蛋白酶和聚乙烯吡咯烷酮(pvp) ,胶原酶,胶原酶和pvp消化法分离人胚肝细胞,并比较3种方法对分离人胚肝细胞的效果。结果　运用这三种方法均能成功地培养出原代肝细胞,并能够传代;但胶原酶和pvp消化法分离细胞效果最好,细胞贴壁生长能力强。三种消化方法其细胞存活率从高到低依次为胶原酶和pvp消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和pvp消化法。结论　人胚肝细胞的分离首选胶原酶和pvp消化法,使用该法在体外培养的人胚肝细胞生长良好,可用于肝细胞移植和生物人工肝等方面的研究。     

大鼠树突状细胞的体外扩增与初步鉴定

目的建立体外诱导和扩增大鼠骨髓树突状细胞(DCs)的方法，并进行生物学鉴定。方法大鼠骨髓细胞经贴壁去除悬浮细胞，加入细胞因子(IL-4和GM—CSF)培养2周。经过先镜，透射电镜观察培养DCs的形态学特征；通过同种T细胞混合培养，采用MTT比色分析法测定不同浓度的DCs发同种T细胞增殖的能力。结果培养的DC胞浆突起大而长，呈树突状，具有DCs的典型形态，并且具有强烈的激发同种异体T细胞增殖的能力。结论采用大鼠骨髓细胞经贴壁去除悬浮细胞，加入细胞因子(IL-4和GM—CSF)序贯培养，能获得大量、较高纯度的DCs。     

小鼠骨髓来源树突状细胞的体外分离、扩增方法的建立

目的从小鼠骨髓中体外诱导、扩增树突状细胞(DCs)。方法从小鼠骨髓中分离单个核细胞(MNCs),在rmGM-CSF、IL-4和TNF-α的诱导下培养扩增树突状细胞。光学显微镜观察其体外培养过程中的形态特征,流式细胞仪(FACS)分析其表型特征,混合淋巴细胞反应(MLR)检测其功能。结果MNCs经过rmGM-CSF、IL-4和TNF-α诱导培养12天后,具典型的DCs形态,细胞表型为MHCⅡ类分子(Ia)78.70±11.35%、CD11c81.60±10.02%、CD8065.30±5.73%、CD8679.65±8.66%、和CD1416.42±1.82%,具有极强的激发MLR的能力,显示成熟DCs的特征。结论本方法是一种可靠的诱导、扩增DCs的方法,为DCs的深入研究和临床应用奠定了基础。     

慢性乙肝患者树突状细胞表型和抗原提呈能力的测定

目的：探讨慢性HBV感染者比的表现和功能及其与免疫耐受的关系。方法：选择正常人和慢性HBV感染者，从外周血中分离单个核细胞，用细胞贴壁法富集DC，流式细胞术测定DCHLAⅡ和共刺激分子的表达，同位素掺入法测定DC的抗原提呈能力，ELISA方法测定抗原提呈过程中Th1和Th2类细胞因子的水平。结果：慢性HBV感染者HLAⅡ和共刺激分子表达水平、抗原提至能力和Th1类细胞因子的水平均低予正常(P＜0．05)，而Th2类细胞因子的水平与正常相似(P＞0．05)。结论：慢性HBV感染免疫耐受与DC的缺陷有关。     

从脐血单个核细胞诱导树突状细胞

探讨了从脐血单个核细胞定向诱导 DC的方法以进一步研究树突状细胞的功能与特性。从脐血中获取单个核细胞 ,在培养液中加入 GM- CSF、TNF- α、IL- 3、IL- 4,培养 1 4d后流式细胞仪分析细胞表面标志 CD1 a;培养末期加入 LPS,流式细胞仪分析细胞表面标志 CD83及 HLA- DR。发现用 GM- CSF+TNF-α+IL - 4可获得 ( 3 6 .79± 3 .1 5 ) % CD1 a+ 细胞 ,LPS可使 CD83及 HLA- DR的比例从 ( 0 .5 7± 0 .5 6 ) %及 ( 40 .2 7± 6 .3 3 ) %分别升至 ( 3 2 .79± 1 2 .90 ) %及 ( 95 .5 2± 3 .45 ) %。实验证明脐血单个核细胞作为另一种主要来源 ,经特定细胞因子诱导可生成大量 DC,并能通过 LPS刺激 DC成熟     

共同培养的树突状细胞与CIK细胞对乳腺癌细胞杀伤活性的研究

目的:本研究将树突状细胞(dendritic cells,DCs)和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine - induced killer cells,CIK)共同培养,获得DC- CIK细胞.观察DC - CIK细胞的体外增殖能力、表型变化及其对乳腺癌的细胞毒性作用.方法:从健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中诱导出DCs和CIK细胞,并将其按1∶10的比例共同培养4d获得DC - CIK细胞.检测DC - CIK细胞的增殖活性、表型变化及对乳腺癌细胞株SKBR-3的细胞毒活性.结果:DCs与CIK细胞共同培养后获得的DC-CIK细胞相对于单纯的CIK细胞具有更强增殖活性及成熟度,对乳腺癌细胞具有更强杀伤活性.结论:DCs与CIK细胞共同培养可使CIK细胞获得更高的增殖活性及更强的抑癌作用.     

喉癌患者外周血树突状细胞的体外培养

目的探讨从喉癌患者外周血大量诱导树突状细胞(Dendritic cells,DCs)的有效方法。方法直接从喉癌患者外周血分离DCs;用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)刺激喉癌患者外周血贴壁单核细胞(PBMCs);检测培养前后DCs表面HLA-DR、B7-2表达水平及DCs诱导T细胞增殖能力。结果联合应用GM-CSF及IL-4可以从PBMCs中诱导大量高免疫活性的DCs,并通过增加其表面HLA-DR、B7-2表达而增强DCs免疫功能。结论用GM-CSF及IL-4可以从喉癌患者外周血中诱导出大量高免疫活力DCs。     

大鼠树突状细胞在抗肿瘤中作用的初步研究

本文采用大鼠脾脏细胞分离获得的树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｓＤＣｓ）联合ＩＬ－２诱生的ＬＡＫ细胞进行体内、外抗肿瘤试验，结果发现ＤＣｓ能明显促进ＬＡＫ的抗肿瘤作用     

人脐带/外周血树突状细胞的培养及特性研究

利用人脐带血单个核细胞，联合粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）和肿瘤坏死因子-α（TNF－α），经2周左右可培养出大量树突状细胞（DCs）；来自正常人外周的单个核细胞，经GM－CSF和IL-4作用，8－10天后亦可培养出大量（4－5）×10~6／50ml）DCs。该研究为进一步研究DCs负载肿瘤抗原作为疫苗，为肿瘤免疫中的应用奠定了物质基础。     

人外周血来源树突状细胞诱导培养及鉴定的实验研究

目的探讨树突状细胞(DC)体外培养的方法。方法用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测其表面标志,四氮唑蓝法测定其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。结果体外培养第10天,大量细胞出现典型的树突状形态;流式细胞仪检测高表达CD80、CD86、CD83、CD40、CD1a、人白细胞DR抗原;在体外能强烈刺激同种异体混合淋巴细胞增殖反应。结论该方法可获得较高纯度典型的DC,为DC的临床免疫治疗提供实验依据。     

四种多肽负载的自体树突状细胞治疗恶性黑色素瘤近期疗效观察

目的探讨MAGE-3、Tyrosinase、MART-1、Gp-100等4种多肽负载的自体树突状细胞（DCs）治疗恶性黑素素瘤的安全性和近期疗效。方法分离患者外周血单核细胞,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和白细胞介素-4（rhIL-4）体外诱导DCs,MAGE-3、tyrosinase、MART-1、Gp-100等4种多肽负载自体DCs,对10例HLA-A2阳性的恶性黑色素瘤患者进行4次DCs免疫治疗,观察其安全性、免疫功能和临床疗效。结果治疗中未出现明显不良反应,治疗后血清中IL-2、IL-12和IFN-γ水平呈明显上升趋势（P〈0.05）,6例患者的DTH检测阳性;7例有淋巴结转移的患者中,2例淋巴结转移消失,2例淋巴结肿大减小,3例淋巴结肿大稳定。结论多肽负载的自体DCs治疗恶性黑色素瘤可改善患者的免疫功能,激发特异性免疫反应,缓解病情,且不良反应少,为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供了一条新途径。     

人胎回肠树突状细胞的形态发生分析

目的：探索人胎回肠树突状细胞（dendritic cell,DC）的形态发生规律。方法：应用免疫组织化学术和体视学方法对人胎回肠DC的出现时间、形态参数进行分析。结果：第11w时人胎回肠固有层开始出现阳性DC,其数量随胎龄的增大而逐渐增多;回肠固有层及集合淋巴小结（Peyer’s Patches,PP）阳性DC的数密度均随胎龄的增加而增大,而集合淋巴小结DC的数密度比同期固有层的要高（P〈0．05）;平均表面积随胎龄的增加呈现逐渐减小的趋势,而集合淋巴小结DC的平均表面积比固有层的要小（P〈0．001）;集合淋巴小结DC的表面积体积比比固有层的要小（P〈0．05）。结论：人胎回肠DC的数量随胎龄的增加而增多,固有层DC的形状、大小和数量均与集合淋巴小结DC有差异。     

人外周血树突状细胞的体外培养及其影响因素的研究

目的探讨人外周血树突状细胞(Dendritic cells,DCs)的体外培养方法及其影响因素。方法取健康人外周血贴壁单核细胞,加入不同浓度的粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)和不同种类的血清,培养7天后用CD83M cAb标记DCs,SP法检测纯度,比较各组DCs的数量。此外,MTT法检测DCs激发T细胞增殖。结果贴壁单核细胞在细胞因子诱导七天后,获得高纯度的能强烈激发T细胞的DCs,而且其培养受细胞因子浓度及血清种类的影响。结论用GM-CSF及IL-4可诱导人外周血贴壁单核细胞生成DCs,其培养受细胞因子浓度及血清种类的影响。     

子宫颈癌患者树突状细胞体内外诱导抗肿瘤免疫

目的探讨子宫颈癌患者的树突状细胞(dendritic cells,DCs)在体内外能否诱导出高效而特异的抗肿瘤免疫应答。方法应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)从子宫颈癌患者外周血诱导DCs,Hela子宫颈癌抗原致敏,MTT法检测DCs激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)对肿瘤细胞的细胞毒作用。皮下接种Hela子宫颈癌建立荷瘤鼠,给予抗原致敏的DCs回输;或先给予DCs免疫,后用癌细胞攻击,观察其抑制肿瘤的效果。结果从子宫颈癌患者外周血诱导的DCs高表达CD86、CD12、HLA-DR、CD54和CD83,激活的CTLs在体外特异性杀伤子宫颈癌细胞。DCs回输小鼠具有免疫保护作用,减低成瘤率;又能引起免疫治疗作用,有效抑制肿瘤的生长。结论用GM-CSF及IL-4从子宫颈癌患者诱导的DCs能有效提呈Hela子宫颈癌抗原给T淋巴细胞,并且在体内外诱导出高效而特异的抗肿瘤免疫,有望成为有效的肿瘤特异性免疫治疗新途径。