应用聚合酶链反应技术建立弓形虫表面抗原基因的…

弓形虫主要表面抗原Ｐ３０存在于弓形虫表膜及纳虫泡内的一种蛋白，是刺激机体产生免疫反应的主要抗原。以自行设计合成的一对引物，用聚合酶链反应的方法，从弓形虫基因组ＤＮＡ中将Ｐ３０编码基因调出，经纯化及相应酶切后，插入质粒ｐＢＶ２２０中构成重组质粒ｐＢＶ２２０－Ｐ３０。经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序确证该重组质粒中的插入片段即为Ｐ３０基因。     

含弓形虫P30基因插入昆虫杆状病毒的研究

目的：将弓形虫ＺＳ１株主要表膜抗原（Ｐ３０）基因插入到昆虫杆状病毒基因组中，为在昆虫细胞或昆虫体内表达及生产Ｐ３０作准备。方法：先将Ｐ３０基因亚克隆到转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，然后用此重组载体质粒ＤＮＡ与亲本株病毒ＤＮＡ共转染培养的草地夜蛾细胞，经空斑纯化筛选出重组病毒株。结果：已得到含Ｐ３０基因的重组杆状病毒ＴｎＮＰＶ－Ｐ３０。结论：本文已将弓形虫ＺＳ１株Ｐ３０基因亚克隆到昆虫杆状病毒ＴｎＮＰＶ中。     

弓形虫P30基因原核表达载体的构建

为获取具有生物学活性的弓形虫Ｐ３０蛋白，采用定向克隆的方法，自行设计引物通过ＰＣＲ扩增得到Ｐ３０基因片段，用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切后，连接到同样酸切的原核表达载体（ｐＢＶ２２０和ｐＭＡＬＰ２）上，转化大肠杆菌ＤＨ５α，分别得到含重组闰ｐＢＶ２２０－Ｐ３０和ｐＭＡＬＰ２－Ｐ３０的工程菌，扩菌提取质粒经过酶切分析和ＰＣＲ扩增鉴定后，证实Ｐ３０基因的两个原核表达载体构建成功，为其在原核系统中的表达作     

编码弓形虫ROP1蛋白基因的体外扩增、克隆及在E.coli中的表达

目的构建弓形虫棒状体蛋白（ＲＯＰ１）基因重组质粒并在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达。方法用ＲＨ株接种小鼠,收集腹水,纯化速殖子,抽提基因组ＤＮＡ;据ＲＯＰ１基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从ＲＨ株基因组ＤＮＡ中扩增编码ＲＯＰ１的基因片段,插入ｐＢＶ２２０质粒,转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞,于氨苄阳性ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,酶切鉴定;经温度诱导在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果ＲＯＰ１基因体外扩增产物大小与预期值相符,约７５６ｂｐ;构建成功ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒;ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹显示特异蛋白条带的分子量约４３ｋＤ,表达产量约占菌体蛋白１３．２３％。结论从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取ＲＯＰ１基因,并成功构建ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒,诱导表达ＲＯＰ１非融合蛋白,为进一步分离纯化、用于对弓形虫侵入机制及免疫特性的研究做好准备。     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。     

恶性疟原虫疫苗研究X.MSP1中类表皮生长因子1与PfCMR基因？…

目的 克隆并表达恶性疟原虫重组复合抗原，为疟疾疫苗研究奠定基础。方法 将恶性疟原虫ＭＳＰ１中类表皮生长因子１（ＥＧＦ－１）基因与人工化学合成的抗原复合基因ＰｆＣＭＲ串接，插入高效非融合型蛋白表达载体ｐＢＶ２２０，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，转化菌经４２℃热诱导表达，表达产物用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ分析。结果 构建成功重组质粒ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＥＧＦ－１，经热诱导后表达出含外     

弓形虫P30抗原基因的体外扩增、克隆及原核表达

根据已知弓形虫主要表面抗原Ｐ３０的基因序列，用已合成的一对引物，通过聚合酶链反应，从弓形虫ＲＨ、ＺＳ１和ＺＳ２株中扩增了Ｐ３０的编码基因，经纯化及相应酶切后插入质粒ｐｃＤＮＡ３中并转化大肠杆菌ＴＧ１。经含氨苄青霉素ＬＢ培养基初筛后，挑菌扩增双酶切鉴定，阳性克隆子在ＴＧ１中表达，产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，Ｐ３０基因在大肠杆菌中高效表达。     

引形虫P30抗原基因的体外扩增,克隆及原核表达

根据已知弓形虫主要表面抗原Ｐ３０的基因序列，用已合成的一对引物，通过聚合酶链反应从弓形虫ＲＨ、ＺＳ１和ＺＳ２株中扩增了Ｐ３０的编码基因，经纯化及相应酶切后插入质粒ｐｃＤＮＡ３中并转化大肠杆菌ＴＧ１。经含氨苄青霉素ＬＢ培养在初筛后，挑菌扩增双酶切鉴定，阳性克隆子在ＴＧ１中表达，产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，Ｐ３０基因在大肠杆菌中高效表达。     

弓形虫P30抗原基因的PCR扩增及克隆的初步研究

根据已发表的弓形虫主要表面抗原Ｐ３０基因序列，自行设计合成了一对引物，分别在其正义链和反义链的５‘末端加上了ＢａｍＨ Ｉ和ＥｃｏＲＩ的酶切位点，利用ＰＣＲ技术获取Ｐ３０抗原基因整个开放阅读框架的碱基序列。ＰＣＲ产物经ＢａｍＨ Ｉ和ＥｃｏＲＩ 和ＥｃｏＲ Ｉ双酶切后，与经同样两种内切栈切割的质粒载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ连接构成重组质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ－Ｐ３０，转化大肠杆菌ＤＨ５     

弓形虫P30抗原基因的PCR扩增及克隆的初步研究

根据已发表的弓形虫主要表面抗原Ｐ３０基因序列，自行设计合成了一对引物，分别在其正义链和反义链的５′末端加上了ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ的酶切位点，利用ＰＣＲ技术获取Ｐ３０抗原基因整个开放阅读框架的碱基序列。ＰＣＲ产物经ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切后，与经同样两种内切酶切割的质粒载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ连接构成重组质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ－Ｐ３０，转化大肠杆菌ＤＨ５α。通过遗传标记筛选、ＰＣＲ扩增及酶切分析对重组子进行了鉴定，为进一步选择真核系统或原核系统体外表达该抗原打下了必要的基础。     

模拟抗原表位基因测定及合成多肽的血吸虫病诊断价值的研究

目的测定能用于血吸虫病诊断及疗效考核的噬菌体展示肽基因序列,研究合成多肽抗原的血吸虫病诊断价值.方法扩增目的噬菌体,制备和纯化噬菌体DNA,对目的噬菌体中外源性肽的基因序列进行测定和演绎氨基酸序列分析.根据血清反应强度和演绎氨基酸序列选择2个噬菌体的展示肽段进行人工多肽合成.以合成的多肽为抗原,建立血吸虫病诊断方法,检测急、慢性血吸虫病人血清,观察方法的敏感性及特异性;同时检测治疗前及治愈后的血吸虫病人血清,观察该合成抗原的血吸虫病疗效考核价值.结果测定了14个噬菌体展示外源肽的基因序列,序列分析表明,其中有6个噬茵体的外源肽基因序列完全相同,其余8个噬菌体展示肽的基因序列不相同.分析演绎氨基酸序列,发现1个噬菌体展示肽中的3个连续的氨基酸(GVK)残基与血吸虫23 kDa分子氨基酸残基相同.合成多肽抗原检测急、慢性血吸虫病人血清,敏感性分别为92.3%和91.1%,与华支睾吸虫病人血清的交叉反应率为7.5%,检测健康人血清,特异性为95.5%.检测治愈后0.5年的同一病人血清,阴转率为55.3%,治愈后1年的病人血清中IgG抗体的阴转率为63.2%.结论 9个具有血吸虫病诊断价值的噬菌体展示表位的基因序列被确定,并证明了合成多肽抗原有较好的血吸虫病诊断及疗效考核价值.     

内镜下Oddi括约肌测压的临床意义

为观察胆石症、胆囊切除术后等胆系疾病及功能性消化不良（ＦＤ）、糖尿病胃轻瘫（ＤＧＰ）等非胆系疾病Ｏｄｄｉ括约肌（ＳＯ）功能变化，通过内镜采用灌注式高分辨多道胃肠功能测定仪，对１５例胆系疾病患者、１３例非胆系疾病患者进行Ｏｄｄｉ括约肌测压。结果显示，胆系疾病组的胆总管压力、ＳＯ基础压及蠕动波振幅明显高于非胆系疾病组（６．８６±０．６３ｋＰａ与１．２７±０．１０ｋＰａ，Ｐ＜０．０１；７．３１±０．９５ｋＰａ与１．８７±０．１６ｋＰａ，Ｐ＜０．０１；３２．００±１．２ｋＰａ与２４．１４±１．５ｋＰａ，Ｐ＜０．０５）；同时，非胆系疾病组的十二指肠压、ＳＯ蠕动频率及间期较胆系疾病组明显降低、减慢及延长（１．４２±０．２６ｋＰａ与０．３０±０．１０ｋＰａ，Ｐ＜０．０１；３．６±１．２次／分与２．２±０．４次／分，Ｐ＜０．０５；７．４±１．２秒与１１．０±１．８秒，Ｐ＜０．０５）。结果显示，无论是胆系疾病还是ＦＤ及ＤＧＰ等非胆系疾病均有ＳＯ功能紊乱，但表现形式相反，对指导临床诊断与治疗有一定价值。     

钉螺3种酶的酶谱分析

本研究用淀粉凝胶同工酶电泳法比较了安徽及云南两省的钉螺的酸性磷酸酶（ＡｃＰ，ＥＣ３．１．３．２）、过氧化物酶（Ｐｏ，ＥＣ１．１１．１．７）及酯酶（Ｅｓｔ，ＥＣ３．１．１．１）的电泳带型。ＡｃＰ及Ｐｏ的同工酶中ＡｃＰ１、ＡｃＰ２及Ｐｏ１、Ｐｏ２由单态位点编码。Ｅｓｔ的同工酶由４个位点编码，其中Ｅｓｔ３在安徽的钉螺中为１条电泳快带，相对迁移率（Ｒｆ）为０．３６２±０．０２７；在云南的钉螺中为１条电泳慢带，Ｒｆ为０．３４０±０．０３６。     

骨代谢指标测定在骨质疏松诊治中的应用价值

目的 比较妇女绝经前后骨代谢指标的变化，研究各指标在骨质疏松症治疗后的变化率，对各指标在骨质疏松症诊治中的应用作出初步评价。方法 48例绝经前妇女、48例绝经后妇女测定10项骨代谢指标．45例绝经后骨质疏松症患者．治疗前、治疗6个月后分别测定10项骨代谢指标，观察其变化率。12名绝经后妇女，每两个月测定10项骨代谢指标。共观察一年。结果 绝经后妇女骨代谢指标明显升高，绝经后骨质疏松症患者经抗吸收治疗后．大部分骨代谢指标明显降低，血清骨形成指标比尿骨吸收指标长期个体内的变异要小。结论 绝经后骨质疏松症患者骨转换加快，部分血清骨代谢指标优于尿骨代谢指标，尤以血清骨形成指标N—mid骨钙素和血清骨吸收指标CTX为优。     

EVOLUTION OF FITNESS, V. RATE OF EVOLUTION OF IRRADIATED POPULATIONS OF Drosophila

Measurable evolution occurs in laboratory populations of Drosophila under strong natural selection. The rate of adaptation to the experimental environment is significantly greater in populations with genetic variability increased by radiation than in the control, nonirradiated populations.