日本血吸虫22.6kDa抗原T细胞表位的重组、表达及初步鉴定

目的　鉴定日本血吸虫中国大陆株22.6kDa抗原(Sj22.6)的T细胞表位。　方法　用计算机软件预测Sj22.6分子的T细胞表位,设计并合成其编码核苷酸,定向克隆入融合表达载体pET32c(+),转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经酶切及测序鉴定出重组克隆。阳性克隆经IPTG诱导表达,表达产物用NTA柱纯化。用纯化后的表位肽融合蛋白体外刺激C3H小鼠脾单个核细胞,3HTdR掺入法检测其增殖。　结果　用计算机软件预测获得Sj22.6抗原的4个候选表位肽,并成功克隆入pET32c(+)。其重组体均可表达分子量约20kDa的融合蛋白,用NTA柱纯化后经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)显示单一条带。其中P4、P5、P6融合蛋白能有效刺激小鼠脾单个核细胞增殖。　结论　从Sj22.6抗原中初步鉴定出P4、P5、P63个T细胞表位     

日本血吸虫重组抗原的免疫原性鉴定

为发展新的日本血吸虫病疫苗候选抗原分子，对已构建的阳性表达克隆PGsj24进行大量诱导表达，制备为20kD的重组抗原。以之免疫家兔，产生了较强的抗体反应。该单特导抗血清可识别成上天然蛋白中与重组蛋白相对应的抗原成分。两者分子量及Westernblot识别反应带型均基本一致，说明约20kD重组蛋白确为日本血吸虫基因编码产物，具有较强的免疫原性，可刺激机体产生较强的免疫应答。     

日本血吸虫抗原表位编码基因重组质粒的高效构建与鉴定

目的探索用一种新方法—胶内连接法,快速构建日本血吸虫抗原表位编码基因重组表达载体,高效克隆及表达日本血吸虫抗原表位,用于疫苗候选分子的筛选。方法将pUMCV质粒载体用SalI和EcoRI双酶切,酶切产物于低熔点胶中电泳,紫外灯下割取含酶切载体的条带。取一定量割取的低熔点胶,直接将其与合成的单个抗原表位编码基因或者是两个不同抗原表位编码基因进行连接。连接产物转化感受态菌DH5α。挑选阳性克隆进行双酶切、电泳及测序鉴定。结果单个抗原表位或两个不同的表位编码基因被成功地插入真核表达载体。结论采用胶内连接法直接在低熔点胶存在的条件下进行插入基因片段与质粒载体的连接,快速高效地获得了多个单一或组合抗原表位编码基因重组质粒,为进一步筛选日本血吸虫疫苗分子奠定了基础。     

日本血吸虫22.6 kDa重组抗原的高效融合表达及特性鉴定

目的： 大量获得纯化的日本血吸虫２２６ ｋ Ｄａ 重组抗原。方法： 用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法将其编码基因序列经改造后亚克隆入载体质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｘ １λ Ｔ 进行表达。结果： 得到了融合表达的蛋白抗原。此融合蛋白表达量大, 用凝血酶酶切后易大量制备纯化的重组２２６ ｋ Ｄａ 抗原。结论： 以此融合蛋白免疫的小鼠抗血清进行免疫印迹试验, 表明 Ｓｊ２２６／ Ｓｊ２６ Ｇ Ｓ Ｔ 融合重组蛋白具有与 Ｓｊ２２６ 蛋白一样的免疫学活性。     

日本血吸虫重组抗原保护性免疫力的诱导

采用日本血吸虫重组抗原加福氏佐剂免疫小鼠,攻击感染后,不仅可减少虫负荷(减虫率为29.2％—51.0％),还可降低血吸虫雌虫的产卵量(减卵率为52.1％—74.3％),抗体滴度在初次免疫后3wk即显著升高,并持续维持较高水平。结果表明,经大肠杆菌表达的日本血吸虫重组抗原能够诱导抗攻击感染的保护性免疫力,可望作为混合多价疫苗的候选组分。     

日本血吸虫复合B细胞表位抗原的制备和鉴定

目的 制备日本血吸虫复合B细胞表位抗原，并对其抗原性进行鉴定。 方法 用生物信息学软件（BioSun）预测已报告的日本血吸虫Sj22.6、Sj14?鄄3?鄄3、Sj26等3个B细胞表位片段的基因序列（P2、P6、P7），用随机顺序法连接3个片段，克隆入高效融合表达载体pET-32c（+）中，转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，经酶切及基因测序鉴定重组子。阳性克隆经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，表达产物用Ni^2＋螯合柱纯化，用蛋白质印迹（Western blotting）分析该表达产物的抗原性。 结果 3个目的表位基因片段按P2-P6-P7和P6-P2-P7的顺序连接为2条复合表位片段（表位间由6个氨基酸组成的柔性接头连接），成功克隆入pET-32c（+）。其重组子均可表达相对分子质量（Mr）约20 400的融合蛋白。亲和层析纯化的融合蛋白经十二烷基磺酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示为单一条带（Mr 20 400），Western blotting分析显示，这2条重组复合表位蛋白均可被日本血吸虫病患者血清识别，而不与健康者血清反应。 结论 获得2个具有日本血吸虫病诊断潜在价值的复合B细胞表位抗原。     

组合单克隆抗体多表位检测日本血吸虫循环抗原的研究

目的探讨抗肠相关抗原单克隆抗体（单抗）JPG5和抗虫卵可溶性抗原单抗JPS6、JPG5＋JPG1组合和JPS6＋JPG1组合对血吸虫循环抗原（CAg）的诊断效能。方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）对慢性血吸虫病、急性血吸虫病、晚期血吸虫病、卫氏并殖吸虫病、华支睾吸虫病、乙型肝炎患者血清,以及治疗前、治疗后半年、治疗后1年的慢性血吸虫病疗效考核血清进行CAg单位点和多位点检测。结果JPG5检测慢性血吸虫病患者的敏感性和特异性分别为74.3%和96.8%,JPS6分别为78.7%和95.3%;两株单抗与卫氏并殖吸虫病、华支睾吸虫病及乙型肝炎患者血清的交叉反应率分别为15.2%、15.6%、3.2%和21.5%、15.6%、16.0%。JPG5检测治疗后1年的慢性血吸虫病患者血清CAg阴转率高于JPS6。JPG5＋JPG1组合检测慢性血吸虫病患者的敏感性和特异性分别为80.1%和93.7%,JPS6＋JPG1组合分别为73.5%和96.1%;两种组合与卫氏并殖吸虫病、华支睾吸虫病及乙型肝炎患者血清交叉反应率分别为21.5%、15.6%、18.0%和22.8%、15.6%、16.0%。两种组合多位点检测治疗后1年的慢性血吸虫病患者血清CAg阴转率分别为66．7％和45．5％。结论JPG5、JPS6可用作CAg检测的备选探针。JPG5＋JPG1组合与JPS6＋JPG1组合对CAg的诊断效能相近;较之单位点检测,多位点检测敏感性无明显提高。     

日本血吸虫23kD抗原表位及多价疫苗的初步研究

目的　研究日本血吸虫 2 3kD抗原表位及日本血吸虫 2 3kD抗原大亲水区多肽 (LHD -Sj2 3)与脂肪酸结合蛋白(SjFABP)两个基因重组抗原联合免疫小鼠的保护效果。 方法　人工合成血吸虫 2 3kD抗原中一段可诱导T细胞和B细胞免疫应答的抗原表位多肽p14 ,与鸡白蛋白偶联后免疫小鼠。用LHD -Sj2 3和SjFABP两个基因重组抗原联合免疫大鼠 ,观察诱导的免疫保护效果。结果与结论　人工合成肽 p14诱导了 2 2 2 2 %～ 30 18% (P <0 0 5～ 0 0 0 1)的减虫率。用LHD -Sj2 3和SjFABP两个基因重组抗原免疫大鼠时 ,分别获得 32 14 %和 31 85 %的减虫率 (P >0 0 5 ) ,当用这两种基因重组抗原联合免疫大鼠时 ,获得了 4 7 2 8%的减虫率。加强抗原表位及“鸡尾酒”疫苗研究 ,可为寻找更高保护作用的抗血吸虫病疫苗提供基础。     

利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位

目的　从噬菌体肽库筛选日本血吸虫抗原模拟抗原表位。方法　制备亲和纯化的日本血吸虫病人血清抗体 Ig G,用此 Ig G包被酶标板对 12肽库进行反复淘选 ,对获得的目的噬菌体进行鉴定及免疫原性分析。结果　获得一批阳性噬菌体克隆 ,其中一部分与血吸虫病人血清反应产生较高的吸光值 ,Western blotting分析表明这些噬菌体能被血吸虫病人血清所识别 ,具有类似于血吸虫抗原的免疫原性。结论　获得一批具有模拟日本血吸虫抗原表位的噬菌体克隆 ,为今后进一步研究它们在血吸虫病诊断及疫苗研究中的作用奠定了基础。     

日本血吸虫保护性抗原模拟表位的筛选及其免疫保护作用的研究

目的在前期已建立日本血吸虫感染兔新模型的基础上,用该血清从噬菌体随机12肽库中筛选阳性单克隆噬菌体,并鉴定其诱导小鼠的免疫保护效果。方法通过给感染日本血吸虫家兔注射酚氧化酶抑制剂,抑制其体内日本血吸虫雌虫产卵,建立无虫卵肉芽肿的日本血吸虫感染动物新模型,用其血清筛选出阳性多克隆噬菌体,经与可溶性虫卵抗原(SEA)免疫兔血清充分吸附后,从中随机挑取14个单克隆分别纯化、扩增,用常规ELISA法检测阳性单克隆噬菌体的抗原性;挑选出与新模型兔血清呈强阳性反应,但与SEA免疫兔血清呈阴性或弱阳性反应的单克隆噬菌体,按1×1015pfu/次剂量,0-2-4周方案,皮下多点注射免疫小鼠。末次免疫4周后,每鼠经腹部皮肤攻击感染(40±1)条日本血吸虫尾蚴,感染42d后观察减虫率及减卵率。结果所选14个单克隆噬菌体均能与新模型兔血清和常规感染模型兔血清反应,尤其是第8号和第13号2个克隆与新模型兔血清呈强阳性反应,但与SEA免疫兔血清呈阴性反应;8号、13号单克隆噬菌体及原始噬菌体肽库免疫小鼠后诱导抗攻击感染的减虫率及每克肝脏减卵率分别为35.81%和63.32%、32.09%和52.02%、14.90%和30.64%。结论阳性多克隆噬菌体与SEA免疫兔血清免疫吸附后能去除大部分表达SEA抗原模拟表位的克隆,所选14个单克隆噬菌体均表达     

日本血吸虫溶血磷脂酶编码基因真核表达载体的构建和表达及鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出溶血磷脂酶编码基因(Si1539),并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),旨在提取重组抗原进行免疫原性分析,并用于免疫学诊断.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,反转录生成cDNA,PCR法扩增出Sj1539基因,通过克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),然后转染至人宫颈癌细胞株(HeLa细胞)中表达,表达产物用Western印迹法进行鉴定.结果 Sj1539基因PCR扩增产物片段长度为684 bp.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539经BamH I、Xho I双酶切和PCR扩增鉴定,证实Sj1539基因已成功插入.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539在HeLa细胞中的表达产物经Western印迹法鉴定能够与日本血吸虫感染的兔血清反应,其相对分子质量(Mr)约为25×103.结论 成功构建了日本血吸虫Si1539基因真核表达载体,并获得了表达产物.

Abstract：

Objective Schistasoma japonicum(S.japonicum)lysophospholipase gene(Sjl539)from cDNA of S japonicum adult worms was amplified and subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)for expression of recombinant antigen and immunogenicity analysis.Methods Total RNA of S.japonicum was extracted to generato cDNA by RT-PCR.The Sj1539 gent was amplified.The DNA fragment was subcloned into eukaryofic expression vector pcDNA3.1(+)following insertion and amplification in pGEM-T.The recombinant plasmid was transfected into human cervical carcinoma cell strain(Hela cells)and expression products were identified by Western blotting.Results The size of PCR product was approximately 684 bp.It was confirmed that Sj1539 gene had been inserted successfully by the recombinant plasmid digested with two enzymes and PCR.It was verified that the expression product could react with S.japonicum-infected rabbit serum by Western blotting and the molecular weight was approximately 25×103.Conclusions The eukaryotie expression vector carrying Sj1539 gene has been established and the expression product has been obtained.     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

重组日本血吸虫铁蛋白的表达纯化及诱导小鼠保护性免疫研究

目的　表达、纯化重组日本血吸虫铁蛋白 ,观察其免疫小鼠后抗日本血吸虫的免疫保护作用。方法　用基因重组技术 ,将日本血吸虫铁蛋白基因亚克隆至表达载体 pGMC上 ;在IPTG诱导下 ,重组日本血吸虫铁蛋白得到高效表达 ;用电泳层析法分离纯化日本血吸虫铁蛋白 ;用SDS -PAGE和Western -blot鉴定表达纯化产物 ;用纯化的重组铁蛋白免疫小鼠三次 ,分别在 0、2、4周进行。第 6周每鼠经腹部感染 4 0± 1条日本血吸虫尾蚴。 4 2天后剖杀冲虫 ,计数虫数及肝卵数。结果　纯化的重组铁蛋白分子量为 4 0kD ,具有较好的免疫原性 ,能被日本血吸虫感染兔血清识别。与对照组相比 ,纯化重组铁蛋白免疫小鼠组的减虫率为 2 4 5 % ,减卵率为 4 5 8%。结论　重组日本血吸虫铁蛋白不仅在大肠杆菌中得到高效表达 ,而且纯化的铁蛋白分子能诱导抗日本血吸虫病的保护性免疫。     

抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素的构建 表达及生物学活性鉴定

目的构建抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4单链抗体和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核融合表达载体,并对其表达产物进行生物学活性鉴定。方法应用PCR方法体外扩增NP11-4VH、VL、scFv和PE38KDEL基因,经测序后将scFv及PE38KDEL基因通过限制性内切酶双酶切及连接反应,构建原核表达载体pBAD/gIIIA-scFv-PE38KDEL,转化E.coliTop10F′,L-阿拉伯糖诱导表达,表达产物经Western blot及ELISA鉴定其活性。结果构建了重组免疫毒素表达载体pBAD/gIIIA-scFv-PE38KDEL,诱导表达产物主要以包涵体形式存在,分子量约为70kD;经变性、复性后的重组免疫毒素与血吸虫可溶性虫卵抗原有较好的结合活性。结论构建及表达了抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素,为血吸虫病治疗提供了一条新思路。     

日本血吸虫重组线粒体相关蛋白免疫学活性鉴定

分子筛进一步纯化并复性的融合蛋白均能刺激家兔产生特异性抗体 ,粗提包涵体蛋白免疫家兔 ,血清抗体滴度为 1∶2 5 6 0 0 ,复性蛋白及经分子筛纯化的蛋白免疫的家兔血清抗体滴度均为 1∶5 12 0 0 ,Westernblot结果显示 ,粗提包涵体蛋白、复性蛋白及经过分子筛进一步纯化并复性的蛋白均能被重感染兔血清和rSj338/2 6GST特异性免疫兔血清所识别。攻击实验中 ,粗提包涵体蛋白和经分子筛纯化的蛋白分别可诱导小鼠产生 2 7.8% (P <0 .0 1)和 30 .4 % (P <0 .0 1)的减虫率 ,4 0 .4 % (P <0 .0 1)和 4 3.5 % (P <0 .0 1)肝总减卵率。粗提包涵体蛋白中rSj338和经分子筛纯化的蛋白中rSj338分别可诱导小鼠产生 13.9% (P <0 .0 5 )和 2 0 .0 % (P <0 .0 5 )的减虫率 ,30 .0 % (P <0 .0 1)和 4 1.7% (P <0 .0 1)肝总减卵率。结论　获得的日本血吸虫线粒体相关的重组融合蛋白(rSj338/2 6GST)具有良好的免疫学活性 ,重组融合蛋白 (rSj338/2 6GST)及rSj338均可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力。     

日本血吸虫22.6kDa膜相关蛋白Th1型表位的免疫学鉴定

目的鉴定日本血吸虫22.6 kDa膜蛋白（Sj22.6）的Th1型表位,为构建短肽疫苗奠定基础。方法采用合成肽Sj22.6-P4、无关肽（对照）及PBS免疫C57BL/6小鼠2次（间隔7 d）,末次免疫后7～10 d取脾分离单个核细胞,用合成肽Sj22.6-P4、无关肽及PBS刺激培养,3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖效果,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其细胞培养上清中IFNγ-、IL-4及IL-2水平。运用流式细胞技术三色标记法检测经合成肽Sj22.6-P4、无关肽及PBS免疫2次的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞内的Th1、Th2细胞因子。结果合成肽Sj22.6-P4可刺激经该抗原肽免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞增殖,与PBS组相比,增殖指数（SI）均〉2。与无关肽对照组相比,细胞培养上清中IL-2、IFN-γ分泌水平增高,其中IL-2分泌水平差异有统计学意义（P〈0.05）,IFN-γ差异无统计学意义（P〉0.05）,而IL-4分泌水平明显降低（P〈0.05）。合成肽Sj22.6-P4免疫组小鼠脾脏CD4＋T细胞中分泌IFN-γ细胞的百分比显著增高,分泌IL-4细胞的百分比显著降低（P均〈0.05）。结论合成肽Sj22.6-P4是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。     

血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究Ⅰ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白(Trx)DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx),并进行分子生物学鉴定。方法根据日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株Trx(SjcTrx)编码基因。经双酶切并纯化的PCR产物与经双酶切纯化的pcDNA3质粒DNA片段用T4DNA连接酶连接,克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-SjcTrx,并经限制性内切酶双酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR检测和核苷酸序列测定进行鉴定。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334bp,构建的pcDNA3-SjcTrx重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段,根据核苷酸序列测定结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗构建成功,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆表达及其免疫原性研究

尽管近50年来我国在血吸虫病防治取得了令人瞩目的成就,日本血吸虫病仍然是我国一个重要的公共卫生问题。目前控制血吸虫病的措施仍以灭螺和吡喹酮化疗为主。治愈病人的再感染情况严重、血吸虫抗药虫株的出现及家畜和野生哺乳动物作为重要传染源是我国血吸虫病防治工作当前面临     

噬菌体表达的短肽模拟蚯蚓与日本血吸虫共同表位研究

目的采用噬菌体呈现技术,获得蚯蚓与血吸虫的共同表位。方法依次以日本血吸虫病患者血清(SjIg)、蚯蚓免疫兔血清(LtIg)和LtIg、SjIg作为靶分子,以噬菌体12肽库的第三轮扩增肽库为源肽库,进行2轮吸附-洗脱-扩增免疫筛选。每轮随机挑取蓝色噬菌斑各21个,用ELISA方法检测其抗原性,并对其反应性较好的阳性克隆进行测序。结果获得4个阳性克隆可与SjIg、LtIg较好的结合。得到3个阳性克隆的氨基酸序列,它们有蚯蚓与血吸虫共同的线性表位。结论结果说明,从12肽库筛选蚯蚓与寄生蠕虫抗原共同表位是可行的,同时也为获得寄生蠕虫共同抗原提供了一条新的途径。