人可溶性补体受体1型双抗体夹心ELISA法的建立及初步应用

摘要：目的：建立定量检测人血清可溶性补体受体1型（sCR1）双抗体ELISA夹心法。 方法：用鼠抗人CD35单克隆抗体(mAb)包被反应板,以兔抗人sCR1抗体（PcAb）为夹心抗体,辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG为检测抗体,纯化后的人sCR1蛋白为标准品,建立定量检测人血清sCR1双抗体夹心ELISA法,并检测50例体检健康者和32例肝硬化患者血清样本中sCR1水平。 结果：建立的双抗体夹心ELISA法检测人血清sCR1的线性范围为15.6～250 ng/mL。低、高浓度批内变异系数（CV）分别为9.3％、7.1％;批间CV分别为11.2％和9.82％;回收率分别为89.5％和92.5％。50例健康人和32例肝硬化患者血清sCR1水平分别为（33.82±5.88） ng/mL和（152.99±9.51） ng/mL,两者比较有统计学差异（t=70.18, P＜0.001）。 结论：成功建立了检测人血清sCR1的双抗体夹心ELISA法,重复性和准确性较好。初步发现肝硬化患者血清sCR1水平显著升高。     

定量测定硫酸软骨素的双抗体夹心ELISA的建立

目的建立定量测定硫酸软骨素（CS）的双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）,并对其应用价值进行初步评价。方法以CS为抗原分别免疫Balb/c小鼠和日本大耳白兔,制备2种动物的多克隆抗体。用鼠抗体包被微孔板,兔抗体为第2抗体,辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔抗体为标记抗体,建立双抗体夹心ELISA,并对线性范围、精密度、回收率和方法学比较进行了评价。结果本研究建立的ELISA线性范围为2～500 mg/L,批内和批间精密度分别为4.48%和5.97%,回收率在99.52%～101.77%之间,与间苯三酚分光光度法测定结果具有良好的相关性（r=0.999 0,P〈0.05）。结论建立的定量测定CS的双抗体夹心ELISA具有敏感性高、重现性好等优点,适合检测应用。     

双抗体夹心ELISA检测血小板相关抗体的临床应用

用双抗体夹心酶免疫法对４０例原发性血小板减少性紫癜（ＩＴＰ）患者治疗前联合测定了ＰＡＩｇＧ、ＰＡＩｇＭ、ＰＡＩｇＡ，并与正常组（３０例）测定值比较，结果表明：三次免疫指标均高于正常测定值，其敏感性达９３％，联合检测可提高ＩＴＰ的阳性率至８９％～１００％，该法特异性强，阳性检出率高，重复性好，快速简便，不需要特殊仪器设备，适于基层单位推广应用。     

定量测定硫酸软骨素的双抗体夹心ELISA的建立

目的建立定量测定硫酸软骨素(CS)的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),并对其应用价值进行初步评价。方法以CS为抗原分别免疫Balb/c小鼠和日本大耳白兔,制备2种动物的多克隆抗体。用鼠抗体包被微孔板,兔抗体为第2抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体为标记抗体,建立双抗体夹心ELISA,并对线性范围、精密度、回收率和方法学比较进行了评价。结果本研究建立的ELISA线性范围为2～500 mg/L,批内和批间精密度分别为4.48%和5.97%,回收率在99.52%～101.77%之间,与间苯三酚分光光度法测定结果具有良好的相关性(r=0.999 0,P<0.05)。结论建立的定量测定CS的双抗体夹心ELISA具有敏感性高、重现性好等优点,适合检测应用。     

双抗体夹心ELISA检测肺炎支原体抗原方法的建立

目的建立检测肺炎支原体(MP)抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),并探讨其临床应用的可行性。方法采用不同株MP单抗,用双抗体夹心ELISA检测MP抗原,优化该方法检测MP抗原的最佳实验条件。对MP标准株及147份临床标本进行测定,观察双抗体夹心ELISA的敏感性和特异性及该方法与聚合酶链反应(PCR)检测的符合率。结果包被单抗量为20μg／ml,酶标记单抗1：200稀释时,阳性对照与阴性对照吸光度之比(P／N值)最大,检测MP抗原敏感度达2μg／ml,和其他支原体没有交叉反应;147份临床标本PCR检测阳性率13．6％(20／147),双抗体夹心ELISA检测阳性率12．2％(18／147),两者符合率达95．9％。结论建立的双抗体夹心ELISA检测MP抗原具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点。     

双抗体夹心ELISA检测肺炎支原体抗原方法的建立

目的　建立检测肺炎支原体(MP)抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),并探讨其临床应用的可行性。方法　采用不同株MP单抗,用双抗体夹心ELISA检测MP抗原,优化该方法检测MP抗原的最佳实验条件。对MP标准株及147份临床标本进行测定,观察双抗体夹心ELISA的敏感性和特异性及该方法与聚合酶链反应(PCR)检测的符合率。结果　包被单抗量为20μg/ml,酶标记单抗1∶200稀释时,阳性对照与阴性对照吸光度之比(P/N值)最大,检测MP抗原敏感度达2μg/ml,和其他支原体没有交叉反应; 147份临床标本PCR检测阳性率13. 6% (20 /147),双抗体夹心ELISA检测阳性率12. 2% ( 18 /147 ),两者符合率达95. 9%。结论　建立的双抗体夹心ELISA检测MP抗原具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点。     

双抗体夹心酶联免疫吸附法检测IgG0的研究及应用

类风湿关节炎(RA)患者IgG分子糖链末端2个半乳糖缺失(称为IgG0 ) [1] ,缺失后,N 乙酰葡萄糖(GlcNAc)暴露。本研究用特异性识别GlcNAc的蘑菇凝集素(PVL) ,建立一种检测IgG0 的双抗体夹心酶联免疫吸附试剂(ELISA)检测法,并对正常人和RA患者进行检测。一、材料和方法1 标本来源:4 2份RA活动期患者血清采自1999年8月～2 0 0 1年12月本院就诊患者,(女33例,男9例,均符合1987年美国RA诊断标准)。对照组为12 6份志愿者血清,(女95名,男31名)。血清库( pool) :参照Tsuchiya法[2 ] 取4份活动期RA患者血清各2ml,混合成pool,用作参考血清,代…     

白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

摘要：目的：建立检测白念珠菌烯醇化酶（enolase, Eno）的双抗体夹心ELISA法,并试用于几种真菌培养上清液的检测。 方法：将抗白念珠菌Eno单抗作为包被抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗Eno抗体作为检测抗体,用方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体浓度,建立检测Eno的ELISA法,对方法的精密度、特异性、最低检测限等指标进行评价。用该法检测白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母等不同真菌培养上清中Eno水平。 结果：Eno浓度为20 ng/mL和5 ng/mL时,批内和批间变异系数(CV)分别为6.61%、9.19%和6.98%、13.81%;最低检测限为1.25 ng/mL。本法可从白念珠菌37 ℃培养24 h后的上清中检出Eno,Eno含量与白念珠菌菌丝含量呈正相关。本法对近平滑念珠菌有微弱交叉反应,与热带念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母均无交叉反应。 结论：建立的检测白念珠菌Eno的双抗体夹心ELISA方法有较好的特异性,可用于评价Eno检测在侵袭性白念珠菌感染中的诊断价值。     

双抗体夹心ELISA测定血清促红细胞生成素

建立了一种灵敏的测定血清促红细胞生成素（ＥＰＯ）的ＥＬＩＳＡ夹心法。该法应用于人重组促红细胞生成素免疫家兔获得的，并经亲和层析纯化的多克隆抗ＥＰＯ，与各种血液组份和细胞因子无交叉反应性。     

EDTA-K2对双抗原夹心ELISA检测HIV抗体的影响

目的探讨乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)对双抗原夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体的影响。方法用HIV抗体阴性和阳性静脉血分别制备EDTA-K2浓度为1.5、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40 mg/mL的抗凝血并留取无抗凝剂血,分别分离血浆和血清,测定各样本HIV抗体,读取吸光度(A)值,对A值与EDTA-K2浓度进行相关性分析;制备EDTA-K2最终浓度分别为1.5、2.5、5、10 mg/mL的HIV抗体阳性和阴性抗凝血各20份并留取无抗凝剂血,分别分离血浆和血清,平行测定各样本HIV抗体,血浆与血清样本进行配对t检验。结果 EDTA-K2浓度与HIV抗体阴性样本A值无相关关系(P=0.933),与HIV抗体阳性样本A值呈明显负相关(P<0.01);当EDTA-K2≥5 mg/mL时,HIV抗体阳性血浆样本A值明显低于血清样本(P<0.01),当EDTA-K2≤2.5 mg/mL时,血浆与血清样本A值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论EDTA-K2对HIV抗体阴性样本测定无干扰;血浆EDTA-K2≤2.5 mg/mL时,对HIV抗体阳性样本测定无干扰,EDTA-K2≥5 mg/mL时,对HIV抗体阳性样本测定呈明显负干扰。     

双抗夹心法酶联免疫吸附试验影响因素探析

目的探析双抗夹心法酶联免疫吸附试验中牛血清清蛋白封闭,吐温20及浓度,样品与检测抗体的加样方式及孵育温度对酶联免疫吸附试验检测结果的影响。方法双抗夹心法酶联免疫吸附试验检测人白细胞介素(IL)-1Ra细胞因子作为模型,检测封闭条件,吐温20及其不同浓度,样品与检测抗体分开孵育及共同孵育,酶联孵育温度对标准品浓度与OD值关系的影响。结果酶联免疫吸附试验不封闭、洗液吐温浓度为0.05%且孵育温度为37℃的R~2=0.995 7;BSA封闭的R~2=0.981 1;洗液中吐温浓度0.005%时R~2=0.991 5,0.5%时R~2=0.9868;样品和检测抗体一同孵育1h或2h的R~2分别为0.964 5和0.874 2;孵育温度为25℃的R~2=0.996 1。结论BSA封闭步骤对低浓度的样品检测灵敏度不强;样品和检测抗体及酶稀释液中必须含有吐温20且浓度在0.05%条件下最合适;样品和检测抗体共同孵育会影响对高浓度样品的检测;37℃和25℃的孵育温度条件下的酶联免疫吸附试验检测灵敏度没有差异,但25℃孵育可以降低OD值背景。     

The use of TP10, soluble complement receptor 1, in cardiopulmonary bypass

Cardiopulmonary bypass (CPB) for cardiac surgery or lung transplantation initiates a systemic inflammatory response characterized by increased vascular permeability, generalized edema, abnormal lung function and oxygenation and impaired ventricular function. This post-CPB syndrome significantly contributes to postoperative morbidity and mortality. Activation of complement during CPB is a key component that initiates and augments this process. TP10, soluble complement receptor 1, is a novel complement inhibitor that is a potent inhibitor of C3 and C5 convertases, blocking activation of the complement cascade at the nexus of all three complement pathways. Recent controlled trials in humans have demonstrated that TP10 effectively inhibits complement activation during CPB. In high-risk adult patients, TP10 decreases the incidence of mortality and myocardial infarction in males but not in females following cardiac surgery. TP10 is also well tolerated and protects vascular function in infants undergoing CPB. In addition, TP10 leads to early extubation in adult lung transplant recipients. TP10 is currently positioned for clinical development in a male-only indication of cardiac surgery on CPB.     

慢性乙型肝炎患者红细胞天然免疫黏附功能与血清sCR1变化的相关性研究

目的研究乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性慢性乙型肝炎患者红细胞天然免疫黏附功能(RNIAF)与血清可溶性Ⅰ型补体受体(sCR1)的浓度变化,分析二者的相关性,并探讨其临床意义。方法选择48例肝功能正常、血清HBV DNA大于106 U/mL的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者作为肝功能正常组,48例转氨酶高于正常值2倍以上的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者作为肝功能异常组。检测RNIAF,同时采用酶联免疫定量检测试剂盒测定血清sCR1含量。结果肝功能异常组的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者RNIAF较肝功能正常组及健康对照组显著下降,而sCR1含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。动态观察持续肝功能异常的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者RNIAF与血清sCR1含量变化,显示二者呈明显负相关(r=-0.91)。HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清sCR1含量与凝血酶原活动度也呈明显负相关(r=-0.87)。结论 HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者RNIAF与血清sCR1的含量变化与肝脏功能损伤严重程度密切相关,可作为临床判断肝病患者病情严重程度及预后的参考指标。     

Age‐dependent decreases in serum soluble interleukin‐1 receptor type I (sIL‐1RI) in healthy individuals: a population study of serum sIL‐1RI levels in Japanese subjects

The levels of several soluble cytokine receptors in body fluids of healthy individuals change with age. Clinical application of the measurement of the serum soluble interleukin‐1 receptor type I (sIL‐1RI) level depends critically on the samples used as the controls. At present, there is no information regarding the levels of serum sIL‐1RI in healthy subjects. The purpose of this study is to reveal the age‐related changes that occur in the serum sIL‐1RIlevels of healthy individuals. We determined the serum sIL‐1RI levels of healthy Japanese children using ELISA. The serum sIL‐1RI level of children (0–14 years) was significantly higher than that of adults (more than 15 years) (P=0.0138, n=90). Thus, it is recommended that when the serum sIL‐1RI level of patients is evaluated, it should be compared against age‐matched controls. J. Clin. Lab. Anal. 23:175–178, 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

人可溶性CD14检测体系的建立

目的　建立人可溶性CD14双抗体夹心ELISA检测体系。方法　用抗人CD14单抗为捕获抗体 ,加入待测抗原 ,第二抗体为兔抗人CD14多克隆抗体 ,最后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。结果　本检测体系灵敏度高 ,可达 5ng ml,特异性强 ,测量范围 5～ 12 0ng ml,重复性好 ,各项技术指标与国外同类产品相当。结论　本检测体系能够检测人体液中和细胞培养上清中sCD14 ,适用于临床及基础研究。     

相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法的建立与评价

目的建立相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法并进行方法学评价。方法优化最佳相思子毒素多抗包被浓度后建立了相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法,鉴定其检测灵敏度、线性范围、特异性、重复性、回收率等。结果双抗夹心ELISA方法检测相思子毒素的最小检出限为1ng/mL,标准曲线在10～100ng/mL范围内线性良好。血清中加入已知量的标准毒素蛋白,测得平均回收率为89%。结论本方法检测相思子毒素的可测范围广、特异性强、灵敏度高、变异系数较小,表明其灵敏、特异、可靠。     

双抗原夹心与间接ELISA法检测抗HCV对比研究

[目的]用研制的双抗原夹心ELISA法试剂与间接ELISA法试剂对比检测抗HCV。[方法]利用基因重组技术表达的HCV多表位抗原分别包被和标记，收集献血员样本，二种国产（试剂A，B）及雅培间接抗HCV试剂同时检测，对一种试剂单独阳性和3种试剂检测均为阳性的样本，再用研制的双抗原夹心法进行检测。[结果]试剂A检测单独阳性的样本12份，试剂B单独检测阳性20份样本中，双抗原夹心检测为阴性 ；而三家试剂检测均为阳性9份样本，双抗原夹心检测均为阳性。[结论]双抗原夹心检测抗HCV特异性较间接法好，灵敏度二者相当。     

双抗原夹心ELISA检测抗HCV总抗体

目的建立检测抗HCV抗体的双抗原夹心ELISA法,评价其可行性。方法将与His或GST融合表达的HCV基因工程抗原,分别用作ELISA的包被和酶标记抗原,建立用于抗HCV总抗体检测的双抗原夹心ELISA。用此方法检测1 968份临床血清标本,并以间接ELISA(北京万泰试剂)与之对照;此外,用套式RT-PCR检测部分血清的HCV RNA。结果有1 761份血清2种ELISA检测均为阴性,有190份血清均为阳性,两种方法符合率为99.1%;有17份血清的检测结果不相符,间接法阳性而本法阴性的14份,其中HCV RT-PCR阳性1份;本法阳性而间接ELISA阴性的3份,其中RT-PCR阳性2份。双抗原夹心ELISA与间接ELISA的敏感性分别为99.48%、98.96%,特异性分别为99.94%、99.27%。结论新研制的检测抗HCV总抗体的双抗原夹心ELISA具有较高的敏感性和特异性,值得作进一步的深入研究。     

New highly sensitive sandwich ELISA system for soluble endoglin quantification in different biological fluids

Soluble endoglin (sEng) is a fragment of a membrane-associated receptor (CD105) expressed on endothelial cells, mesenchymal stem cells and trophoblast cells. It is considered as a regulatory factor involved in the development of preeclampsia (PE) and cancer-associated neo-angiogenesis. The purpose of this study was to describe a new sandwich ELISA for sEng quantification. In contrast to three commercial kits, the new ELISA was able to quantify sEng not only in blood plasma and cell culture supernatants, but also in urine and cerebrospinal fluid. The assay detected up to two orders of magnitude higher antigen levels than did the commercial kits. Using Western blot assay followed by SDS-PAGE or Blue Native PAGE, we demonstrated a heterogeneous nature of sEng molecules. Antigen heterogeneity is considered as a factor contributing to the pronounced differences in its content estimations by different ELISAs. We obtained evidence indicating that the assay was capable of detecting heterogenious sEng molecules. The new ELISA was validated as a quick, specific and accurate method for sEng quantification. Despite the differences in antigen content estimates, the assay had similar diagnostic performance as widely used commercial kit for the detection of severe PE in pregnant women based on plasma sEng contents. Moreover, the new assay was able to delineate diseased patients based on antigen levels in urine. Therefore, the new ELISA is a potentially valuable tool for in vitro and clinical studies.