移植超薄表皮片中成熟细胞逆向分化为表皮干细胞的现象

目的:观察移植超薄表皮片中成熟表皮细胞的分化及分布状态,以及其向表皮干细胞逆分化现象在创面修复过程中的存在。方法:采用荧光标记和免疫组织化学方法,检测解放军空军总医院2004-11/2005-05经环切术切取的成人的包皮12例,用中性蛋白酶消化获得表皮片,反复冲洗使基底层干细胞脱落。在一部分行苏木精-伊红、免疫组织化学染色的同时,另一部分皮片用DAPI标记后移植于由北京协和动物中心提供的12只裸鼠全层皮肤缺损的创面,于第4和7天取材制作冰冻切片,行免疫组化染色,荧光显微镜观察创面修复过程中表皮细胞角蛋白19、角蛋白14、角蛋白10的分布情况与表达特征。结果:①苏木精-伊红染色可见未标记移植的表皮片示有正常的层次结构,但标记移植的皮片组织学观察显示细胞层次有松弛、紊乱的迹象。②免疫组化染色及荧光显微镜示未标记移植前的皮片颗粒层以下几乎未见角蛋白19阳性细胞而有少量角蛋白14阳性细胞和大量角蛋白10阳性细胞,而标记移植的皮片有孤立成团同时发蓝-红双荧光的角蛋白19阳性细胞,且角蛋白14阳性细胞明显增多。③这些现象在移植后的第4天最为显著。结论:在超薄表皮片移植中显示有成熟表皮细胞向表皮干细胞方向的逆分化,起到了维持皮片活力和参与创面修复的作用。     

4,6-联脒-2-苯基吲哚标记超薄表皮片移植效果体内示踪评价

目的：评价4，6-联脒-2-苯基吲哚作为荧光示踪剂在标记超薄表皮片移植中的效果，为研究表皮片移植后细胞增殖和分化现象奠定基础。 方法：实验于2005-01／05在解放军总医院第一附属医院全军创伤修复实验室完成。表皮片用中性蛋白酶分离自人环切术的包皮。①分离出的表皮片分为两组，空白对照组和实验组，实验组移植前用激发蓝色荧光的4，6-联脒-2-苯基吲哚标记皮片，空白对照组以磷酸盐缓冲液代替。②将表皮片随机移植于8只裸鼠32个刨面，分别于移植4d和7d后取材。③用冰冻技术将皮片及其下组织切成厚度约为5斗m的冰冻切片，选用罗丹明标记的广谱抗角蛋白抗体作为参照荧光，常规处理后在荧光显微镜观察皮片的染色效果。 结果：8只裸鼠均进入结果分析。①皮片移植后的生长情况：空白对照组16个创面13个成活良好；4，6-联脒-2-苯基吲哚组16个创面14个成活良好。两组皮片成活率差异无显著性意义（χ^2=1．34，P〉0．05）。②皮片移植后的荧光显色结果：荧光显微镜下，4，6-联脒-2-苯基吲哚组可见圆点状的蓝色激发荧光；皮片激发的蓝色荧光与鼠源性组织的自发荧光有明显的对比度，在红色波长激发下可见皮片呈现均匀不一的红色荧光，合成荧光显色表明蓝色荧光多位于中央细胞核区域，红色荧光位于胞浆区域，荧光的对比度明显，且在皮片标记的8d之内荧光未见明显的衰退现象。 结论：用4，6-联脒-2-苯基吲哚示踪移植表皮片，效果良好且标记稳定，故4，6-联脒-2-苯基吲哚可以在表皮片移植的细胞增殖分化研究中加以运用。     

正常人皮肤表皮干细胞定位特征对修复皮肤创伤的意义

目的：研究正常人皮肤中表皮干细胞的定位特征，探讨表皮干细胞与烧伤创面愈合的关系。方法：在需手术治疗的患者身上获取正常皮肤组织共24例，用α2、β1整合素和K10角蛋白作为第一抗体标记表皮干细胞，采用LSAB免疫组化方法研究皮肤中的表皮干细胞的表达位置。结果：分化高的K10阳性细胞分布于除表皮基底层以外的所有基底上层包括角质层、透明层、颗粒细胞层和棘细胞层的细胞中，而阴性染色区域则集中于表皮基底层。说明表皮基底层细胞不表达K10角蛋白；而α2、β1整合素阳性细胞位于基底膜上、邻接真皮的基底层，呈波浪状，起伏不平分布，同时在头皮的真皮网状层、毛囊末端底部及汗腺周围也发现有阳性细胞。而阴性染色细胞则位于基底层以上的表皮细胞。结论：表皮基底层、毛囊及汗腺周围中存在的表皮干细胞可能与皮肤创伤的修复有关，不同创面中残存的表皮干细胞可能是创伤修复过程中再上皮分化的细胞来源，这提示对残存的表皮干细胞的保护、激活、促进其增殖和分化是研究促进创面愈合的关键，从而可以部分阐明创伤愈合的机制。     

4,6-联脒-2-苯基吲哚标记超薄表皮片移植效果体内示踪评价

目的:评价4,6-联脒-2-苯基吲哚作为荧光示踪剂在标记超薄表皮片移植中的效果,为研究表皮片移植后细胞增殖和分化现象奠定基础。方法:实验于2005-01/05在解放军总医院第一附属医院全军创伤修复实验室完成。表皮片用中性蛋白酶分离自人环切术的包皮。①分离出的表皮片分为两组,空白对照组和实验组,实验组移植前用激发蓝色荧光的4,6-联脒-2-苯基吲哚标记皮片,空白对照组以磷酸盐缓冲液代替。②将表皮片随机移植于8只裸鼠32个创面,分别于移植4d和7d后取材。③用冰冻技术将皮片及其下组织切成厚度约为5μm的冰冻切片,选用罗丹明标记的广谱抗角蛋白抗体作为参照荧光,常规处理后在荧光显微镜观察皮片的染色效果。结果:8只裸鼠均进入结果分析。①皮片移植后的生长情况:空白对照组16个创面13个成活良好;4,6-联脒-2-苯基吲哚组16个创面14个成活良好。两组皮片成活率差异无显著性意义(χ2=1.34,P>0.05)。②皮片移植后的荧光显色结果:荧光显微镜下,4,6-联脒-2-苯基吲哚组可见圆点状的蓝色激发荧光;皮片激发的蓝色荧光与鼠源性组织的自发荧光有明显的对比度,在红色波长激发下可见皮片呈现均匀不一的红色荧光,合成荧光显色表明蓝色荧光多位于中央细胞核区域,红色荧光位于胞浆区域,荧光的对比度明显,且在皮片标记的8d之内荧光未见明显的衰退现象。结论:用4,6-联脒-2-苯基吲哚示踪移植表皮片,效果良好且标记稳定,故4,6-联脒-2-苯基吲哚可以在表皮片移植的细胞增殖分化研究中加以运用。     

糖尿病模型皮肤创面中人真皮多能干细胞向表皮细胞的分化

背景：研究表明,干细胞分化为何种细胞与其所处的微环境密切相关。因此设想：人真皮多能干细胞处于皮肤创面的微环境中,可能具有向人皮肤细胞转化的潜能。目的：探讨糖尿病皮肤创面微环境中的人真皮多能干细胞分化为表皮细胞的可能性。方法：分离培养人真皮多能干细胞并制作糖尿病裸鼠模型皮肤创面,将标记5-BrdU的第3~5代人真皮多能干细胞以注射方式回植入糖尿病裸鼠创面组织周围,分别于注射后2,3周取材,常规石蜡包埋、连续切片,行BrdU和角蛋白免疫组织化学染色。结果与结论：BrdU阳性细胞出现在表皮中,且连续切片中部分BrdU阳性细胞也同时表达角蛋白。说明在糖尿病创面愈合过程中,人真皮多能干细胞具有向表皮细胞分化的潜能。     

羊膜负载表皮干细胞促进糖尿病大鼠创面的愈合

背景:表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞,具有强大增殖及多向分化潜能,与创面修复紧密相关.近期研究表明糖尿病皮肤创面愈合过程中表皮干细胞数量减少、活性降低是导致其创面难愈的重要原因.目的:观察表皮干细胞在糖尿病大鼠创面愈合中的作用.方法:分离培养及鉴定SD大鼠表皮干细胞,并以BrdU标记.建立糖尿病SD大鼠创面模型,抽签法随机分为3组:表皮干细胞组创面移植羊膜负载BrdU标记的表皮干细胞;羊膜组创面移植羊膜;空白对照组创面未给予干预. 观察创面愈合情况、计算创面愈合率,苏木精-伊红及免疫组织化学SP法检测创面愈合组织中BrdU及增殖细胞核抗原表达.用图像分析软件测量阳性细胞积分吸光度平均值.结果与结论:表皮干细胞组治疗后7d创面缩小明显,治疗后14 d创面基本愈合,创面愈合率明显高于羊膜组、空白对照组 (P < 0.01).表皮干细胞组创面及新生表皮中可见BrdU阳性细胞,而另两组皮肤创面组织中始终未见BrdU阳性细胞.各组创面组织中可见增殖细胞核抗原阳性细胞表达,但表皮干细胞组的阳性细胞积分吸光度平均值与羊膜组、空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01).结果证实糖尿病大鼠创面愈合过程中表皮干细胞与创缘表皮移行、创面的上皮化有直接关联,可有效促进其创面愈合.     

糖尿病模型皮肤创面中人真皮多能干细胞向表皮细胞的分化

背景:研究表明,干细胞分化为何种细胞与其所处的微环境密切相关.因此设想:人真皮多能干细胞处于皮肤创面的微环境中,可能具有向人皮肤细胞转化的潜能.目的:探讨糖尿病皮肤创面微环境中的人真皮多能干细胞分化为表皮细胞的可能性.方法:分离培养人真皮多能干细胞并制作糖尿病裸鼠模型皮肤创面,将标记5-BrdU的第3~5代人真皮多能干细胞以注射方式回植入糖尿病裸鼠创面组织周围,分别于注射后2,3周取材,常规石蜡包埋、连续切片,行BrdU和角蛋白免疫组织化学染色.结果与结论:BrdU阳性细胞出现在表皮中,且连续切片中部分BrdU阳性细胞也同时表达角蛋白.说明在糖尿病创面愈合过程中,人真皮多能干细胞具有向表皮细胞分化的潜能.     

自体全层皮肤移植成活过程中表皮干细胞的变化规律

背景:表皮干细胞的研究有相当的成绩,但皮肤移植成活过程中表皮干细胞数量及在皮肤各层中的分布动态变化规律尚需探讨。目的:观察自体全层皮肤移植成活过程中表皮干细胞随其所处微环境的改变及其变化规律。设计:对比观察的前瞻性动物实验。单位:南华大学第一附属医院烧伤整形外科。材料:选用南华大学实验动物中心提供的Wistar大鼠42只,2～3月龄,清洁级,雌雄不拘,体质量200～250g。饲养1周后按观察时间随机分为7组,术后24h组,3d组,5d组,7d组,14d组,21d组和30 d组,每组6只。抗体:一抗:兔抗鼠整合素β1多克隆抗体(武汉博士德生物公司)小鼠抗大鼠p63单克隆抗体(santa cruz公司);二抗:山羊抗兔IgG(北京中杉生物公司),山羊抗小鼠IgG(北京中杉生物公司);S-P免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉生物公司)。方法:实验于2006-05在南华大学动物实验室完成。①所有大鼠背部制作(1.5x1.5)cm2面积的自体全层皮肤移植模型,在不同时间点观察移植皮片的颜色改变,移植皮片下是否有积血、积液,皮片是否与创面粘合。②每只大鼠手术时切取少许皮片立即放入100g/L中性甲醛中固定并标记为空白对照组。③术后24h组,3d组,5d组,7d组,14d组动物分别在相应时间拆开移植皮片固定包,在各创面中央切取皮肤组织固定并标记;术后21d组和30d组术后14d拆包,继续喂养至术后21d和30d在移植皮片中央切取皮肤组织。④制作HE染色和免疫组织化学染色病理切片。主要观察指标:①切片中炎症细胞的数量、上皮化程度、纤维细胞的含量。②整合素β1和基因物质p63阳性细胞率。结果:纳入Wistar大鼠42只全部进入结果分析。①创面大体观察:术后一二天颜色苍白、水肿;术后3d皮片颜色未见有明显的好转,但皮片与创面贴附较紧密;术后7d皮片颜色明显好转,表皮颜色接近正常,皮片与创面粘连紧密,创面有部分毛根长出;术后14d皮片创周已经和创面完全愈合;术后30d皮片颜色较正常稍微深,毛发生长同正常皮肤。②苏木精-伊红染色病理切片观察结果:前4组见皮片内细胞水肿,有少量炎性细胞浸润,术后5d发现皮片部分角质细胞坏死脱落。③阳性细胞的分布和数量变化规律:整合素β1和基因物质P63阳性细胞在术前主要分布于表皮的基底层和毛囊隆突部,从术后24h阳性细胞开始在表皮的各层出现,且数量逐渐增多,术后14和21d在表皮的各层均见到较多的阳性细胞,术后30d阳性细胞主要分布在表皮的基底层,但在其它各层仍然有少量的阳性细胞出现。免疫组化切片中基因物质P63的阳性细胞数均高于同时限点β1整合素的阳性细胞数,从术后24h开始减少,到术后3d达到最低点,然后逐渐增加,到术后7d阳性细胞的比例达到或接近术前,继续增加。术后21d时阳性细胞比例达到最高点,然后又逐渐减低,术后30d时阳性细胞比例仍高于术前。结论:①表皮干细胞在自体全层皮片移植成活过程中先减少,然后逐渐增加至超过正常皮肤。②自体全层皮肤移植成活过程中,表皮干细胞在皮肤中的排列紊乱,几乎在表皮各层均能见到表皮干细胞;而后又逐渐集中于表皮的基底层和毛囊隆突部。     

低频电磁场在基因修饰表皮干细胞移植修复创面中的作用

背景：烧伤、慢性创面等大面积皮肤缺损的创面修复是临床上亟待解决的难题。表皮干细胞和角质化细胞生长因子可为创面的治疗提供新的策略。低频电磁场作为一种非侵入性物理刺激在创面修复中已被认为较佳的方法。目的：探讨低频电磁场在角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植促进小鼠皮肤全层缺损创面修复中的作用。方法：体外分离培养SD乳鼠表皮干细胞,用5-溴脱氧尿核苷进行标记,成功转染角质化细胞生长因子基因腺病毒表达载体后,移植于昆明小鼠全层缺损创面。建立全层缺损创面小鼠模型,分别进行表皮干细胞移植,角质化细胞生长因子修饰的表皮干细胞移植,角质化细胞生长因子修饰的表皮干细胞移植外加低频电磁场干预。结果与结论：移植后第9,16天,低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组创面收缩率优于其他各组（P〈0.05）。移植后第9天,免疫荧光染色法检测显示,各组组创面中均有5-溴脱氧尿核苷阳性细胞分布。移植后第16天,Westernblot检测显示,低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组和角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组创面组织中角质化细胞生长因子蛋白表达高于表皮干细胞移植组（P〈0.05）;移植后第16,30天,苏木精-伊红染色结果显示,低频电磁场干预的角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植组的创面组织上皮化现象较明显。结果证实,低频电磁场有促进角质化细胞生长因子基因修饰的表皮干细胞移植修复小鼠皮肤全层缺损创面的作用。     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景：动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞。目的：观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达。方法：采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化。结果与结论：采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化。