pIRVP3/pIRHNVP3核酸表达质粒的构建及对肿瘤细胞的影响

目的：研究应用凋亡素基因（VP3）和NDV HN基因联合抗肿瘤的可能性。方法：以pIRES1neo为表达载体构建了含鸡贫血病毒VP3基因和长春株HN基因的pIRVP3/pIRHNVP3 2个核酸重组质粒，将2个重组质粒在体外转染HeLa和OS－732细胞，用荧光显微镜，DNA琼脂糖电泳及TUNEL染色等方法，检测凋亡素基因和HN基因导致细胞死亡的类型。结果：pIRVP3和pIRHNVP3转染HeLa和OS－732细胞48h后，pIRVP3和pIRHNVP3均具有很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力，且pIRVP的抗肿作用强于pIRHNVP3。结论：在体外，pIRVP3和pIRHNVP3有望成为新的抗肿瘤生物制剂。     

Ⅰ型人免疫缺陷病毒gag-gp120嵌合基因核酸疫苗的构建与鉴定

目的：构建含Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)gag—gp120嵌合基因核酸疫苗的表达质粒。方法：将gag和gp120连接后的嵌合基因插入到真核表达载体pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGE。用脂质体法将构建的重组质粒转染Hela细胞72h后，取转染的Hela细胞进行RT—PCR检测和和Dot—ELISA分析。结果：重组质粒转染细胞的总RNA中，可扩增出目的基因的转录产物。Dot-ELISA的结果显示，目的基因在Hela细胞内得到表达。结论：成功地构建了表达gag—gp120嵌合基因的核酸疫苗质粒，为HIV—1核酸疫苗的制备奠定基础。     

P3启动子调控融合基因质粒构建及在肝癌细胞中表达(英文)

目的：构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因（IGF-Ⅱ）P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法：应用基因重组技术，构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体，脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。     

新城疫病毒对肿瘤细胞生物学行为的影响

目的：研究新城疫病毒（NDV）对肿瘤细胞的作用。方法：采用空斑试验观察NDV对鸡胚成纤维细胞（CEF）的作用。通过细胞抑制试验，琼脂糖凝胶电泳，TUNEL染色，细胞骨架染色及细胞唾液酸含量测定等，观察NDV对肿瘤细胞的影响。结果：NDV对CEF，HeLa及Hep-2等肿瘤细胞可产生明显的病变，而对人的羊膜细胞（Wish细胞）无明显影响；对Hela细胞和Hep-2细胞能产生明显的生长抑制作用。但无量效依赖关系。NDV还可导致以凋亡为主的细胞死亡。引起Hela细胞和Hep-2细胞的细胞骨架发生改变，以及去除肿瘤细胞表达唾液酸的作用。结论：NDV能选择性地作用于人肿瘤细胞。抑制肿瘤细胞的生长，导致肿瘤细胞发生凋亡，有望成为一种有效的抗肿瘤生物制剂。     

抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（mAb)κ链基因，并将其转染到HeLa细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，用RT－PCR法获取κ链cDNA。将其克隆入真核表达载体pcDNA3，用脂质体转染法转染HeLa细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠mAb杂交瘤细胞系E4B7中克隆了κ链基因。序列测定表明，Vκ属于鼠免疫球蛋白XⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体pcDNA3-E4B7κ转染HeLa细胞后，在HeLa细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在HeLa细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Fab段打下了良好基础。     

hPOT1基因过表达对HeLa细胞细胞周期和凋亡的影响

目的观察人POT1(protection of telomeres1)基因过表达对HeLa细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。方法利用本课题组构建的hPOTl基因真核表达重组质粒pcDNA3-hPOT1,经脂质体介导瞬时转染HeLa细胞;通过RT-PCR和EMSA法(电泳迁移率改变分析)检测外源基因的表达效果,流式细胞术分析细胞周期,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡。结果pcDNA3-hPOT1重组质粒转染HeLa细胞48h后,mRNA和蛋白质分析表明,外源性hPOT1基因能在HeLa细胞中有效表达,HeLa细胞阻滞于细胞周期s期,而对凋亡无明显影响。结论hPOT1基因可能参与了高等真核细胞细胞周期调控过程,但与细胞凋亡无密切关系。     

HeLa细胞中miRNA-214靶基因Mek3的确定

目的 探索miRNA-214在HeLa细胞中的与其靶基因Mek3相互作用.方法 通过miRNA靶基因预测网站寻找可能与miRNA-214相互作用的靶基因,合成miRNA-214和对照序列,将miRNA-214、对照序列、Mek3的3'非翻译区(3' UTR)以及突变的Mek3 3'UTR分别克隆到表达载体上,转染HeLa细胞,转染48 h后提取蛋白,检测绿色荧光蛋白的表达水平; HeLa细胞转染miRNA-214后,Trizol抽提RNA,通过荧光定量PCR检测Mek3 mRNA的表达水平;Western印迹检测Mek3的蛋白表达水平.经过以上实验从mRNA和蛋白水平上验证了在HeLa细胞中miRNA-214对靶基因Mek3的作用效应.结果 生物信息学方法显示miRNA-214和Mek3存在可能的结合位点.经过实验验证了miRNA-214可以下调Mek3的mRNA和蛋白水平.结论 miRNA-214可以负调节靶基因Mek3的表达.     

人幽门螺杆菌外膜蛋白18000 DNA疫苗的构建及表达

目的：构建含人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H-pylori)18000外膜蛋白编码基因的真核重组载体，并在COS-7细胞中表达，为核酸疫苗的开发奠定基础。方法：从原核表达质粒pET32a( )／528中，酶切H-pylori 18000外膜蛋白编码基因片段，将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pcDNA3．1进行连接，而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pcDNA3．1／528，并在COS-7细胞中表达，以RT-PCR，Western法检测其表达产物。结果：经单、双酶切证实插入的基因片段为H-pylori 18000外膜蛋白编码基因；采用RT-PCR方法，能够从转染的COS-7细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段，Western法等检测显示，该重组质粒能够在COS-7细胞中表达目的蛋白，而且具有生物活性。结论：成功地构建了核酸疫苗pcDNA3．1／528，并在COS-7细胞中表达，为H-pylori核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。     

人颗粒酶B融合蛋白对转染的HeLa细胞的作用

目的 观察颗粒酶B（granzyme B)融合蛋白对转染的HeLa细胞的作用。方法 用RT－PCR法获取人granzyme B全长cDNA，经重组PCR将活性型序列的5′端与一段PE转膜肽序列融合。将所获重组基因克隆入绿色荧光蛋白（GFP）共表达载体pIRES2-EGFP,转染HeLa细胞。用免疫组化染色法检测目的蛋白的表达，荧光显微镜和电镜观察转染细胞的形态和结构。结果 成功地获得了野生型granzyme B cDNA及其融合蛋白基因，并构建了融合蛋白基因与GFP基因共表达的真核载体。转染HeLa细胞后，检测到目的蛋白的表达。荧光显微镜观察转染细胞有两种变化：一种表现为体积增大并常伴随多核现象；另一种出现细胞质和细胞核的固缩。电镜观察显示，多核巨细胞生长状态良好，固缩的小细胞则呈现凋亡的典型特征。结论 granzyme B融合蛋白在HeLa细胞中异位表达，可使转染细胞的形态发生变化，出现多核的大细胞和核固缩的小细胞。     

PIP反义核酸对乙肝病毒PRE转录后调节的影响

目的 研究乙肝病毒转录后调节元件(PRE)结合蛋白PIP在PRE转录后调节机制中的作用。方法 用质粒pcDNA3．1(-)构建PIP反义核酸真核表达重组体pAS-PIP；用pAS-PIP转染HepG2细胞，再将依赖于PRE转录后调节的CAT报告质粒转染上述细胞，通过ELISA方法检测CAT的表达水平。结果 成功构建PIP反义核酸真核表达重组体pAS-PIP；基因转染结果显示，与转染空载体组相比，转染pAS-PIP反义核酸组CAT水平下降21．97％。结论 PIP反义核酸可有效地降低依赖于PRE的CAT的表达,PIP在PRE转录后调节中起着重要的作用。     

TRAIL is Involved in the Tumoricidal Activity of Mouse Natural Killer Cells Stimulated by Newcastle Disease Virus in Vitro

Newcastle disease virus (NDV) is a potential antitumor agent, and its antitumor effect has been evaluated in preclinical tests. However, the mechanisms of NDV‐based antitumor therapy are still not completely clear. In the present study we found that NDV‐stimulation enhanced the killing ability of mouse spleen natural killer (NK) cells towards mouse hepatoma cell lines, and tumor necrosis factor (TNF)‐related apoptosis‐inducing ligand (TRAIL) plays an important role in this tumoricidal activity. NDV stimulation induced up‐regulation of TRAIL both at the mRNA and protein levels in NK cells. Blocking TRAIL by antibody (Ab) almost completely eliminated the killing effect of NK cells on hepatoma cell lines. Furthermore, neutralizing interferon (IFN)‐γ by Ab could inhibit TRAIL expression and tumoricidal activity of NDV‐stimulated NK cells. These results indicated a substantial role of TRAIL as an effector molecule in NDV‐induced NK cells mediated tumoricidal activity. The NDV stimulation triggered TRAIL expression in mouse spleen NK cells could be mediated by IFN‐γ induction. Anat Rec, 296:1552–1560, 2013. © 2013 Wiley Periodicals, Inc.     

HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的研究

目的探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.结果载体HSV-TK导入了PA317细胞.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg/ml)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小约11.1%、30.6%和47.2%(均P＜0.001);RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中有表达;实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变.结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

丙肝核酸疫苗免疫的CTL活性检测

目的 :探讨丙肝核酸疫苗的细胞免疫应答效果。方法 :用丙肝核酸疫苗pSVL HCV C E1 通过皮下注射途径免疫BALB C小鼠 ,以绿色荧光载体重组体pEGFP N1 HCV C E1 转染的小鼠骨髓瘤细胞SP2 0作为靶细胞 ,采用51 Cr释放法 ,以(Na) 2 51 CrO4 标记靶细胞进行标准的 4h杀伤试验检测其CTL活性。结果 :CTL杀伤率达 4 0 7%。结论 :丙肝核酸疫苗能激发强烈的细胞免疫     

Oxidized mitochondrial DNA sensing by STING signaling promotes the antitumor effect of an irradiated immunogenic cancer cell vaccine

Exposure to ionizing radiation, a physical treatment that inactivates live tumor cells, has been extensively applied to enhance the antitumor responses induced by cancer cell vaccines in both animal research and human clinical trials. However, the mechanisms by which irradiated cells function as immunogenic tumor vaccines and induce effective antitumor responses have not been fully explored. Here, we demonstrate that oxidized mitochondrial DNA (mtDNA) and stimulator of interferon genes (STING) signaling play a key roles in the enhanced antitumor effect achieved with an irradiated tumor cell vaccine. Elevations in ROS and oxidized mtDNA 8-OHG content could be induced in irradiated tumor cells. Oxidized mtDNA derived from irradiated tumor cells gained access to the cytosol of dendritic cells (DCs). Oxidized mtDNA, as a DAMP or adjuvant, activated the STING-TBK1-IRF3-IFN-β pathway in DCs, which subsequently cross-presented irradiated tumor cell-derived antigens to CD8⁺ T cells and elicited antitumor immunity. The results of our study provide insight into the mechanism by which an irradiated cell vaccine mediates antitumor immunity, which may have implications for new strategies to improve the efficacy of irradiated vaccines.     

脉冲电场对人宫颈癌Hela细胞侵袭转移能力的影响

背景：脉冲电场对肿瘤细胞侵袭转移能力是否具有抑制作用尚不十分清楚。 目的：探讨不同强度脉冲电场对人宫颈癌Hela细胞侵袭转移能力的影响及可能的机制。 方法：以场强分别为0,500,1 000和1 500 V/cm的脉冲电场作用人宫颈癌Hela细胞后,采用平板克隆形成实验,观察脉冲电场对细胞克隆能力的影响;采用Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭和转移实验,观察脉冲电场对细胞侵袭和转移能力的影响;采用RT-PCR法检测宫颈癌Hela细胞中基质金属蛋白酶2和RhoC基因mRNA的表达情况。 结果与结论：脉冲电场作用后,宫颈癌Hela细胞的克隆能力受到抑制;细胞侵袭和转移能力明显降低;基质金属蛋白酶2和RhoC基因mRNA的表达均明显减弱,且有电场强度依赖性。结果表明,脉冲电场能抑制人宫颈癌Hela细胞的侵袭转移能力,其机制可能与降低RhoC和基质金属蛋白酶2的表达有关。     

经维甲酸处理的瘤细胞作为“瘤苗”的免疫治疗实验

为观察维甲酸对体外培养的肿瘤细胞免疫原性的影响,本实验将经维甲酸处理的小鼠前胃癌(MFC)细胞作为活瘤苗,进行了免疫接种及免疫治疗的实验观察。结果表明免疫接种小鼠可完全排斥再次接种未经药物处理瘤细胞的生长,同时伴有体内细胞免疫反应增强。将该瘤苗用于荷瘤小鼠的免疫治疗,可使肿瘤生长速度减慢,荷瘤生存期明显延长,提示维甲酸可通过改变肿瘤细胞的免疫原性介导机体抗瘤反应。     

The Expression of Toll-like Receptor 8 and Its Relationship with VEGF and Bcl-2 in Cervical Cancer

BACKGROUND: Cervical cancer is one of the most common cancers in women worldwide, often associated with the infection of human papillomavirus (HPV). Toll-like receptor 8 (TLR8), a pattern recognition receptor, is involved in viral nucleic acid sensing. Recently TLR8 has been shown to be expressed in cancer cells, and it has been suggested that it may help cancer cell growth and tumor development. The objective of this study is to investigate the expression of TLR8 expression and its relationship with Bcl-2 and VEGF in cervical cancer cells.METHODOLOGY/PRINCIPAL: The mRNA expression levels of Bcl-2, VEGF and TLR-7,-8,-9 in newly diagnosed cervical cancer patients were detected by quantitative real-time PCR (qRT- PCR). Epifluorescence microscope was used to determine the presence of TLR8 protein in Hela cells. The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometer, and the cell proliferation was measured by MTT assay. Our data showed the increased mRNA levels of TLR8 in human cervical cancer samples as well as in HeLa cells, a cell line derived from a human cervical cancer. In addition, there was a positive correlation between the expression levels of TLR8 and Bcl-2 and VEGF in cervical cancer patients. When Hela cells were treated with TLR8 agonist CL075, the percentage of cells in G2/M +S was remarkably increased, accompanied by increased COX-2, BCL-2 and VEGF mRNA levels.CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: The mRNA expression level of TLR8 in the patients with cervical cancer and Hela cells were up-regulated, it consistent with the increased expression of VEGF and Bcl-2. The results suggest that TLR8 may be an interesting therapeutic target in cervical cancer.     

C_(215)抗原基因转染的瘤苗联合单抗与超抗原的融合蛋白C_(215)Fab-SEA的抗肿瘤作用初步研究

目的 :研究抗C2 1 5 单抗与超抗原———金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的融合蛋白C2 1 5 Fab SEA与C2 1 5 抗原基因转染的瘤苗共同激发的抗肿瘤效应。方法 :以脂质体法将人大肠癌相关C2 1 5 抗原的基因转染B16小鼠黑色素瘤细胞系制备成瘤苗 ,建立C5 7BL 6小鼠黑色素瘤荷瘤模型 ,观察其与融合蛋白C2 1 5 Fab SEA对肿瘤生长的抑制作用。结果 :融合蛋白与瘤苗联合治疗组小鼠的抑瘤率明显高于单用融合蛋白组和单用瘤苗组 (P<0 0 1)。结论 :融合蛋白C2 1 5 Fab SEA与C2 1 5 抗原基因转染的瘤苗 ,两者的抗肿瘤效应能相互增强 ,其共同激发的免疫应答能控制荷瘤动物肿瘤的生长。