O139霍乱弧菌O-抗原基因的克隆表达

Ｏ１３９霍乱弧菌Ｏ┐抗原基因的克隆表达＊曲殿波刘传暄马清钧军事医学科学院生物工程研究所北京１００８５０霍乱弧菌脂多糖已经被公认为一种保护性抗原。它由３部分组成：Ｏ－抗原、核心多糖和磷脂Ａ。其Ｏ－抗原具有特异的免疫原性及抗原性。霍乱弧菌的抗血清与脂多糖...     

霍乱0139脂多糖基因的克隆表达

霍乱０１３９脂多糖基因的克隆表达曲殿波刘传暄马清钧军事医学科学院生物工程研究所北京１００８５０霍乱弧菌脂多糖作为一种保护性抗原，其抗血清可以抑制霍乱弧菌在小肠粘膜上的粘附并且可以破坏霍乱弧菌，因此，在研制霍乱疫苗时可以作为一种有用的成分。同时，脂多糖...     

霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBB—CTAB融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1158bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pET—ctxAB，SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。     

端粒酶催化亚基hTRT组合抗原决定簇基因的克隆与表达

目的：利用计算机软件对端粒酶催化亚基抗原决定簇进行模拟预测分析，制备端粒酶催化亚基组合抗原决定簇重组蛋白，为制备端粒酶催化亚基单克隆抗体提供条件。方法：以Goldkey软件模拟分析端粒酶催化亚基抗原决定簇，设计抗原决策簇的PCR扩增系列引物，组合PCR扩增获得组合抗原决定簇序列并克隆到pGEM-T Easy Vector载体中，组合抗原决定簇基因序列插入pGEX-6P-1中，诱导表达融合蛋白，亲和层析获得组合融合蛋白重组抗原。结果：发现了4个可能性较大、序列较长的抗原决定簇氨基酸离列，获得了重组人端粒酶催化亚基组合融合蛋白。结论：实验结果表明，计算机辅助设计和组合扩增技术是获得含多位点抗原决定簇的端粒酶催化亚基组合抗原融合蛋白的有效方法。     

人表皮生长因子基因的克隆和表达

人表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)也称尿抑胃素(Urogastrone),主要在十二指肠Brunner氏腺产生。EGF具有多种生物学作用,可刺激或抑制细胞的增殖,促进细胞的分化。EGF最近还被认为是一种脑肠肽,有神经传导和神经递质的功能。EGF在体外可以刺激多种间质及内皮细胞的生长,是无血清培养基的重要成分。日本和澳大利亚的科学家     

DNA错配修复基因MutS的克隆和表达

目的：克隆ＭｕｔＳ基因并构建高效表达菌株，为建立ＤＮＡ错配突变检测系统和应用于临床肿瘤的检测等打下重要的基础。方法与结果：通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组中扩增得到ＭｕｔＳ基因（２．６ｋｂ），克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，构建了重组质粒载体ｐＧＥＭ－Ｔ／ＭｕｔＳ，核酸序列分析表明所克隆的基因与Ｇｅｎｂａｎｋ的ＭｕｔＳ一致。然后亚克隆到原核表达载体ｐＢＶ２２０上，构建了重组菌株ＤＨ５α／ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ，４２℃热诱导表达ＭｕｔＳ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在相对分子质量９７×１０３左右处出现一条表达量高达３０％以上的表达蛋白带，而对照菌株表达量很低。将重组质粒ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ转化到ＭｕｔＳ缺陷菌株ＥＳ１３０１互补了该菌株ＭｕｔＳ的缺陷，使其链霉素、利福平抗性（Ｓｔｒｒ，Ｒｉｆｒ）的突变频率分别降低９９％、９６％。结论：克隆得到ＭｕｔＳ基因并在大肠杆菌中得到高效表达，表达的ＭｕｔＳ蛋白在菌体内具有生物学功能     

人转化铁受体基因的克隆和表达

目的探讨人转化铁受体基因（hTfR）克隆和高效表达的方法及临床意义。方法用RT-PCR法从人胚肝、肺组织中克隆hTfR基因，构建重组表达质粒pcDNA3-hTfR和pEGFP-C1-hTfR，转染人胚肾上皮HEK293细胞。用Western印迹法检测pcDNA3-hTfR转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达情况；用荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察重组pEGFP-C1-hTfR质粒转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达水平及亚细胞定位。结果经过DNA测序证实，克隆的hTfR基因为全长cDNA序列（2332bp）。Western印迹法检测到转染细胞能有效表达190×10^3的hTfR蛋白，荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白（GFP）-hTfR融合蛋白主要定位于细胞膜。结论从人胚肝、肺组织中可以成功克隆hTfR基因，该基因转染HEK293细胞后可获得hTfR蛋白的高效表达。hTfR主要定位于细胞膜。     

埃博拉病毒NP抗原表位区段的克隆和表达

目的分析埃博拉病毒核蛋白（ NP）抗原表位,克隆表达埃博拉病毒NP抗原,为免疫学诊断试剂的研究奠定基础。方法采用BioSun生物学软件预测分析埃博拉病毒NP抗原的氨基酸表位区间,采用大肠杆菌优势密码子反向翻译成基因序列,采用PCR退火合成法合成NP优势密码子抗原基因,并利用载体pBVIL1进行克隆表达。采用间接ELISA技术评价获得NP抗原的特异性。结果确定埃博拉病毒NP抗原的氨基酸表位位于360～739 aa,共设计36条引物,扩增合成1140 bp的NP抗原基因,克隆表达后,融合蛋白相对分子质量为58×103,测序结果显示插入的NP基因正确。初步结果显示,NP抗原的特异性为99．24％（130／131）。结论获得埃博拉病毒NP抗原,为进一步研制特异的埃博拉病毒快速诊断试剂提供了抗原储备。     

大肠杆菌aroE基因的克隆与表达

目的:克隆表达大肠杆菌莽草酸脱氢酶基因aroE,并测定其生物学活性。方法:根据大肠杆菌中aroE基因的序列设计了一对引物,利用PCR技术扩增得到aroE基因,将其克隆入高效原核表达载体pBV220,以双脱氧法进行测序,然后对该重组子利用温度诱导表达,并测酶的生物活性。结果:构建了aroE基因的克隆和表达重组子,aroE基因获得高效表达,SDS-PAGE图谱显示新增30×103蛋白带,酶活性测定结果表明奎尼酸脱氢酶的相对酶活性是5.6倍。结论:实现了莽草酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的高效表达,证明了其具有奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌种奠定了基础。     

黑色素瘤抗原MAGE-3基因的原核表达

肿瘤抗原基因的克隆、测序和表达是研究肿瘤免疫治疗性疫苗的基础.本研究采用Oligo V6.0基因分析软件,对人黑色素瘤抗原MAGE-3基因序列进行分析后设计引物,扩增和克隆MAGE-3基因片段(210 ～623位碱基),在大肠杆菌中诱导其表达,以期为制备MAGE-3抗体和肿瘤疫苗奠定基础.     

结核分枝杆菌Rv2389c基因的克隆和原核表达

目的:克隆并原核表达结核分枝杆菌Rv2389c基因。方法:培养结核分枝杆菌,提取其基因组,PCR扩增出485bp的Rv2389c基因,克隆入pSP73载体,测序分析。将该目的基因亚克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),待大肠杆菌增菌至A600nm值为0.6时,用0.3 mmol/L IPTG在30℃诱导表达重组蛋白。结果:测序结果证实获得了Rv2389c基因,其序列与GenBank中报道完全一致。构建了重组表达质粒,表达的蛋白以12%SDS-PAGE分析,在Mr约42KD处出现一条新生蛋白带,经凝胶薄层扫描检测,表达量约占菌体蛋白的26.8%。结论:成功克隆了结核分枝杆菌Rv2389c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS3丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达

丙型肝炎病毒ＮＳ３丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达邓小艺朱千政杨佩英军事医学科学院微生物学流行病学研究所北京１００８５０丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）是输血后非甲非乙肝炎的主要病原体，约有４０％～５０％的丙型肝炎病人可发展成为慢性...     

甲型H1N1流感病毒抗原表位区段的克隆和表达

据统计,全世界每年流感流行都会造成10％～20％的人感染流感病毒,给整个社会带来极大的经济负担。2009年4月在墨西哥、美国暴发的甲型H1N1流感,其病毒是一种与猪流感病毒高度同源的新型变异毒株,它包含禽流感、猪流感和人流感3种流感病毒的基因片段,同时拥有亚洲猪流感病毒和非洲猪流感病毒的特征,是一种“杂交型”流感病毒。与传统的猪流感病毒不同,该病毒能在人和人之间快速传播。到目前为止,全球40多个国家均发现有甲型H1N1流感病毒感染的存在,国内外高度关注该病毒诊断试剂和疫苗的研制。     

HCCR-2基因的克隆及原核表达

目的:克隆HCCR-2基因、原核表达并鉴定。方法:从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA,经RT-PCR获得HCCR-2基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,测序、鉴定。将测序正确的HCCR-2基因亚克隆到pET-28a( )表达载体中,构建HCCR-2表达载体,IPTG诱导表达1~5h,做SDS-PAGE分析,鉴定HCCR-2蛋白的表达。结果:DNA测序证明,获得了HCCR-2基因,其序列与GenBank中报道序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,HCCR-2蛋白获得高效表达,其相对分子质量为39kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%。结论:HCCR-2基因的克隆和表达均获得了成功,为进一步探讨HCCR基因在骨肉瘤诊治中应用奠定了基础。     

HCMV gp52基因的克隆与表达

目的：克隆表达人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)gp52基因，制备特异性抗原，用于HCMV早期诊断。方法：从感染的HCMV细胞上清液中提取病毒的DNA，用PCR扩增gp52蛋白IgM抗原决定簇编码区DNA片段，并将其克隆到pGEM-Teasy载体测序，然后将其克隆到含有谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-5x-3中表达，表达产物经GST亲和层析柱纯化后，采用ELIA和免疫印迹(Westem blotting)检测重组蛋白的抗原性。结果：经序列测定gp52基因片段的序列正确，并在pGDX-5x-3表达载体中得到了高效表达。表达的融合蛋白用亲和层析柱纯化后经免疫印迹和ELISA分析具有良好的抗原性，能够与HCMV IgM阳性血清呈特异性反应。结论：通过基因工程制备的重组gp52蛋白可作为抗原用于HCMV感染者的早期诊断。     

重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆和表达

目的：克隆人KGF-2基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：通过PCR扩增，从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2的cDNA，并将其分别克隆入pBV220，pLEX和pGEX4T-1质粒中，研究其在不同表达质粒和大肠杆菌中的表达情况。结果：克隆得到的KGF-2cDNA经测序证明与文献报道的序列一致。将其克隆于pBV220质粒中，在E．coli JM109中表达量相对最高，约占茵体总蛋白的4％；克隆于pLEX质粒中，在E．coli G1724中的表达量约占全茵总蛋白的5％；克隆于pGEX4T-1中，在E．coli JM109中的表达量可占到全茵总蛋白的20％。结论：采用GST融合蛋白表达质粒pGEX4T-1对KGF-2进行表达，较pBV220和pLEX具有明显优势，能实现对KGF-2的高效表达，为进一步的功能研究奠定了基础。     

UROC28基因cDNA的克隆及其原核表达

目的：克隆人UROC28基因cDNA并在原核细胞中表达。方法：用RT-PCR从前列腺癌PC-3细胞系中扩增UROC28基因cDNA,并克隆到载体pUC-19中。经测序证实后,用HindⅢ/EcoRI双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,并转化E.coliDH5α菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定。结果：①经RT-PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人UROC28基因cDNA;②经IPTG诱导的重组质粒pGEX-4T-UROC28表达出相对分子质量（Mr）约为42000的融合蛋白,与预期的结果相符。结论：成功克隆到人UROC28基因cDNA,并在E.coliDH5α中表达出GST-UROC28融合蛋白。     

脱氢奎尼酸合成酶基因aroB在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 :克隆表达大肠杆菌脱氢奎尼酸合成酶基因aroB ,并测定其生物学活性。方法 :根据大肠杆菌中aroB基因的序列设计了一对引物 ,利用PCR技术扩增得到aroB基因 ,将其克隆入pGEM Teasy载体中 ,以双脱氧法进行测序 ,然后再克隆入高效原核表达载体pBV2 2 0 ,对该重组子的SD序列进行调节后利用温度诱导表达 ,并测酶的生物活性。结果 :构建了aroB基因的克隆和表达重组子 ,经SD序列调节后 ,aroB基因获得高效表达 ,SDS PAGE图谱显示新增 38.8× 10 3 蛋白带 ,酶活性测定结果表明脱氢奎尼酸合成酶的相对酶活性为 5 .4。结论 :实现了脱氢奎尼酸合成酶基因在大肠杆菌中的高效表达 ,为构建产脱氢奎尼酸工程菌种奠定了基础。     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。