Immune response in Balb/c mice induced by recombinant spike protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus

Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) is a highly aggressive pathogen that caused SARS in 2003 and 2004. Spike protein (S) on the surface of virus particles mediates the attachment of the virus to cell surface receptors and induces the fusion of viral and cellular membranes.     

SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的 探讨SARS冠状病毒的刺突(spike,S)蛋白的免疫学特性,以及S蛋白作为SARS-CoV病毒疫苗组分的可行性。方法 将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET-15b,并在大肠杆菌中表达,经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rS_a和rS_b;将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB,得到重组DNA疫苗pSecS,免疫小鼠,得到SAS-CoVS蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rS_a和rS_b建立的SARS-CoVS抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果 分段的重组蛋白rS_a和rS_b在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达,并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应,原核表达的重组分段S蛋白具有SARS-CoVS蛋白相似的抗原性。结论 原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS-CoV检测中;所构建的SARS-CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体,这为进一步SARSDNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的探讨SARS冠状病毒的刺突(spike，S)蛋白的免疫学特性，以及S蛋白作为SARS—CoV病毒疫苗组分的可行性。方法将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET—15b，并在大肠杆菌中表达，经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rSa和rSb；将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB，得到重组DNA疫苗pSecS，免疫小鼠，得到SAS—CoV S蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rSa和rSb建立的SARS—CoV S抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果分段的重组蛋白rSa和rSb在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达，并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应，原核表达的重组分段S蛋白具有SARS—CoV S蛋白相似的抗原性。结论原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS—CoV检测中；所构建的SARS—CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体，这为进一步SARS DNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 DNA疫苗与重组亚单位疫苗在小鼠中诱导中和抗体的效力分析

目的 探讨以严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）受体结合区（RBD）和表面刺突蛋白（S蛋白）S1亚基为疫苗靶抗原诱导中和抗体的效果。方法 构建SARS-CoV-2 RBD与小鼠IgG1 Fc段（mFc）融合蛋白表达质粒pVRC-RBD-mFc,转染人胚肾细胞293T并进行培养。用蛋白质印迹法检测细胞培养上清中的RBD-mFc融合蛋白,用微量中和实验检测细胞培养上清中的RBD-mFc及CHO细胞重组表达的SARS-CoV-2 S1与人IgG1 Fc段（S1-hFc）融合蛋白对SARS-CoV-2感染的抑制作用。分别用质粒pVRC-RBD-mFc及S1-hFc融合蛋白通过肌内注射接种BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗-S1 IgG,用微量中和实验检测小鼠血清的病毒中和活性。结果 pVRC-RBD-mFc质粒转染293T细胞的培养上清中可检测到RBD-mFc融合蛋白,超滤浓缩的细胞培养上清及S1-hFc融合蛋白均呈浓度依赖性抑制SARS-CoV-2对Vero E6细胞的感染;经pVRC-RBD-mFc质粒及S1-hFc融合蛋白免疫的小鼠血清中均可检测出抗-S1 IgG,且能中和SARS-CoV-2的感染;S1-hFc融合蛋白免疫小鼠血清的抗体滴度及病毒中和活性均高于质粒pVRC-RBD-mFc免疫小鼠血清（P均<0.01）。结论 SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白均可能作为有效的疫苗抗原,重组亚单位疫苗较DNA疫苗能更有效地诱导中和抗体。     

Inhibitory effects of TLR7/8ligand R-848on IgE production of murine in vivo

Objective To investigate whether R-848 could inhibit IgE production of mice immunized with OVA plus ALUM in vivo.Methods BALB/c mice were immunized s.c on the back with PBS,OVA,OVA plus R-848,OVA plus CpG,OVA plus ALUM,and OVA plus ALUM in R-848 or CpG every two weeks for three times.The blood from the mice was harvested after the last immunization,and the concentration of OVA specific or total IgE,IgG1 and IgG2a in the sera was determined;the splenocytes from the immunized mice were harvested and cultured with or without OVA for 3 days,and the concentration of IL-4 and IFNγ in the supernatants was determined.Results Firstly,we investigated that R-848 as Th1 adjuvant could enhance the production of OVA specific IgG2a in mice immunized with OVA.Secondly,further study showed that R-848 could inhibit the production of OVA specific IgE and total IgE,and promote the production of OVA specific IgG2a in the sera of mice immunized with OVA plus ALUM.Moreover,the results of ELISA showed that R-848 inhibiting IgE production was related to its reducing IL-4 production and enhancing IFNγ production.Conclusion R-848 could inhibit IgE production of mice immunized with OVA plus ALUM in vivo.     

空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的免疫原性研究

目的探讨空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的免疫原性及对机体的保护作用。方法以不同剂量的含弗氏佐剂的纯化PEB1重组蛋白为疫苗,分别经皮下注射和肌肉注射的方法免疫Balb/C小鼠,ELISA法测定血清中特异性抗体的含量,MTT法测定细胞增殖效应。CJ菌液攻击实验,观察攻击后小鼠的精神状态、病死情况,并做血液、肠道分泌液细菌培养。结果用PEB1重组蛋白免疫Balb/C小鼠,可诱导出高滴度的特异性抗体,能有效地刺激淋巴细胞增殖,加入刺激原的各实验组SI值均较对照组显著增高。结论PEB1重组蛋白免疫接种后可诱导出高滴度特异性抗体和致敏淋巴细胞,能有效保护小鼠免受大剂量空肠弯曲菌的攻击,是一种比较理想的基因工程亚单位疫苗候选抗原。细菌攻击实验结果表明,PEB1基因工程亚单位疫苗能使实验动物产生有效的免疫保护力,明显降低动物的患病率和病死率,并能有效地降低血液和肠道分泌液的细菌含量。     

ATP5B原核表达和单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：制备高纯度ATP合酶β亚基（ATP5B）单克隆抗体并进行鉴定,为其后续研究奠定基础。方法：应用PCR法扩增ATP5B基因,克隆入pET28a载体中并转入大肠杆菌BL21（DE3）。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达并用镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白纯度。用纯化的融合蛋白免疫3只雌性Balb/C小鼠,取小鼠尾静脉血,间接酶联免疫吸附法（ELISA法）检测血清中ATP5B抗体效价。取血清效价最高的免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞混合培养建立杂交瘤细胞,采用间接ELISA法筛选融合细胞并行单克隆化培养,对阳性细胞进行核型分析。取12周龄Balb/C小鼠,腹腔注射杂交瘤细胞制备腹水模型,收集腹水,间接ELISA法检测效价,SDS-PAGE检测抗体纯度,应用ELISA法检测抗体亚型。结果：PCR扩增后得到1 455bp的特异性条带,连接pET28a空载体获得重组pET28a/ATP5B载体。IPTG诱导转化的菌液表达目的蛋白,SDS-PAGE检测,在相对分子质量为51 000处出现明显的诱导蛋白条带。间接ELISA法检测免疫小鼠静脉血,血清效价最高达1：64 000。杂交瘤细胞染色体核型分析,染色体总数约为骨髓瘤细胞与正常小鼠脾细胞之和。采用杂交瘤细胞株制备小鼠腹水,抗体最高效价为1：240 000,杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的亚型为IgG1。结论：通过克隆、表达和纯化重组蛋白,成功制备出抗ATP5B蛋白单克隆抗体。     

SARS相关冠状病毒S2基因的克隆及其DNA疫苗的免疫效果

目的：构建抗原基因为SARS相关冠状病毒(severe acute resplratory syndrome coronavtrus，SARS—CoV)S2基因的DNA疫苗，将其接种小鼠后观察病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的S2基因片段克隆至真核表达载体，随之将质粒进行小鼠肌内接种免疫，定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：疫苗接种后第2周就能检测出病毒特异性抗体，随着时间的延续，抗体水平逐步升高，而空质粒对照组未检测出明显的特异性抗体。结论：以S2为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体。     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

沙眼衣原体T细胞抗原CT143原核表达、纯化及免疫活性鉴定

目的克隆沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）T细胞抗原Ct143基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法采用PCR技术从ct基因组中扩增Ct143基因,并构建pGEX-6p—Ct143原核表达质粒,转化E．coli XL1-Blue．IPTG诱导重组GST-CT143融合蛋白表达,经酶切后得到无GST标签的纯蛋白免疫Balb／c鼠,ELISA及Western-blot分析CT143蛋白免疫原性及免疫反应性。结果成功构建了pGEX-6p—CT143原核表达质粒,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的CtD型一致,长度为843bp;GST—CT143融合蛋白在E．coli中获得稳定高效表达;纯蛋白与佐剂混匀后肌肉免疫小鼠,ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1：12800,Westem blot结果表明该蛋白与Ct泌尿生殖道感染病人混合血清中IgG结合,具有免疫反应性。结论成功克隆表达了CtT细胞抗原CT143,该抗原经纯化后具有良好的免疫原性及免疫反应性。     

SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity

Objective To develop a specific SARS virus-targeted antibody preparation for emergent prophylaxis and treatment of SARS virus infection. Methods By using phage display technology, we constructed a naive antibody library from convalescent SARS patient lymphocytes. To obtain the neutralizing antibody to SARS virus surface proteins, the library panning procedure was performed on purified SARS virions and the specific Fab antibody clones were enriched by four rounds of repeated panning procedure and screened by highthroughput selection. The selected Fab antibodies expressed in the periplasma of E. coli were soluble and further purified and tested for their binding properties and antiviral function to SARS virus. The functional Fab antibodies were converted to full human IgG antibodies with recombinant baculovirus/insect cell systems and their neutralizing activities were further determined. Results After four rounds of the panning, a number of SARS-CoV virus-targeted human recombinant Fab antibodies were isolated from the SARS patient antibody library. Most of these were identified to recognize both natural and recombinant SARS spike （S） proteins, two Fab antibodies were specific for the virus membrane （M） protein, only one bound to SARS-CoV nucleocapsid protein. The SARS-CoV S and M protein-targeted Fab or IgG antibodies showed significant neutralizing activities in cytopathic effect （CPE） inhibition neutralization test, these antibodies were able to completely neutralize the SARS virus and protect the Vero cells from CPE after virus infection. However, the N protein-targeted Fab or IgG antibodies failed to neutralize the virus. In addition, the SARS N protein-targeted human Fab antibody reacted with the denatured N proteins, whereas none of the S and M protein specific neutralizing antibodies did. These results suggested that the S and M protein-specific neutralizing antibodies could recognize conformational epitopes which might be involved in the binding of virions to cellular receptors and the fusion activity of the virus Conclusion The SARS-CoV spike protein and membrane proteins are able to elicite efficient neutralizing antibodies in SARS patients. The neutralizing antibodies we generated in this study may be more promising candidates for prophylaxis and treatment of SARS infection.     

重组Calpain蛋白诱导抗体产生及检测日本血吸虫感染的研究

目的 研究在大肠杆菌中表达的日本血吸虫Calpain蛋白的免疫原性及其在日本血吸虫病诊断上的应用。方 法用重组Calpain蛋白免疫BALB／c小鼠，ELISA法测定特异性IgG抗体的动态变化及其IgG亚型(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)产生特征；同时用重组Calpain蛋白作为诊断抗原，粪检血吸虫病阳性患者血清作为一抗，肝吸虫阳性患者血清作为考核交叉反应血清。结果 重组Calpain抗原免疫小鼠后，产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体，免疫4周IgG类抗体达到高峰，与对照组鼠相比较免疫鼠血清中IgG1，IgG2a，IgG2b特异性抗体也显著上升；Calpain重组抗原血清检测日本血吸虫和粪检的符合率为100％，粪检阳性EPG低的个体抗Calpain抗体滴度高，EPG高的患者抗Calpain抗体滴度反而低，与肝吸虫的交叉反应率为37％。结论 日本血吸虫Calpain是一个具有免疫原性的蛋白，能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白，能够敏感地测定日本血吸虫的感染，提示Calpain可以发展成为日本血吸虫病的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子。     

应用合成的SARS病毒S蛋白重叠肽筛选B细胞表位

目的筛选SARS病毒S蛋白的B细胞表位。方法使用SARS-CoV S DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,获得SARS病毒S蛋白的免疫血清。人工合成包含169条部分氨基酸序列重叠的SARS-CoV S蛋白的多肽库。将多肽片段包被ELISA板,利用免疫小鼠血清,通过抗体结合试验来筛选SARS病毒S蛋白的线性B细胞表位。并将筛选结果与使用B细胞表位分析软件预测的结果进行比较。结果使用重叠肽合成法筛选到SARS-CoV蛋白两条多肽片段S335-352和S442-458,能与免疫动物血清特异性结合,与使用Bcipep数据库预测B细胞表位的结果相一致。结论鉴定了两个新的SARS病毒S蛋白B细胞表位。     

基因免疫制备抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体

目的通过基因免疫方法,制备抗SAILS病毒N蛋白的单克隆抗体并对单抗进行初步鉴定。方法将含有N蛋白的编码基因的真核重组质粒pSecTagB／N免疫BALB／c小鼠,然后取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用原核表达的SARS病毒N蛋白筛选阳性克隆。然后通过免疫印迹法进一步证明抗体对N蛋白的特异性,用ELISA方法检测抗体对灭活SARS全病毒的免疫反应。结果筛选得到10株抗N蛋白的单克隆抗体,ELISA和免疫印迹结果表明这些抗体特异性针对N蛋白上的抗原决定簇,且有7株抗体对SARS灭活病毒有阳性反应。结论所得的单克隆抗体特异针对N蛋白。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上,制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段S1c(N端249-667氨基酸残基),其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定1株为IgG1,2株为IgG2a,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体,为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的 在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上，制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法 原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段Slc(N端249-667氨基酸残基)，其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB／c小鼠，按常规方法制备单克隆抗体，并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果 筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定1株为IgG1，2株为IgG2a，经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论 获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体。为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

SARS冠状病毒S1基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的:为获得抗SARS的转基因植物疫苗,进行了SARS S1基因的克隆,植物表达载体构建的研究。方法:根据SARS S蛋白受体结合结构域318-510氨基酸区域,设计合成长579 bp的序列片断(S1基因)。并以之为模板,进行PCR扩增,扩增产物被克隆至pGEM-Teasy载体进行序列测定。然后将S1基因插入植物表达载体pCAMB IA2301的35S启动子和NOS终止子之间,构建植物表达载体pCS1。将重组体转化大肠杆菌E.coliXL1,并对重组体进行了鉴定。结果:酶切鉴定和序列分析显示,克隆的目的基因与设计的片断序列一致;双酶切表明,植物表达载体的构建完全正确。结论:成功地克隆了S1基因和构建了含有S1基因的植物表达载体,为进一步获得抗SARS的转基因植物疫苗打下了基础。     

白细胞介素-12和白细胞介素-18质粒对HBcAgDNA疫苗诱导小鼠(H-2d)体液免疫应答的影响

目的：观察编码白细胞介素（IL）－12和IL－18的真核表达载体[pcDNA3.1/IL-12(以下简称IL－12质粒）和pcDNA3.1/IL-18(以下简称IL－18质粒）]对HBcAg DNA疫苗（pJW4303/HBc)诱导BalB/c(H-2^d)小鼠免疫应答的影响。方法：肌肉注射接种IL－12质粒、IL－18质粒和HBcAg DNA疫苗，ELISA法检测小鼠血清抗HBc IgG亚类（IgGl,IgG2a)水平。结果：免疫6周后，联合注射IL－12、IL－18和IL－12＋IL－18组小鼠血清的抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0．05），抗HBc IgG亚类以IgG2a占优。结论：IL－12、IL－18以及IL－12＋IL－18联合HBcAg DNA疫苗注射能够提高小鼠血清中抗HBc水平。     

Ⅰ型登革病毒NS1蛋白特异性血清型单克隆抗体的制备及鉴定

目的研制Ⅰ型登革病毒(DEN1)非结构蛋白1(NS1)蛋白特异性单克隆抗体,鉴定其特异性。方法以具有良好免疫原性的DEN1重组NS1蛋白、DEN1全病毒及两者混合免疫共3种免疫方案,分别免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法双筛I、FA和Western Blot进行mAbs的类型及亚类、特异性等鉴定。结果采用3种免疫方案免疫Balb/c小鼠,获得9株抗NS1蛋白的mAb,其亚类测定一株为IgG2a,另外8株为IgG1。这些mAbs与DEN1重组NS1蛋白和DEN1全病毒均结合,而且特异性好,仅1株杂交瘤分泌的单抗和其余3型DEN有交叉反应。结论成功获得了特异性针对DEN病毒NS1蛋白的特异性血清型mAb,将为进一步研究NS1蛋白的结构和功能及临床诊断试剂研发奠定基础。