实验动物皮肤病原真菌多重PCR检测方法的建立与初步应用

目的 建立石膏样毛癣菌(Tm)、石膏样小孢子菌(Mg)、犬小孢子菌(Mc)和猴类毛癣菌(Am)的多重PCR检测方法,用于实验动物皮肤病原真菌的快速检测。方法 根据Genbank公布的四种皮肤病原真菌的18S-28S rRNA序列设计特异性引物,通过引物、dNTP、TaqDNA聚合酶浓度及退火温度和时间的优化,建立四种皮肤病原真菌的多重PCR体系。经特异性和敏感性检验后,对15份人工感染真菌大鼠毛和260份实验动物毛发样本进行检测。结果 所建多重PCR方法能够有效区分四种皮肤病原真菌,产生192 bp(Tm)、460 bp(Mg)、290 bp(Mc)和602 bp(As)的目的片段,最低检测限分别为5.9 pg/μL、6.6 pg/μL、9.5 pg/μL和5.1 pg/μL。被检的15份人工感染样本扩增结果准确,260份毛发样本中未检测出四种真菌。结论 所建立的多重PCR方法能够同时对实验动物中的四种皮肤病原真菌进行快速的检测,具有较高的应用价值。     

PCR方法检测实验动物皮肤病原真菌

目的对用于实验动物皮肤病原真菌检测的分子生物学方法即皮肤病原真菌通用引物PCR与AP-PCR（任意引物聚合酶链式反应）相结合技术的特异性及敏感性进行评价,并通过建立动物模型及实际的皮肤真菌检测来验证此方法的可行性。方法特异性测定：用皮肤病原真菌通用引物进行PCR,扩增大肠杆菌DNA、犬肝炎病毒DNA及小鼠肝癌H22细胞DNA。敏感性测定：以紫外分光光度法测定DNA质量浓度,根据测定值将DNA进行10倍系列质量浓度稀释,得到100 ng~10 fg的8个质量浓度,然后对其进行PCR扩增。建立实验动物皮肤病原真菌感染的动物模型。用皮肤病原真菌通用引物PCR与AP-PCR相结合技术检测从动物模型及河北省各地的实验动物单位采集的动物皮肤标本。结果用皮肤病原真菌通用引物扩增实验动物三种皮肤病原真菌标准菌株,均扩增出大小为440 bp的条带,而大肠杆菌、犬肝炎病毒、小鼠肝癌H22细胞均未扩增出条带。皮肤病原真菌通用引物PCR敏感性测定,模板DNA 100 ng~100 fg的7个系列浓度均扩增出了阳性条带,10 fg为阴性。建立了实验动物皮肤病原真菌感染的动物模型。对河北省各地的实验动物皮肤真菌检测过程中出现一例通用引物阳性标本。结论皮肤病原真菌通用引物（CHS1 1S,CHS1 1R）具有较强的特异性,敏感度为100 fg;将皮肤病原真菌通用引物PCR与AP-PCR技术相结合可用于检测实验动物皮肤病原真菌。     

60株临床分离犬小孢子菌的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性鉴定

目的探索采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法进行犬小孢子菌的快速鉴定。方法采用真菌通用引物第1内转录间隔区（ITS-1）与第4内转录间隔区（ITS-4）对60株犬小孢子菌进行PCR扩增,然后利用限制性内切酶TaqⅠ和HinfⅠ分别对PCR产物进行酶切分析。结果真菌通用引物ITS-1和ITS-4在60株犬小孢子菌中均扩增出1条长约750 bp的DNA条带;2种内切酶HinfⅠ和TaqⅠ各自显示相同的酶切结果,酶切片段稳定而清晰。结论应用PCR-RFLP方法可以快速、敏感、特异地鉴定犬小孢子菌。     

实验动物皮肤病原真菌DNA快速少量提取法

PCR技术应用于实验动物皮肤病原真菌检测,方法简单、省时。但是,真菌的DNA提取较为困难。本文推荐一种既简单又经济快速的提取皮肤真菌DNA的方法,并能成功用于实验动物皮肤病原真菌质量检测研究。     

病原性真菌PCR检测方法的建立

目的：建立一种快速、灵敏和特异的病原性真菌的检测方法。方法：选取真菌18S rRNA保守区的一对寡核苷酸序列作为通用引物,对10种真菌、3种常见细菌及80例临床标本进行PCR扩增。结果：所试10种真菌均能扩增出一条约400bp的DNA片段,而3种细菌则无此扩增条带。通过对80例临床标本的检测,证实PCR法和常规培养法结果基本一致。此外,对白色念珠菌检测的最低限为10pg的DNA。结论：PCR方法检测临床常见真菌有较高的灵敏性与特异性,有助于临床真菌感染性疾病的诊断与治疗。     

实验动物致病性真菌感染引起的人畜共患病

经微生物学检测 ,发现在实验动物的各种群体中 ,存在有致病性真菌感染 ,形成不同程度的感染率。主要病原体是石膏样毛癣菌 (Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ)、石膏样小孢子菌 (Ｍｉｏｒｏｓｐｏｒｕｍｇｙｐｓｅｕｍ)和羊毛状小孢子菌 (ＭｉｏｒｏｓｐｏｒｕｍＬａｎｏｓａｍ)等。这类致病性真菌不仅在实验动物中传播和扩散 ,危害动物群体 ,也常常危害动物实验人员和动物饲养人员。这提示有关人员对此不可忽视实验动物致病性真菌感染引起的人畜共患病@鲁连城$中国医科大学实验动物部!沈阳110001…     

申克孢子丝菌的随机扩增DNA指纹分型

目的：对申克孢子丝菌进行基因分型研究,探索申克孢子丝菌的基因分型标准。方法：用光镜对2株标准株,4株环境分离株和24株临床分离菌株进行形态特征观察,再用随机扩增DNA指纹方法(RAPD)对DNA进行PCR扩增,根据扩增产物的电泳带型来分析DNA多态性。结果：30株菌株镜下可见2种形态结构;30株申克孢子丝菌的DNA指纹带型不同;多引物聚类分析表明,3条引物可将30株不同地区来源申克孢子丝菌分作11个型。结论：(1)在我国申克孢子丝菌中存在2种不同的形态结构。(2)申克孢子丝菌中存在不同的基因型。(3)RAPD法用于申克孢子丝菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。     

常见皮肤癣菌的基因分型

目的建立快速、简便鉴别4种常见皮肤癣菌（红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌和石膏样小孢子菌）的分子生物学基因分型方法。方法将我室分离培养得到的18株红色毛癣菌、12株须癣毛癣菌、8株絮状表皮癣菌和6株石膏样小孢子菌接种于PDA培养基上培养2周后,分别收集菌丝体并用氯化苄法提取DNA,运用随机扩增多态性DNA分析的方法,以单个引物（GACA）4进行随机扩增。检测聚合酶链反应产物,并根据电泳后指纹图谱的差异进行种属间鉴别。结果同种不同株的皮肤癣菌电泳后指纹图谱相同,不同种皮肤癣菌电泳后指纹图谱有显著差异。结论运用随机扩增多态性DNA分析的方法,可对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌和石膏样小孢子菌的基因型进行快速鉴别,能够协助临床早期诊断。     

利用M-RAPD技术绘制不同病原微生物基因指纹图

目的探讨一种多重随机引物PCR方法(M-RAPD)对不同种株病原微生物进行鉴定的可能性。方法将10个碱基的随机引物进行随机组合,利用三条组合的随机引物在较高的退火温度下对不同种株病原微生物染色体。DNA进行扩增,通过15g／L琼脂糖凝胶电泳获得不同种株病原微生物的扩增图谱,并用软件Gelworks 1d Intermediate进行分析。结果初步实验表明,M-RAPD技术可以得到稳定的种株特异的DNA指纹图谱,其条带清晰、数目较多、片段大小分布均匀。三引物的扩增产物包含了其中任意两引物的绝大多数扩增产物,大、小片段均可出现增减,但小片段更易增加;对同一种病原微生物三引物所提供的基因信息要远多于两引物所提供的信息,增加的信息量约为原来的50％;不同耐药菌株问及其与相应标准株问差异亦很明显,但同种不同株问相同的扩增产物要多于不同的扩增产物。软件Gelworks 1d Intermediate的分析数据亦支持我们的实验结果。结论M-RAPD技术对不同种株病原微生物染色体DNA扩增时,能获取较丰富的遗传信息,可迅速、简便地鉴定不同种株的病原微生物。     

实验动物皮肤病原真菌检测方法的改良

目的对实验动物皮肤病原真菌2种培养方法进行了比较。方法将采集到的3只皮肤真菌感染病兔样品经由沙氏平皿法和沙氏试管斜面培养法分别进行培养。结果在3只真菌感染病兔中应用试管斜面法我们只检测到1例皮肤病原真菌阳性,而采用沙氏平皿法3例阳性全部检出。结论结合临床检测经验,我们认为本研究的沙氏平皿法优于沙氏试管斜面法,在实验动物皮肤病原真菌常规检测中具有推广应用价值。     

Clinical Identification of Common Species of Dermatophytes by PCR and PCR-RFLP

Summary: To find a fast and efficient way of identifying seven common dermatophytes in clinical practice, we used the techniques of polymerase chain reaction (PCR) and PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) targeting Topoisomerase Ⅱ gene. The DNA of 7 dermatophytes, along with Candida albicans, Aspergillus terreus and Aspergillus flavus were amplified by consensus primer dPsD1. They were then subjected to a second PCR with primers dPsD2 and species-specific primers PsT and PsME separately. 6 of the products generated by dPsD2 were digested with restriction enzyme Hinc Ⅱ. DNA fragments of 3390 bp and 2380 bp was amplified by using consensus primer dPsD1 and dPsD2 from the genomic DNA of each dermatophyte species separately. By combining the results of the two species-specific primer sets (PsT and PsME), all species of dermatophyte yielded unique sizes-set of PCR products expect for T. mentagrophytes and T. tonsurans.From the restriction profiles of Hine Ⅱ , 6 of the 7 dermatophytoses were diagnosed to species levelincluding T. mentagrophytes and T. tonsurans. By combining the results of the PCR and PCR-RFLP, the 7 common dermatophytes can be identified to species level. It is conclude that the multiplex PCR and PCR-RFLP identification targeting the DNA topoisomerase Ⅱ gene is rapid and efficient.     

Identification of Common Species of Dermatophytes by PCR-RFLP

To establish a simple, sensitive and effective technique for the identification of six common dermatopbytes, polymerase chain reaction （PCR） and PCR-restriction fragment length polymorpbism （RFLP） targeting Topoisomerase Ⅱ gene were used. The DNA of 6 common dermatopbytes was amplified by primer dPsD1 and then primers dPsD2. The products generated by dPsD2 were digested with restriction enzyme Hinc Ⅱ and Hinf Ⅰ separately. A DNA fragment of about 3390 bp was amplified by using primer dPsD1 from the genomic DNA of each dermatopbyte species. The product of dPsD2 was 2380 bp and the restriction profiles of Hinc Ⅱ and Hinf Ⅰ were between 58-1670 bp. By using PCR-RFLP, all of the 6 dermatopbytoses were diagnosed to species level and no obvious difference identification between Hinc Ⅱ and Hinf Ⅰ. It is concluded that the PCR-RFLP identification of dermatopbytes by Hinc Ⅱ or Hinf Ⅰ is efficient and rapid in clinical practice.     

Isolation of dermatophytes, Candida species and systemic fungi from dermatologic specimens in Montréal, 1963 to 1973.

Of 10 057 specimens of scrapings from skin, nails and scalp examined for dermatophytes, yeasts, pityriasis versicolor and systemic mycoses between 1963 and 1973, 30.4 percent were positive for fungi. Skin produced the highest proportion (68.6 percent) of positive scrapings, scalp the lowest (4.2 percent). Trichophyton rubrum was the predominant species (23.6 percent); of lesser prevalence were Microsporum canis (9.3 percent), T. mentagrophytes (8.4 percent) and Epidermophyton floccosum (4.8 percent). Double infections were encountered on 102 occasions; T. rubrum and Candida parapsilosis were the most frequent cohabiting species. The introduction in 1966 of periodic acid-Schiff staining for routine examination of scrapings resulted in better diagnostic results, particularly in the case of culturally nonproductive specimens and cases of pityriasis versicolor. Blastomyces dermatitidis and Cryptococcus neoformans were isolated from two patients in the course of routine investigation for dermatophytes.     

A contribution to the study of tinea capitis in Lusaka, Zambia

A study of tinea capitis in urban and rural schools of Lusaka revealed two dermatophytes, vis., Microsporum langeroni and Trichophyton violaceum as the causative agents of tinea capitis among school children. Tinea capitis was more common among boys (18.0%) than girls (14.7%), with prevalence of 16.8% and a peak infection at 9-11 years for both sexes. Clinically, most cases due to both M. langeroni and T. violaceum were non-inflammatory. The inflammatory cases were caused by T. violaceum. The higher number of infected children from squatter and low-cost areas was statistically highly significant compared to children from high-cost areas. A higher number of rural children were infected with tinea capitis than children in urban Lusaka. T. violaceum was the only dermatophyte species isolated in rural Lusaka, while in urban Lusaka, both T. violaceum and M. langeroni were isolated.     

应用人表皮角质层体外真菌培养法评价伊曲康唑的抗菌活性

目的　建立一种与体内环境相似的新模型,用以更好地评价和比较抗真菌药物的抗真菌活性。方法　将21名健康志愿者随机分为两组,第1组11例,口服伊曲康唑200mg,每日2次,用药1周;第2组10例,口服伊曲康唑200mg,每日1次,用药1周。两组对象于服药前、后1、4、7、10、14、21、28、35d分别制备皮肤角质层剥离条作为培养基,将红色毛癣菌、须癣毛癣菌和犬小孢子菌孢子的菌悬液接种于皮肤角质层剥离条的中央,培养1周,常规行PAS染色,采用角质层真菌定量生物分析法,并用计算机辅助图像分析测定被皮肤癣菌的菌丝所覆盖的面积。结果　3种皮肤癣菌在人体皮肤角质层剥离条上均可生长,服药前被菌丝覆盖的面积稠密,随着服药时间的延长,菌丝面积逐渐减少,即服用伊曲康唑后真菌的生长受到抑制,至服药第7天降至最低;服药第10天菌丝面积开始随时间的延长而增多,至第35天增至最多。两种剂量的伊曲康唑对3种皮肤癣菌均显示了明显的抗真菌活性,但两组间差异无统计学意义(P>0. 05)。结论　真菌在人体角质层剥离条上的生长环境与人体内环境相似,伊曲康唑在人体角质层显示了很高的抗皮肤癣菌的活性。角质层真菌定量生物学分析法是介于体外试验与体内疗效之间的一种新方法的有效尝试。     

PCR快速检测细菌16S rRNA基因的初步研究

目的：建立检测细菌16SrRNA基因的PCR方法。方法:以细菌16S rRNA基因为靶序列。利用计算机软件primer5．0，Bioedit设计2条引物-pml.,pm2并建立相应的PCR方法。采用该PCR方法扩增实验室保留菌株的16srRNA基因,以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV—DNA阳性血清以及白色念珠菌为对照。检测该实验方法的特异性;采用倍比稀释的方法进行该实验方法的敏感性实验。结果：用引物pml，pm2对17个不同菌株进行PCR扩增。均得到371bp左右长度的DNA片段。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明。用pml，pm2引物进行的PCR扩增可检测出20CFU／ml,结论：16S rRNA基因PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点。     

外耳道瘙痒症病原生物学的研究

为了查明外耳道瘙痒症病原体，采集患者外耳首分泌物，用直接镜检和人工培养的方法对其进行了人体蠕形螨和真菌病原体分离，结果证实人体蠕形螨和真菌为本病的主要病原体。其中人体蠕形螨包括毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨，真菌包括曲霉菌，青霉菌，皮肤丝状菌的小孢子菌，念珠菌和毛霉菌等。     

实验室消毒效果评价及细菌种群鉴定的研究

目的对某无菌实验室进行消毒效果检测,并进行细菌种属鉴定。方法按照《消毒与实验技术规范》和《消毒技术规范》进行消毒,随机引物PCR法进行阳性菌落种属鉴定。结果物体表面（90．90％）及压力蒸汽灭菌（100．00％）基本达到国家自然菌杀灭率标准,实验人员手（86．36％）、室内空气（76．47％）、使用过的消毒液（85．71％）未达标。随机引物PCR成功对阳性菌株进行了种属鉴定。结论改善实验室环境条件,严格操作程序可提升消毒效果。随机引物PCR法可有效应用于无菌环境的消毒效果评价。