转染血管内皮生长因子基因神经干细胞移植对大鼠脑缺血损伤的修复作用

目的 探讨转染血管内皮生长因子（VEGF）基因神经干细胞移植对大鼠脑缺血损伤的修复作用。方法 建立大鼠大脑中动脉梗塞（tMCAO）模型，将tMCAO模型随机分为对照组、注射磷酸盐缓冲液（PBS液）的PBS液对照组、接受神经干细胞（NSCs）移植的NSCs组、接受转染VEGF基因的NSCs移植的NSCs-VEGF组，采用立体定向法将相应移植物注射到tMCAO模型的右侧纹状体缺血半暗区。各组移植后2、4、6、8、10、12周进行神经功能损害程度（NSS）评分；移植后7d，采用免疫荧光染色法观察NSCs-VEGF组移植细胞的VEGF基因表达情况；12周时，采用免疫荧光染色法追踪NSCs-VEGF组移植细胞向神经元方向分化情况，并同时行各组移植区周围血管内皮细胞半定量计数。结果 移植后2～12周，NSCs-VEG组的NSS评分均低于其它3组，第12周时的NSS评分与其它3组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；移植后7d，NSCs-VEGF组的移植细胞从移植点向周围迁徙，部分表达VEGF基因；移植后12周，NSCs-VEGF组部分移植细胞分化成神经元，其移植区血管内皮细胞数显著高于其它3组（P〈0．05）。结论 转染VEGF基因的神经干细胞移植对脑缺血所致的损伤具有一定的修复作用。     

由脐血单个核细胞和富集的CD34+细胞扩增的造血干/祖细胞的生理功能比较

目的 探讨由脐血单个核细胞(MNC)和富集的CD34+细胞起始扩增所得的造血干/祖细胞在体内植入及造血重建的能力.方法 从人脐血中分离出MNC和CD34+细胞,在体外扩增7 d.将非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷型(NOD/SCID)小鼠分为四组,在接受亚致死剂量铯源照射后,进行细胞移植,实验A组接受由MNC培养得到的CD34+细胞和CD34-细胞;实验B组接受由富集的CD34+细胞培养得到的CD34+细胞和CD34-细胞;阳性对照组接受从脐血新鲜分离的CD34+细胞和CD34-细胞;阴性对照组不接受细胞移植,仅输注相同体积的IMDM培养基.6周后处死存活的小鼠,取其骨髓、脾脏和外周血细胞,分别进行细胞表型分析、集落和人特异性基因的检测.结果 经过体外扩增,以富集的CD34+细胞起始培养者的细胞总扩增倍数为39.8倍,远高于以MNC为起始细胞者的1.88倍.移植6周后,所有接受细胞移植的小鼠均存活,存活小鼠的骨髓和脾脏细胞中均能检测到人源细胞(CD45+细胞)及人源的各系血细胞,实验A组各类细胞的含量稍高于实验B组,且接受细胞移植小鼠的骨髓和脾脏细胞中可检测出人特异的Alu序列.结论 与从脐血中新鲜分离的细胞相比,扩增后的造血干/祖细胞的体内植入能力有所下降,以MNC起始扩增的造血干/祖细胞体内植入能力优于以富集的CD34+细胞起始扩增者,但二者体内造血重建能力的差异不显著.     

神经干细胞移植改善脑缺血大鼠的神经功能研究

目的 探讨大鼠神经干细胞移植改善脑缺血所致神经功能损伤的可行性。方法 制作大鼠大脑中动脉夹闭致脑缺血模型，记录并比较损伤和移植干细胞前后大鼠的神经功能。6周后杀死大鼠，研究干细胞在体内分化和迁移的情况。结果 接受干细胞移植大鼠神经功能的改善显著好于未移植干细胞的对照组。免疫组织化学方法证实移植后干细胞在脑内分化成胶质细胞和少量的神经细胞，并向损伤区域迁移。结论 神经干细胞体内外均具有多向分化潜能。神经干细胞移植能够有效改善脑缺血大鼠的神经功能。     

脐血间充质干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血的影响

目的　从人脐血中分离纯化间充质干细胞(MSC) ,观察其移植对大鼠大脑中动脉栓塞后神经功能恢复的影响及细胞的存活、迁移向神经细胞分化的情况。方法　雄性SD大鼠45只,用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,大鼠随机分为3组:MSC移植组、单核细胞组和生理盐水组。移植后1、7、14、2 1、2 8d采用改良神经功能损害评分(mNSS)观察大鼠神经功能恢复情况,应用免疫组织化学和免疫荧光双标记技术检测5溴 2脱氧尿核苷(BrdU )标记的MSC细胞的存活、迁移及其胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性核蛋白(NeuN)的表达。结果　人脐血MSC细胞移植可显著提高大鼠局灶性脑缺血后神经功能的恢复(P <0 .0 5 )。移植的MSC细胞可在大鼠脑组织中存活,并向缺血区域迁移,11.67%MSC细胞表达GFAP ,3 .72 %MSC细胞表达NeuN。结论　人脐血中含有MSC细胞并可促进局灶性脑缺血大鼠的神经功能恢复,移植细胞可在大鼠脑缺血区域中存活、迁移并向星形胶质细胞或神经元分化     

骨髓基质细胞移植对大鼠局灶性脑缺血区血运重建的作用

作为较理想的细胞移植治疗的种子细胞来源,骨髓基质细胞(BMSC)日益受到重视。有研究证实给大鼠心肌缺血区进行自体骨髓细胞移植能促进新生血管的形成。本研究初步观察了经颈动脉移植的BMSC在脑缺血区中的分布及对缺血区新生血管形成的影响。 一、材料与方法 1.复制局灶性脑缺血模型:雄性SD大鼠,体重250～300 g,参照文献[2]以线栓法复制局灶性脑缺血模型。 2.5-溴脱氧尿嘧陡(BrdU)标记的骨     

探讨CD34+CD44+细胞输入量对无关脐血移植后造血恢复的影响

目的　研究用无关脐血移植治疗儿童急性白血病时 ,CD3 4 CD44 细胞输入量对中性粒细胞和血小板恢复时间的影响。方法　用流式细胞术分析复苏后的CD3 4 CD44 细胞数 ,并对 18例儿童急性白血病患者在无关脐血移植后的中性粒细胞和血小板恢复时间等进行测定。结果　 18例患者中 ,CD3 4 CD44 细胞输入量为 (5.90～ 2 97.0 2 )× 10 4 /kg(中位数 54.11× 10 4 /kg)。移植后中性粒细胞 >0 .5× 10 9/L的时间为 11～ 2 3d(中位数为 17.5d) ,血小板 >2 0× 10 9/L的时间为 12～ 118d(中位数 41d)。中性粒细胞恢复时间与CD3 4 CD44 细胞输入量存在相关性 ,γ值为 -0 .657,P <0 .0 1;血小板恢复时间与CD3 4 CD44 细胞输入量也有相关性 ,γ值为 -0 .490 ,P <0 .0 5。结论　CD3 4 CD44 细胞输入量与无关脐血移植后的造血重建有关     

高压氧联合神经干细胞移植对局灶性脑缺血大鼠空间记忆功能的影响

目的探讨高压氧(HBO)联合侧脑室神经干细胞(NSCs)移植对大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠空间记忆功能的影响。方法清洁级雄性SD大鼠60只,随机分为五组:假手术组(Sham组)、MCAO组、HBO组、NSCs组和HBO+NSCs组。MCAO模型采用改进的Longa法制作。各组均行Morris水迷宫实验,测试结束后立即处死大鼠,检测各组大鼠海马乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性及脑源性神经营养因子(BDNF)与血管内皮生长因子(VEGF)含量。结果各组大鼠寻找平台的的平均潜伏期随训练时间的延长逐渐缩短。MCAO组平均潜伏期显著长于其它四组(P<0.05)。HBO+NSCs组潜伏期明显短于HBO组和NSCs组(P<0.05)。HBO+NSCs组和Sham组潜伏期差异无统计学意义。MCAO组ChAT活性、VEGF和BDNF含量明显低于其它四组(P<0.05),而HBO+NSCs组明显高于HBO组和NSCs组(P<0.05)。结论 HBO联合NSCs移植更好地改善了局灶性脑缺血-再灌注大鼠记忆功能,这可能与促进海马ChAT活力及BDNF与VEGF的表达有关。     

含高剂量CD34^＋细胞的非血缘脐血移植治疗AML/MDS后原发植入失败

目的分析含高剂量CD34^＋细胞的非血缘脐血移植治疗急性粒细胞白血病合并骨髓增生综合征（AML/MDS）后发生原发植入失败的原因。方法 1例4岁女孩在四川大学华西第二医院儿科血液肿瘤科被诊断为AML/MDS。患儿经诱导及巩固治疗获完全缓解后,行无血缘人类白细胞抗原（HLA）部分不相合脐血移植。观察患儿术后造血重建及移植相关并发症情况。结果患儿术后发生原发植入失败,再次进行血缘间的半相合造血干细胞移植,期间患多药耐药鲍曼不动杆菌败血症,于第2次移植后7 d死于呼吸衰竭。结论含高剂量CD34^＋细胞脐血造血干细胞并不能抵消HLA配型不合的缺陷。患儿原发植入失败可能与患儿移植前存在长期血小板输注无效及潜在免疫异常,尤其是移植前产生抗-HLA供者特异性抗体有关。     

骨髓间充质干细胞移植促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响极其可能机制.方法 采集SD大鼠骨髓,分离出MSCs,并培养、纯化,取传至第6代的MSCs,移植前1 d以5溴2脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记,然后用显微注射器将其缓慢注射到脊髓损伤大鼠模型(成年SD大鼠)的受损脊髓中心,以不进行移植的脊髓损伤大鼠模型(损伤组)和假手术组为对照.术后进行运动功能评分以判断神经功能恢复情况,并切取移植区域脊髓组织,应用荧光免疫化学染色检测脊髓损伤灶边周的神经元凋亡情况(TUNEI.与NeuN双标记)以及移植的MSCs的分布和向神经元分化情况(Brdu与NeuN双标记),应用逆转录聚合酶链反应检测损伤灶区域脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA的表达.结果 移植后第3天开始,损伤组和移植组大鼠的BBB运动功能评分明显上升,第14天后进入平台期,但移植组各时间点的.BBB运动功能评分均明显高于损伤组(P<0.05).移植后3 d,在移植组的脊髓组织中可见Brdu标记阳性细胞,少部分Brdu标记阳性细胞同时表达神经元特异性标志物NeuN;移植后第3、7天,损伤组和移植组脊髓组织中的凋亡神经元均显著多于假手术组(P<0.01),凋亡的神经元多存在于损伤周边区,但移植组的凋亡神经元显著少于损伤组(P<0.01);移植后第3、7天,假手术组未检测到BDNF mRNA的表达,损伤组和移植组均可检测到BDNF mRNA的表达,移植组的表达量分别较损伤组高28.6%和39.2%(P<0.05).结论 移植的骨髓MSCs可促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,其机制除MSCs直接分化为神经元进行修复外,还可能与其改善脊髓损伤区的微环境、上调BDNF、mRNA表达、减少神经细胞凋亡有关.     

人血管内皮细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞对脂肪颗粒移植存活率的影响

目的 检测大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)经人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染后,对脂肪颗粒移植存活率的影响.方法　利用FuGENE HD介导VEGF165基因体外转染SD大鼠BMSCs,与取自SD大鼠的脂肪组织混合后移植于大鼠背部,类似方法设立未转染组及DMEM液空白对照组.检测脂肪组织存活率及再生血管密度.结果　转染组存在外源性基因和蛋白的表达,脂肪组织存活率及再生血管密度高于未转染组,且两者均高于对照组.结论　转染VEGF165基因的BMSCs具有更强的促血管再生作用,可提高游离移植脂肪的存活率.     

骨髓间充质干细胞减轻体外扩增的脐血造血干细胞衰老的作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血造血干细胞体外扩增及抗细胞衰老的作用.方法 从新鲜脐血中分离出CD34+细胞,分别接种在含或不含MSC及细胞因子的培养体系中,取培养10d后的造血干细胞,分别用于细胞计数,集落分析,流式细胞仪检测表面标记,并对培养后的细胞进行β-半乳糖苷酶活性检测,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测衰老相关基因p16INK4amRNA的表达.结果 体外培养10d后,MSC组、细胞因子组及MSC+细胞因子组对脐血总有核细胞(TNC)、CD34+细胞的体外扩增及克隆形成能力均有支持作用,以MSC+细胞因子组最为明显(P＜0.05),其扩增倍数分别达到(45.3±6.8)倍、(38.4±5.8)倍及(50.2±4.2)倍,但衰老细胞比例及p16INK4amRNA表达倍数则以MSC组最低,MSC+细胞因子组次之,细胞因子组两项指标均为最高(P＜0.05).结论 MSC能更好保护体外扩增的脐血造血干细胞,减少细胞衰老的发生,MSC+细胞因子是有效扩增脐血造血干细胞并保持细胞干性的更理想方法.     

Transplantation of human CD34+ stem cells from umbilical cord blood to rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis

BACKGROUND: Liver fibrosis results from accumulation of extracellular matrix components and is associated with many chronic hepatic diseases. There is to date no specific therapy for this disease, and patients receive treatment for its associated complications. Specific progenitor cells, known as oval cells, are present in the liver. As oval cells express markers such as CD34, they are thought to arise from a hematopoietic precursor. The aim of this work was to investigate whether transplantation of hematopoietic CD34(+) stem cells could improve hepatic fibrosis by their differentiation into hepatocytes. METHODS: CD34(+) stem cells from human umbilical cord blood were purified, transduced with a lentiviral vector containing the green fluorescent protein (GFP) gene and injected via portal vein into rats with liver cirrhosis induced by the 4-month administration of thioacetamide. Rats were killed 15 and 60 days post-transplantation. RESULTS: Up to 37% and 22% fluorescent cells were observed in the blood of control and cirrhotic rats, respectively, at 15 days post-transplantation. At 60 days post-transplantation, however, fluorescent cells were completely absent from the blood. Fluorescence was not detected in liver sections at either 15 or 60 days post-transplantation. Polymerase chain-reaction study to detect the GFP gene ruled out silencing of the transgene. CONCLUSIONS: These results suggest that the transplanted cells did not engraft in the liver and were eliminated from the rats.     

非清髓性无关供者脐血移植与同胞供者骨髓移植治疗再生障碍性贫血的比较

目的 对非清髓性无关供者脐血移植与同胞供者骨髓移植治疗重型再生障碍性贫血(SAA)的临床效果进行评价和比较.方法 回顾性分析15例SAA患者进行非清髓性造血干细胞移植的临床资料,根据造血干细胞(HSC)来源的不同,将患者分为骨髓移植组(BMT组;6例)和脐血移植组(UCBT组;9例).对两组患者术后的外周血象、骨髓象、细胞嵌合体状态、移植物抗宿主病(GVHD)以及存活率等长期随访结果进行了统计学分析.结果 BMT组和UCBT组造血干细胞植入率分别为100%和66.7%,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).UCBT组移植后大多数形成了供、受者型细胞混合嵌合体,BMT组大多数形成了供者型完全嵌合体.BMT组血象恢复正常的中位时间为25 d、UCBT组为120 d,BMT组骨髓象恢复正常的中位时间为25 d,UCBT组为150 d.BMT组慢性GVHD的表现以肝功能异常为主,而UCBT组则以皮疹为主.UCBT组术后早期感染率为33.3%,BMT组为16.7%.结论 非清髓性无关供者脐血移植和同胞供者骨髓移植均可成功治疗SAA;但与BMT比较,UCBT的造血功能恢复较慢、血型转变少而延迟、早期感染率较高、而慢性GVHD的程度却较轻.     

人脐血单个核细胞体外扩增后植入NOD/SCID小鼠重建多系造血

目的探讨人脐血单个核细胞（MNC）体外扩增后植入能力的改变，以及对NOD／SCID小鼠造血重建的影响。方法采用不同细胞因子组合对人脐血MNC进行短期无血清培养扩增，比较扩增后的效果及细胞凋亡的变化；将扩增6d后的人脐血MNC植入经半致死剂量照射的NOD／SCID小鼠体内，观察小鼠6周后的存活率和造血重建情况。结果人脐血MNC在干细胞因子（SCF）、酪氨酸激酶受体3配基（FL）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素3（IL-3）细胞因子共同作用下，培养6～11）d获得最佳扩增效果，同时细胞表面膜联蛋白V（Annxin V）的表达明显减少；移植6周后有55．6％的小鼠存活，存活小鼠的骨髓、脾和胸腺细胞中均能检测出人类CD45、CD34、CD33、CD3和CDl9抗原，外周血提取的DNA可检测出人特异的Cart—Ⅰ基因和Alu基因。结论SCF＋FL＋IL-6＋IL-3细胞因子协同作用能有效扩增人脐血MNC，MNC扩增6d后可成功植入N（）D／SCID小鼠体内，并帮助小鼠重建多系造血。     

人脐血单个核细胞联合雪旺细胞修复脊髓损伤的实验研究

目的 探讨人脐血单个核细胞(haman cord blood mononuclear cells,HCMNCs)与大鼠雪旺细胞(Schwann cells,SCs)联合移植应用于大鼠脊髓损伤的疗效.方法 健康成年8周龄Wistar雌性大鼠40只,体重(200±30)g.利用Impactor Model Ⅱ型打击器制成T10脊髓损伤模型.40只大鼠随机分成4组,每组10只,即DMEM实验对照组、HCMNCs移植组、SCs移植组、HCMNCs+SCs联合移植组.用HE染色、顺行示踪染色及电镜观察脊髓损伤处轴突再生情况,对各组实验动物脊髓损伤后肢体功能的恢复情况进行行为学评分(BBB评分)及脚印分析实验,综合评估脊髓功能恢复程度.结果 HCMNCs+SCs联合移植治疗能够明显促进神经再生,改善功能,减少空洞形成.BBB评分和脚印分析实验显示各组疗效比较,差异有统计学意义.组织学和电镜观察神经轴突再生情况与功能学检查的结果 相吻合.结论 以分泌各种神经营养因子为特点的SCs为平台,联合移植后诱导HCMNCs向神经元及神经胶质细胞分化,可促进脊髓损伤的恢复.     

人脐血细胞体外扩增的实验研究和意义

目的：了解脐血造血干细胞在体外扩增培养过程中的生长分化特点,探讨脐血干细胞与体外扩增后的祖细胞混合移植的可行性以及合适的移植时机。方法：按种脐血单个核细胞（MNC）于含体积浓度为20％胎牛血清（FCS）的IMDM悬浮培养体系中,加入干细胞因子（SCF）、Flt-3配基（FL）、粒－单细胞集落刺激因子（GM－CSF）、白细胞介素－3（IL－3）、白细胞介素－6（IL－6） ,培养21d,每周半量换液,同时进行细胞计数,涂片形态学观察,粒－单系祖细胞（CFU－GM）、红细祖细胞（BFU－E）集落培养,细胞表面CD34^ 、CD33^ 、CD3^＋、CD19^＋标记和细胞增周期的动态观察。结果 培养7d时的脐血细胞,CFU－GM、BFU－E集落形成最多,之后逐渐减少,21d时已低于培养前水平。CD34^ 细胞比例在培养后7d达高峰,14d开始下降;CD33^＋细胞比例在培养后7－14d达高峰,21d时开始下降;CD3^ 、C CD19^ 细胞比例均在培养第7d时显著下降,并持续低水平至21d。培养7d后G0期细胞比例明显减少,S期细胞快速增高,至21d时仍有较高比例。培养第21d的细胞涂片见少量中、晚幼粒细胞。结论：理论上脐血干细胞与扩增后的祖细胞混合移植用于成人具有可行性,体外扩增培养7d左右是混合移植的最佳时机。     

非血缘脐血造血干细胞移植治疗恶性血液病50例临床观察

目的 回顾性分析非血缘脐血移植(UCBT)治疗恶性血液病患者的植入、移植相关并发症及存活情况.方法 2000年4月至2009年8月,单中心进行UCBT治疗恶性血液病患者50例,其中高危难治性患者39例(78%),中位年龄19岁(3～48岁),中位体重53 kg(15～76 kg).进行单份脐血移植24例,双份脐血移植26例.移植前采用清髓性预处理方案45例,减低强度预处理方案5例.采用环孢素A(CsA)联合吗替麦考酚酯(MMF)预防移植物抗宿主病(GVHD).结果 全部受者按自身的体重计算,输注的脐血总有核细胞数(TNC)中位值为4.0(1.95～16.24)×10~7/kg,其中CD34~+细胞数为2.74(0.67～29.28)×10~5/kg.50例受者中,除1例移植后16 d死亡外,可评估的49例中有42例获得稳定造血功能重建,植入率为86%.中性粒细胞绝对计数(ANC)≥0.5×10~9/L和血小板≥20×10~9/L的中位时间分别为移植后19 d和34 d,移植后42 d时,中性粒细胞恢复率为86.3%(95%可信区间为0.769～0.957).移植后120 d时,血小板恢复率为72.3%(95%可信区间为0.620～0.821).在42例植入的受者中,发生急性GVHD 20例,其中Ⅲ～Ⅳ度3例(发生率为7.1%).移植后2年时,慢性GVHD发生率为17.4%.中位随访时间22个月(4～116个月),移植后180 d时的总存活率为66.2%(95%可信区间为0.590～0.734),1年时的总存活率为57.4%(95%可信区间为0.496～0.652),2年时的总存活率为54.2%(95%可信区间为0.462～0.622).非疾病进展期行移植的受者,180 d时的总存活率为73.2%(95%可信区间为0.659～0.805),1年时的总存活率为66.1%(95%可信区间为0.579～0.743),2年时的总存活率为62.2%(95%可信区间为0.542～0.682).移植后原发病复发5例,2年累计复发率为16.2%(95%可信区间为0.099～0.225).移植后死亡21例,感染为主要死亡原因.结论 UCBT治疗恶性血液病是安全和有效的.