M2抗体人源靶抗原三联体的克隆表达及其在原发性胆汁性肝硬化中的应用

目的 设计克隆表达抗原蛋白三联体BPO，利用纯化的重组BPO，建立原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)特异性免疫学诊断方法。方法 利用基因工程方法克隆表达M2抗原及其三联体BP0，并加以鉴定。纯化BPO，建立ELISA法。应用ELISA法检测17例PBC患血清M2抗体，以167例非PBC患和1225例健康人作对照。结果 17例临床诊断为PBC的患，M2抗体均为阳性，而对照组M2抗体均为阴性。结论 本法检测M2抗体有较好的敏感性及特异性，为PBC的临床诊断提供了有效手段。     

自身抗原OGDC-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定

目的 基因工程重组表达2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2（OGDC-E2）融合蛋白。方法 用PCR方法扩增得到OGDC-E2的基因片段，插入表达载体pET28a（＋），构建重组表达载体pET28a（＋）-OGDC-E2，测序正确后在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。结果 获得OGDC-E2融合蛋白，经SDS-PAGE分析，相对分子质量与预期大小一致；经免疫学鉴定，重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型（AMA-M2）的免疫原性。结论 基因重组表达的融合蛋白将有利于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的实验诊断。     

M2抗体重组人源靶抗原二联体在原发性胆汁性肝硬化患者中的检测及应用

目的 利用重组抗原BCOADA-E2和PDC-E2的二联体（BP），检测PBC患者血清中的M2抗体并探讨其临床意义。方法 经Ni—NTA亲和柱纯化重组表达的BP融合蛋白，分别建立免疫印迹法（IBT）和酶链免疫吸附（ELISA）法检测60份PBC患者血清，以60份其他肝病患者、60份自身免疫病患者、80例正常人血清为对照组。结果 经常规试剂盒检测为M2（＋）的60份患者血清，利用重组抗原检测阳性53例，阴性7例，阳性率为88．3％；经常规试剂盒检测为M2（-）的60份自身免疫病患者血清、60份其他肝病患者和80例正常人血清，利用重组抗原检测为M2（-）。结论 利用重组抗原BP检测M2抗体敏感性较高。对临床辅助诊断PBC提供一定的手段。     

自身抗原gp210融合蛋白的重组表达及其临床应用研究

目的 重组表达人核包膜蛋白自身抗原gp210融合蛋白,以用于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的临床诊断和病情监测。方法 针对基因库中人gp210的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体PET28a（＋）,构建重组表达载体PET28a（＋）-gp210,转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达蛋白质,并经SDS-PAGE、Western-blot鉴定重组表达的gp210融合蛋白,进一步经Ni2＋亲合层析柱纯化。应用重组gp210融合蛋白建立间接ELISA,检测PBC患者血清中的抗gp210抗体。结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PET28a（＋）-gp210重组质粒。经SDS-PAGE、Western-blot鉴定,获得了具有免疫原性的重组gp210融合蛋白。经ELISA检测,PBC患者中抗gp210抗体的阳性率为40.5%,与疾病对照组及正常对照组比较有显著性差异（P〈0.05）。PBC患者临床资料分析表明,抗gp210阳性患者中IgM浓度显著高于抗gp210阴性患者;经UDCA治疗后,28位PBC患者中,3例抗gp210抗体由阳性转为阴性,9例抗gp210抗体持续阳性,1例抗gp210抗体由阴性转为阳性,16例抗gp210抗体持续阴性;其他临床症状与抗gp210抗体无显著相关。结论 应用重组gp210融合蛋白建立ELISA检测自身抗体,对PBC诊断具有较好的特异性,为PBC的临床诊断和病情监测提供了有力依据。     

人ICA69基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达与应用初探

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达国人胰岛细胞自身抗原69kd蛋白（hICA69)，获得足量的、可供实验研究的ICA69抗原，用于I型糖尿病的早期诊断和联合筛查。方法：用PCR法扩增出编码hICA69的cDNA片段，直接克降到pSPORT1质粒上，经DNA序列测定后，再插入到GST融合蛋白表达载体pGEX-2T的EcoRI和SmaI位点之间，构成重组质粒p25-hICA69,将此质粒导入大肠杆菌，经IPIG诱导后获得GST-hICA69融合蛋白的表达产物，用间接ELISA法检测100例正常人和30例I型糖尿病人血清中抗ICA69抗体。结果：所获PCR产物经序列分析确证为1449bp，编码483个氨基酸，并正确地重组到pGEX-2T表达型质粒中，其在原核细胞中表达的融合蛋白具有免疫原性，并能应用于I型糖尿病病人血清中抗ICA69抗体的检测。结论：运用基因工程技术获得的表达产物的重组ICA69抗原。这一抗原的获得，将有助于提高I型糖尿病的预报率和确诊率。     

巨细胞病毒pp150和gp52融合基因的克隆表达及重组蛋白的抗原性研究

人巨细胞病毒（HCMV）是一广泛传播的人类致病原.我们采用聚合酶链反应（PCR）技术分别扩增了gp52蛋白包含IgM抗原决定簇的基因片段和 pp150蛋白C端包含IgM抗原决定簇的基因片段,然后将 gp52和pp150 两个基因片段串联克隆至pGEX-5x-3表达载体,成功构建了高效表达融合基因的重组载体,并对表达产物的抗原性进行了鉴定.     

人骨保护素-分枝杆菌热休克蛋白70融合蛋白的克隆与表达及其活性鉴定

目的:为解决类风湿性关节炎中骨破坏及炎症损伤两大难题,拟克隆入骨保护素功能区与分枝杆菌热休克蛋白70肽段融合基因,进一步观察其在大肠杆菌中的表达并鉴定活性.方法:实验于2006-05/2007-09在首都医科大学免疫学系实验室完成.采用反转录-聚合酶链反应技术从人骨肉瘤细胞系MG63总RNA中扩增骨保护素成熟肽段编码区基因,构建pGEM-TEasy-骨保护素重组质粒.以此为模板,聚合酶链反应扩增骨保护索-热休克蛋白70功能区DNA,构建重组表达载体pET-28a-骨保护素-热休克蛋白70,将其转化E.coli.BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷诱导后收集菌体蛋白,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白免疫印迹鉴定该融合蛋白的表达,以破骨细胞生长抑制实验及抑炎实验检测该融合蛋白的生物学活性.结果:①实验最终获得人骨保护素全长基因片段,人骨保护素-热休克蛋白70功能区DNA片段已被正确插入到pET-28a载体中,转化菌株可表达人骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白.②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示约在Mr22000处有蛋白的超表达,而未诱导菌株未发现有此条带.③蛋白免疫印迹检测表明,融合蛋白能与抗人骨保护素单克隆抗体特异性结合.④破骨细胞生长抑制实验表明,该融合蛋白能够减少破骨细胞的生成数量,具有体外抑制骨破坏的生物活性.⑤抑炎实验表明,融合蛋白具有显著减轻迟发型超敏反应小鼠模型炎症反应程度的作用,说明融合蛋白中热休克蛋白70具有抑制炎症的生物学活性.结论:在E.coli.BL21(DE3)中表达了骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白,体外功能实验证实该融合蛋白具有一定的生物学活性.     

增强型绿色荧光蛋白基因与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1-3区域融合表达载体的构建

目的构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1—3区域（KDRn3）的融合基因真核表达载体，为研究KDRn3在抑制视网膜新生血管性疾病中的作用奠定基础。方法以质粒pcDNA3．1／KDRn3为模板，PCR扩增KDRn3基因，将目的片段克隆至pMD18-T载体，其产物双酶切后连接到质粒pEGFP-N1。结果酶切及琼脂糖电泳分析表明提取及纯化的重组质粒含有目的基因片段，大小正确。结论成功构建了EGFP与人KDRn3的融合基因真核表达载体pEGFP-N1／KDRn3。     

含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2表达载体的构建

目的:骨形态发生蛋白2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白之一.实验拟构建绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(human Bone Morphogenetic Protein-2,hBMP2)真核表达载体,为在真核细胞的高效表达和基因治疗打下基础.方法:实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室完成.①实验材料:含完整人骨形态发生蛋白2基因片段的pcDNA3.1/CT-hBMP2质粒由李曦铭博士惠赠;双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS(Invivogen公司),Zeo(Invivogen公司):pTA2R-T Easy(鼎国生物技术有限公司).②实验过程及评估:以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用聚合酶链反应方法亚克隆出人骨形态发生蛋白2目的片段,将该片段分别与克隆载体pTA2-T-easy和双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的蘑组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2,并进行测序鉴定.结果:①聚合酶链反应获得长度约1 216 bp的目的片段,与预期片段相符.②经与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank检索的骨形态发生蛋白2cDNA序列(NM-001200)100%匹配.结论:成功构建含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2真核表达载体.     

EB病毒BMRF1基因原核表达载体的构建

目的克隆EB病毒早期蛋白P54的编码基因BMRF1，构建原核表达载体，为相应蛋白的表达和应用奠定基础。方法以含EB病毒的B95-8细胞培养上清为模板，PER扩增出BMRF1基因。PER产物经BamH I和Xho I双酶切后克隆至原核表达载体pGEX-5T，用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果PER扩增的特异性片段长度为1233bp，以此构建的重组质粒pGEX-5T-BMRF1双酶切的片段大小与预期符合，重组克隆外源基因的测序结果与GenBank中的EB病毒BMRF1基因eDNA序列一致。结论成功构建了pGEX-5T-BMRF1原核表达载体。     

大鼠凝血因子Ⅶ EGFP-EGF1融合蛋白的表达及其结合功能初步研究

本研究通过融合蛋白EGFP-EGF1的表达,探讨大鼠凝血因子Ⅶ上EGF1片段与组织因子（TF）的结合功能。用RT-PCR方法自大鼠肝脏组织获得EGF1编码区基因并将其插入EGFP原核表达载体中,构建pET28a-EGFP-EGF1融合蛋白表达载体;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达EGFP-EGF1融合蛋白;采用亲和层析方法Ni柱纯化融合蛋白,将融合蛋白作用于经脂多糖刺激表达TF的大鼠血管内皮细胞;通过荧光显微镜及流式细胞术观察和检测融合蛋白与细胞结合情况。结果表明：EGFP-EGF1在转化的大肠杆菌中获得高效表达并成功纯化,SDS-PAGE证实分子量约为36kD。荧光显微镜及流式细胞术检测显示该融合蛋白能与内皮细胞膜上的TF结合。结论：大鼠凝血因子Ⅶ上EGF1区可介导FⅦ与TF特异性结合,从而可能为分子靶向抗栓治疗研究提供部分基础。     

人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性

人干细胞生长因子（human stem cell growth factor，hSCGF）是一种早期造血调控因子。已知人干细胞生长因子具有两种形式，包括全长分子hSCGF以及在Ca^2＋依赖糖识别结构域（calcium-dependent carbohydrate recognition domain，CRD）内缺失78氨基酸的截短型分子hSCGFβ。hSCGFβ的造血刺激活性具有严格的种属特异性。本研究目的在于探讨hSCGF能否协同刺激小鼠彬单系祖细胞增殖。为克服hSCGF的cDNAGC含量较高的困难，本研究以两步PCR的方法从人胎肝cDNA文库（Clontech）中成功克隆hSCGFcDNA，进而将hSCGF成熟肽编码序列亚克隆于原核表达载体pGEX4T-2中，融合表达。研究结果表明，通过低温诱导（28℃）。重组表达产物主要以可溶蛋白的形式存在于裂解上清中，利用亲和层析纯化融合表达蛋白。对重组蛋白的造血刺激活性分析表明，不同于截短型分子hSCGFβ。全长分子hSCGF能够刺激小鼠骨髓彬单系造血祖细胞增殖。结论：hSCGFCRD不直接结合受体。可能具有其他生物学功能。     

梅毒螺旋体嵌合抗原的重组克隆与表达

目的 连接梅毒螺旋体特异抗原TpN17和TpN15的基因，克隆并表达此嵌合抗原。方法 PCR分别克隆TpN17和TpN15的基因，利用T4 DNA连接酶将二者连接在一起并插入到pRSET B质粒中，在BL21(DE3)菌株中用IPTG诱导表达。结果 连接的TpN17—15基因，测序结果与GenBank数据吻合。结论 SDS—PAGE电泳中显示表达的目的蛋白与预期的蛋白分子量一致。     

三元复合因子Net基因的克隆及其真核表达

目的克隆人Net基因,构建Net基因表达载体并诱导融合蛋白表达。方法从正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中抽提总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出人全长Net cDNA,构建pEGFP-N1/Net重组体质粒,并将其转染入高表达原癌基因c-fos的人胰腺癌细胞PANC-1中,分析转染细胞的Net表达水平和对细胞增殖力的影响。结果从人胰腺癌细胞PANC-1中克隆出长约1 224 bp的Net基因目的片段,成功构建了重组质粒pEGFP-N1/Net,诱导表达目的蛋白后,Net抑制原癌基因c-fos的表达,进而抑制人胰腺癌细胞的增殖。结论构建重组质粒pEGFP-N1/Net并表达Net融合蛋白,其抑制了细胞的增殖,为进一步研究Net的各种生物学活性及作用机制奠定了基础。     

Id3-EGFP融合基因表达载体的构建及其在人肺癌细胞A549中的表达

目的构建人分化抑制因子3（Id3）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合基因表达载体pEGFP／Id3，使Id3-EGFP融合蛋白在人肺癌细胞A549中得到表达。方法扩增并克隆人Id3 cDNA，构建Id3和EGFP的融合基因表达载体pEGFP／Id3。用脂质体转染技术将pEGFP／Id3导入A549细胞，使Id3-EGFP融合蛋白在A549细胞得到表达。结果经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实，Id3基因已正确插入pEGFP-N1中EGFP基因的上游，获得融合基因表达载体pEGFP／Id3。利用脂质体转染技术将pEGFP和pEGFP／Id3转入A549细胞，24h后，在激光共聚焦荧光显微镜下可观察到表达EGFP的细胞发出绿色荧光，流式细胞术分析表明，转染48h时EGFP阳性表达细胞率最高，分别可达65．40％和60．50％。pEGFP／Id3转染的A549细胞S期细胞和G2期细胞比例均明显高于pEGFP转染细胞组和未转染细胞组，表明Id3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展，从而促进细胞增殖。结论真核表达载体pEGFP／Id3的成功构建及其在A549细胞中的表达，为研究Id3的细胞定位表达及Id3在细胞生长调控中的作用奠定了实验基础。     

汉滩病毒重组核蛋白的克隆构建和活性初探

目的制备新型高效的基因工程重组抗原,用于汉滩病毒的快速诊断和分型诊断。方法聚合酶链反应（PCR）扩增得到汉滩病毒S基因的截短片段,将该片段克隆入原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达,将包涵体进行胶上回收,Western blotting分析其抗原性。结果纯化得到相对分子质量约为46×10^3的重组蛋白,可与肾病综合征出血热（HFRS）阳性血清发生反应,健康人血清为阴性对照。结论研究得到的重组核蛋白在HFRS的血清学诊断中具有一定的应用价值。     

人KIAA1199蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定

目的 KIAA1199是一种功能未知的胞浆蛋白,通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础。方法采用PCR技术扩增出目的基因,将其克隆到pMAL-C2X和pGEX-5X-1原核表达载体中。经IPTG诱导后,重组质粒pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KIAA1199,分别表达含麦芽糖结合蛋白(MBP)的MBP-KIAA1199融合蛋白和含重组谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白GST-KIAA1199。其中,MBP-KIAA1199融合蛋白经纯化后,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;GST-KIAA1199融合蛋白用于检测抗体特异性。此后应用ELISA及Westernblot方法鉴定该抗体。结果 pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KI-AA1199两个重组质粒构建成功,并获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论成功制备了KIAA1199抗体,为进一步研究基因功能奠定了基础。     

AML1-ETO融合蛋白对BCL-2基因表达的影响

本研究旨在观察AML1-ETO在白血病细胞中对于抗凋亡基因日乳-2表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937-WT、U937-Mock和经AML1-ETO基因转染的U937-A／E1-4的细胞凋亡率;使用免疫印迹法检测cleavedcaspase-3蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测转染细胞和对照组细胞以及AMLM2患者白血病细胞BCL-2mRNA的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与BCL-2基因启动子之间直接的相互作用情况。结果表明：AML1-ETO转染细胞的凋亡率明显增加,且检测到cleavedcaspase-3蛋白的表达;转染了AML1—ETO 的U937细胞系和具有AML1—ETO融合基因的AML-M2患者中,BCL-2的mRNA表达水平显著下调;转染细胞沉淀富集的AML1-ETO直接结合的DNA中含有BCL-2基因的启动子序列。结论：BCL-2是AML-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调BCL-2的表达。