实时定量聚合酶链反应检测微小残留白血病的临床研究

目的 探讨并研究实时定量聚合酶链反应(RQ—PCR)技术定量检测小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留病(MRD)的临床适用性和临床价值。方法 以免疫球蛋白重链(IgH)基因重排作为ALL的肿瘤标志,应用RQ—PCR、胚系探针策略,定量检测了34例B细胞ALL(B—ALL)患儿的MRD,并对其中的16例患儿进行了缓解期MRD的定量动态追踪观察。结果在34例B—ALL患儿的初治标本中IgH基因单克隆重排16例,对16例单克隆IgH重排靶基因进行序列分析发现,V片段使用最频繁的是V3家族,J片段使用最频繁的是J4和J6。在16个靶基因中,RQ—PCR的检测敏感度有9例为10-4,6例为10-5,1例为10-3,非特异性扩增见于6例患儿。16例初治患儿的标准曲线相关系数均为0.99以上,斜率均值为-3.34±0.37,截距均值为24.30±2.95。对16例患儿随访期样本的MRD动态追踪研究发现,复发患儿的MRD水平较高且复发前有动态增加。诱导化疗结束时的MRD水平与ALL高危因素无明显相关性(P>0.05)。结论 研究表明,RQ—PCR技术胚系探针策略检测ALL患儿的MRD具有临床适用性,随访期标本MRD的定量检测及动态追踪监测具有临床价值。     

β整合素家族在儿童急性T淋巴细胞白血病的表达及其临床意义

目的探讨β整合素家族成员在儿童急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)的表达及临床意义。方法收集22例初诊T-ALL患儿和21例对照(非恶性血液病患者和骨髓移植供者)的骨髓标本,采用实时荧光定量PCR方法,检测β整合素家族各成员的m RNA表达;并利用整合素抑制剂精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽作用于Jurkat细胞,采用CCK 8法和流式细胞术检测Jurkat细胞生存率和凋亡情况。结果与对照组相比,T-ALL患儿的整合素β_2、β_3、β_5的m RNA表达水平显著下调(P0.05)。在外周血白细胞计数100×10~9/L、第33天骨髓不缓解或MRD阳性的T-ALL患儿中,整合素β_3表达水平较高(P0.05);复发T-ALL患儿整合素β_5的表达高于无复发T-ALL患儿(P0.05)。整合素β3高表达T-ALL患儿的EFS率、OS率均低于β_3低表达者(P0.05)。与未处理组比较,RGD肽处理的Jurkat细胞生存率较低、凋亡率均高(P0.05)。结论β整合素可能通过影响细胞的增殖和凋亡而影响T-ALL的发生发展,整合素β_5的表达与T-ALL复发风险密切相关,整合素β_3的表达与T-ALL患儿治疗反应及预后密切相关。     

急性T淋巴细胞白血病微小残留病实时荧光定量聚合酶链反应检测的意义

目的　研究采用实时荧光定量聚合酶链反应 (RQ-PCR)技术检测具有tal-1缺失的急性T淋巴细胞白血病(T ALL)患儿骨髓微小残留病 (MRD)水平的可行性,并探讨不同时间点MRD水平在预后和临床治疗干预上的意义。方法　采用最常见的tal 1缺失断裂点sildb1-tal1db1,对 50例T-ALL患儿初治标本进行阳性筛选;应用RQ-PCR技术检测所有阳性患儿初治标本的敏感度,并对这些患儿化疗达完全缓解(CR)及其后不同时间点的骨髓标本进行MRD定量检测,并以极限稀释法检测结果进行比较;对上述两种方法分别检测出的结果进行相关回归分析。结果　 ( 1 )在 50例T-ALL患儿中,共检测出 10例阳性患儿; (2)采用RQ-PCR技术和极限稀释法分别检测患儿CR期及其后各个时间点的 28份标本,有 24份标本两种方法检测结果均大于 10-5,两种方法检测结果的相关性很好(r=0 898,P<0.001); (3)在规律治疗的 8例患儿中,CR时骨髓MRD水平高于 10-4的 3例患儿皆在化疗过程中复发,而低于 10-4的 5例一直未复发。结论　RQ-PCR技术是一项特异性强,重现性好、精确快速的MRD定量检测手段。不同时间点的MRD水平升高对预后的意义不同,对及时调整治疗方案、改善预后有重要价值。     

Ig/TCR基因重排在儿童急性T淋巴细胞白血病中的表达模式特点

目的 探讨免疫球蛋白(Ig)/ T细胞受体(TCR)基因重排在儿童急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)中的表达模式特点及其与临床生物学特征的相关性。方法 回顾性纳入首都医科大学附属北京儿童医院(我院)2005年1月1日至2008年12月31日收治的初治T-ALL患儿,分析其初诊时骨髓单个核细胞的Ig/TCR基因重排情况,根据重排情况分为阳性组和阴性组,比较不同组别的临床生物学特征。结果 ①52例儿童T-ALL中男37例(71.2%),入院时中位年龄8.0(1.8~16.0)岁,初诊时WBC中位数为140.5(2.7~667.1)×10⁹·L^-1,中危38例(73.1%)、高危14例(26.9%)。中位随访时间136.3(1.2~171.7)个月,长期完全缓解38例(73.1%)、复发10例(19.2%),其他原因死亡4例(7.7%)。②TCRB、TCRG、TCRD和IgH克隆性基因重排的发生率分别为85%、85%、38%和21%,94%的患儿检出至少1种基因重排,88%的患儿检出至少2种基因重排。TCRB、TCRD、TCRG和IgH重排分别以完全性V_β-(D_β)-J_β、V_δ-J_δ、V_γⅠ-J_γ1.3/2.3和D_H-J_H不完全重排为主。各种重排的胚系片段使用和连接区序列极具多样性。③ 10例复发患儿中有6例检测了复发时的Ig/TCR基因重排模式,4例与初诊时完全一致,2例发生改变。④SIL-TAL1融合基因阳性率在11例IgH重排阳性患儿中0%(0/14),在41例IgH重排阴性患儿中为34.1%(14/41),P=0.025。⑤TCRB基因重排阳性组高危比例(20.5%,9/44)低于阴性组(62.5%,5/8),P=0.025。TCRB或TCRG基因重排阳性组第33 d缓解率(89.4%,42/44)高于阴性组(10.6%,5/8),P=0.022,第78 d MRD水平≥10^-3的比例(10.8%,4/37)低于阴性组(50.0%,3/6),P=0.045。结论 儿童T-ALL初诊时Ig/TCR克隆性基因重排的胚系片段使用和连接区序列极具多样性,有助于进一步性MRD 检测标志的筛选。     

RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排监测急性淋巴细胞白血病患儿治疗过程微小残留白血病

目的 研究RQ-PCR检测急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿Ig/TCR基因重排在微小残留白血病（MRD）监测中的作用。方法 以2009年3月至2011年3月在广州市妇女儿童医疗中心血液肿瘤科确诊和治疗的ALL患儿为研究对象,PCR检测初诊ALL患儿的Ig/TCR基因重排;基因扫描分析初诊患儿Ig/TCR基因重排的克隆特性;对ALL患儿的单克隆性Ig/TCR基因重排进行测序,RQ-PCR检测不同治疗阶段Ig/TCR基因重排的表达量。结果 86例ALL患儿进入分析,男52例,女34例;年龄1~13（4.3±3.0）岁,随访时间1~26（14.3±7.0）个月。①83例（96.5%）检出1种或以上Ig/TCR基因重排,共检出209个Ig/TCR基因重排;②91.8%（56/61例）检出1种或以上单克隆性Ig/TCR基因重排;61例172个Ig/TCR基因重排中,单克隆性、寡克隆性和多克隆性Ig/TCR基因重排的检出率分别为58.1%（100个）、30.8%（52个）和11.0%（19个）,差异有统计学意义（P=0.000）;③26例完成连续3次随访,其中22例持续完全缓解患儿的Ig/TCR基因重排平均相对表达量持续下降,在维持治疗前均为MRD阴性（≤1.0×10-4）;4例复发患儿在诱导缓解治疗后至复发前各检测时点Ig/TCR基因重排表达量均＞1.0×10-4,并在复发前已有回升,从开始回升至临床复发的平均时间为3.75（2～8）个月。结论 Ig/TCR基因重排相对表达量可反映MRD水平,可作为判断预后、监测复发和指导治疗的有效手段。     

儿童急性T淋巴细胞白血病微小残留病检测的临床意义

目的：探讨急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）患儿微小残留病（MRD）监测的临床指导价值。方法采用多参数流式细胞术对2006年1月1日-2008年12月31日在北京儿童医院治疗的60例T-ALL患儿在治疗不同时间点进行追踪监测,分析不同MRD水平患儿的临床特征及预后。结果诱导治疗第33 d MRD≥1×10-4组患儿易复发,P＝0.03;诱导治疗第33 d MRD＜1×10-4组患儿预计5年无事件生存率（EFS）为100％,而MRD≥1×10-4组患儿5年EFS为（62.5±7.1）％,两组之间差异有显著性（P＝0.018）。结论监测T-ALL患儿MRD水平在评估早期治疗反应、监测复发以及估计预后中具有重要临床价值。     

急性淋巴细胞白血病患儿化疗结束后T淋巴细胞克隆谱系分析

目的了解急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿化疗结束后T淋巴细胞免疫重建情况。方法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)高压变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测8例正常对照及44例化疗结束后的ALL患儿外周血T细胞受体(TCR)β链可变区(BV)第三互补决定区(CDR3)的克隆谱系。结果白血病化疗结束至48个月TCRBV家族仍可见表达增高或降低(P均0.05)。化疗结束后TCRBVCDR3谱型多态性基本恢复,但寡克隆增生情况仍明显高于正常对照组(P均0.05),小于6个月组差异最明显(P均0.05)。16例普通B细胞急淋(c-ALL)BV8、BV5.1、BV5.2和BV12发生克隆性增生的频率较高,9例前B细胞急淋(pre-B)BV6家族发生克隆性增生较多。结论白血病患儿化疗结束至48个月T细胞免疫尚未完全恢复;T细胞克隆谱系异常以寡克隆增生为主。     

以免疫球蛋白和T细胞受体基因重排为标志定量检测MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病的微小残留病和预后关系

目的 探讨MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）微小残留病（MRD）与临床特征的关系及其对预后的指导作用。方法 以2003年4月至2009年12月首都医科大学附属北京儿童医院血液肿瘤中心收治的MLL基因重排的ALL患儿为研究对象。以免疫球蛋白和T细胞受体基因重排、MLL融合转录本为标志,定量PCR方法监测MRD水平。以诱导治疗结束时MRD水平≥10-4为MRD阳性组,<10-4为MRD阴性组。卡方检验和Kaplan-Meier生存分析分别比较MRD阳性和阴性组临床特征和无事件生存率（EFS）的差异。结果 14例ALL患儿在诱导治疗结束时检测了MRD水平,MRD阳性组患儿初诊时外周血WBC计数显著高于MRD阴性组,对泼尼松实验治疗反应显著低于MRD阴性组。MRD阴性组5年EFS显著优于MRD阳性组,100% vs （37.5±17.1）%,P=0.022。结论 诱导治疗结束时MRD水平有助于对MLL基因重排儿童ALL进行预后分组,指导个体化治疗、改善预后。     

急性B淋巴细胞性白血病患儿外周血T淋巴细胞克隆谱系分析

目的　观察儿童急性B淋巴细胞性白血病化疗前后T淋巴细胞克隆谱系的异常。方法　逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)及高压变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测 8例正常对照组小儿及 12例急性B淋巴细胞性白血病患儿化疗前外周血T细胞受体 (TCR) β链可变区 (BV)第三互补决定区(CDR3)的克隆谱系 ,4例患儿化疗后重新取材。结果　 (1) 12例患儿化疗前BV2和BV3表达较正常对照组增高 (P均 <0 0 5 ) ,BV17和BV18表达降低 (P均 <0 0 5 )。 4例患儿治疗前BV2 1家族低表达 ,缓解后表达进一步降低 (P <0 0 5 )。 (2 )正常对照组TCRBV多数家族CDR3谱型为正态分布 ,12例患儿TCRBVCDR3谱型异常发生率为 14 % ,高于正常对照组的 5 5 % (P <0 0 5 ) ,发生谱型异常较多的家族依次是BV14、BV1、BV16、BV2 0、BV13 1、BV13 2和BV6。 4例患儿第 1次化疗缓解后 3个月谱型异常的家族均恢复正态分布。结论　急性B淋巴细胞性白血病患儿部分T细胞克隆发生异常增生或缺失 ,提示白血病患儿细胞免疫功能异常 ,化疗初次缓解后 3个月T细胞克隆谱系基本恢复正常的正态分布 ,已基本完成T细胞克隆谱系的重建     

ALL-2005方案治疗儿童T系急性淋巴细胞白血病35例疗效总结

目的研究ALL-2005方案治疗儿童T系急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的疗效。方法对2005年5月-2009年4月初发的35例T-ALL患儿采用ALL-2005方案进行分层治疗及疗效分析。结果 T-ALL患儿35例,男30例(86%),女5例(14%),发病时中位年龄8.3(2.0～15.6)岁。其中>10岁患儿14例,占40%。起病时外周血白细胞≥50×109/L者24例,占69%,起病时6例患儿有纵隔增宽。泼尼松治疗第8天时泼尼松试验反应好者22例(63%)。诱导治疗第35天有29例获完全缓解(83%),骨髓微小残留病(MRD)≤0.01%者共20例(67%)。治疗第55天时MRD≤0.01%共26例(87%)。4例复发,3例失访,6例死亡(包括3例复发和3例第1疗程未缓解而放弃治疗者)。随访至2011年6月31日,中位随访时间39(1～71)个月,5年无事件生存率为73.5%。结论 ALL-2005方案治疗儿童T-ALL疗效较好。     

T细胞受体双基因标志检测对ALL患儿化疗效应评价初探

目的     

Population-based study of the pattern of molecular markers of minimal residual disease in childhood and adult acute lymphoblastic leukemia: an assessment of the practical difficulty of representative sampling for trial purposes. Northern Region Haematology Group

BACKGROUND: The prevalence, in unselected patients with acute lymphoblastic leukaemia (ALL), of clonal rearrangements suitable for minimal residual disease (MRD) studies has not been formally investigated. PROCEDURE: This was a prospective, demographic study of the frequency of molecular markers of MRD in all patients with ALL presenting over 5 years within the Northern Health Region of England (population 3.1 million). Presentation marrow samples were examined to detect informative markers. RESULTS: One hundred twenty-four children (age <15 years) developed non-Burkitt ALL. No material was available for study in 21. Eighty-six had clonal gene rearrangements (BCR/ABL, immunoglobulin heavy chain (IGH) and/or T cell receptor (TCR) gene rearrangements). All entered remission; 84 (68% of the original cohort) survived to become eligible for MRD studies. One hundred sixteen adults developed ALL, of whom 48 were not studied due to insufficient cellular material in the bone marrow aspirate or to logistical problems in central referral of samples from other hospitals. Material from elderly adults (age >55 years) was less likely to be sent for analysis, 36% vs. 59% (P = 0.024). Thirty-eight had BCR/ABL and/or IGH/TCR gene rearrangements. Thirty-one (27% of the original cohort) entered remission and became eligible for MRD studies. Informative gene rearrangements were more common in children than adults (83% vs. 63%, P < 0.003). CONCLUSIONS: The results reveal substantial potential, unintentional, selection bias. Large-scale multicentre studies of MRD in children may well produce clinically relevant and representative data. Those who mount similar studies in adults should not assume they will be similarly representative or as successful in accrual of material.     

儿童急性T淋巴细胞白血病生物学特征及其预后的回顾性队列研究

背景儿童急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）在现有危险度分层治疗方案中,预后存在差异。目的探究儿童急性T-ALL的生物学特征及其与临床表现、早期治疗反应及长期预后的相关性。设计回顾性队列研究。方法回顾性分析2008年3月至2018年9月首都医科大学附属北京儿童医院收治、使用CCLG-ALL-2008方案治疗的初诊为T-ALL患儿白血病免疫标志和融合基因的特征,及其与患儿临床表现、早期治疗反应和长期预后的相关性。主要结局指标无事件生存（EFS）和总生存（OS）。结果101例T-ALL患儿进入本文分析,其中男76例（75.2%）。SIL-TAL1是最常见的融合基因（21.8%,22/101）,SIL-TAL1阳性患儿纳入高危的比例显著高于阴性者。干细胞标志CD34的表达率为45.5%（46/101）。表达免疫标志CD2者与初诊外周血高WBC计数相关;表达CD34者与强的松反应不良及第15 d高微小残留病（MRD）相关;表达CD33者与诱导结束时形态学不缓解及高MRD相关;表达CD10者强的松治疗反应良好者多。单因素生存分析显示,SIL-TAL1阳性、强的松治疗反应不良、治疗第15 d骨髓形态学不缓解、第33 d高MRD及高危危险度与不良的EFS和OS相关（P均<0.05）,其中第33 d MRD≥1%和SIL-TAL1融合基因阳性亦是EFS和OS的独立预后影响因素,危险比分别为第33 d MRD≥1%对EFS为1.96（95%CI：1.114~3.452,P=0.020）,对OS为2.062（95%CI：1.138~3.734,P=0.017）;SIL-TAL1阳性对EFS为2.536（95%CI：1.053~6.104,P=0.038）,对OS为2.921（95%CI：1.144~7.457,P=0.025）。结论T-ALL是一组异质性疾病,在以MRD为分层依据的治疗方案中,SIL-TAL1和治疗早期MRD对预测患儿长期预后有一定价值。     

Detectable minimal residual disease before allogeneic hematopoietic stem cell transplantation predicts extremely poor prognosis in children with acute lymphoblastic leukemia

BACKGROUND: The level of minimal residual disease (MRD) prior to allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) has been shown to be an independent prognostic factor for outcome of pediatric patients with high-risk acute lymphoblastic leukemia (ALL). Retrospective studies which used (semi-) quantitation of clone-specific immunoglobulin/T-cell receptor (Ig/TCR) rearrangements have documented the feasibility and practicality of this technique. This approach has also been disputed due to the occurrence of clonal evolution and generally high MRD levels prior to HSCT. PROCEDURE: In our prospective study, MRD before and after HSCT was monitored using quantitative real-time PCR in a cohort of 36 children with ALL consecutively transplanted in our center between VIII/2000 and VII/2004. RESULTS: In 25 of 36 patients, MRD level prior HSCT was assessed. Seventeen patients were classified as MRD-negative and eight were MRD-positive up to 9 x 10(-2). In MRD-positive subgroup, seven events (six relapses) occurred post-transplant in striking contrast to only one relapse in MRD-negative subgroup (event-free survival (EFS) log-rank P < 0.0001). MRD proved to be the only significant prognostic factor in a multivariate analysis (P < 0.0001). Adoptive immunotherapy including donor lymphocyte infusions in patients with adverse dynamics of MRD after HSCT had only limited and/or temporary effect. Clonal evolution did not present a problem precluding MRD monitoring in any of patients suffering a post-transplant relapse. CONCLUSIONS: We show that MRD quantitation using clonal Ig/TCR rearrangements successfully assesses the risk in pediatric ALL patients undergoing allogeneic HSCT. As our ability to treat detectable MRD levels after HSCT is very limited, alternative strategies for MRD-positive patients prior HSCT are necessary.