缝隙连接在血管平滑肌细胞内皮源性超极化中的作用

目的：研究乙酰胆碱(ACh)对与血管内皮细胞(EC)混合共培养的平滑肌细胞(SMC)的电生理作用．方法：培养主动脉EC和SMC，利用常规全细胞膜片钳技术记录其膜电位和膜电流．再记录ACh对两的作用，并与其对混合共培养中SMC的作用作对比，加入缝隙连接和NO合成酶阻断剂，判断其作用机制．结果：ACh可以使得EC膜电位超极化并可引出一个外向电流，但对SMC没有作用；ACh对混合共培养中的SMC膜电位有一个超极化作用，此作用对NO合成酶阻断剂硝基精氨酸(L-NNA)不敏感，而对TEA或缝隙连接阻断剂1813-甘草次酸(18β-GA)敏感．结论：ACh对SMC产生内皮源性超极化作用可能与SMC上KCa开放有关，且该内皮源性超极化作用与EC与SMC之间的缝隙连接有密切的关系．     

双层共培养模型中缝隙连接在内皮细胞调节平滑肌细胞增殖能力中的作用

目的 探讨在双层共培养体系中缝隙连接在血管内皮细胞(endothelial cell,EC)调节血管平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)增殖能力中的作用.方法 采用植块法分别培养大鼠主动脉内皮及平滑肌细胞,并将2种细胞分别接种至Transwell insert膜的两侧以建立内皮细胞与平滑肌细胞双层共培养模型,并用透射电镜观察2种细胞在Tran-swell insert膜两侧生长情况.用3H-TdR掺入法观察双层共培养模型中平滑肌细胞增殖情况,并观察缝隙连接阻断剂180α-甘草次酸(18α-GA)对平滑肌细胞增殖能力的影响.结果 在共培养第1天,EC/SMC组与SMC/SMC组的平滑肌细胞3H-TdR掺入率无统计学差异[(10 900 ±1 320)cpm/weli vs(10 430±1 200)cpm/well,P>0.05].第2天,EC/SMC组中平滑肌细胞3H-TdR的掺入率有低于SMC/SMC组[(17 200±1 734)cpm/well vs(20 900±1 659)cpm/well]的趋势,但两者差异未达到统计学标准.共培养第3天时,EC/SMC组平滑肌细胞3H-TdR掺入率显著低于SMC/SMC组,两者相比有显著性差异[(25 800±1 984)cpm/well vs(33 070±3 569)cpm/well,P<0.05].在用18α-GA预处理24 h后,EC/SMC共培养3 d后平滑肌细胞3H-TdR的掺入率明显高于同期未处理EC/SMC组,两者相比有显著性差异[(30 500±2 650)cpm/well vs(25 800±1 984)cpm/well,P<0.05].结论 双层共培养模型中内皮细胞通过缝隙连接可抑制血管平滑肌细胞的增殖能力.     

人原代肺动脉内皮-平滑肌接触式共培养方法的技术改进

目的：改进人肺动脉内皮细胞（human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs）-人肺动脉平滑肌细胞（human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs）接触式共培养方法,为更好模拟体内两种细胞间相互作用提供研究平台。方法：采用微孔聚碳酸酯膜为载体,将HPAECs和HPASMCs接种于微孔膜两侧,建立HPAECs-HPASMCs联合培养模型以模拟正常血管壁两种细胞的结构关系,通过调整细胞种植密度、培养时间、培养液体系、培养基种类、血清浓度等,倒置相差显微镜、Hoechst染色及流式细胞术比较不同条件下接触式共培养模型中细胞贴壁、生长和凋亡的差异,免疫荧光染色观察优化共培养条件后细胞标记物的表达变化。结果：①明胶预包被Transwell膜可促进内皮细胞的黏附和生长;②渗透压升高增加内皮细胞凋亡;③内皮细胞培养基较DMEM、RPMI1640更有利于接触式共培养模型的建立;④内皮细胞生长因子为1%、胎牛血清为2%时两种细胞生长稳定;⑤优化共培养条件对两种细胞的自身特性无显著影响。结论：当培养体系为内皮细胞培养基、维持1%内皮细胞生长因子及2%胎牛血清组分条件,可建立稳定的HPAECs-HPASMCs接触式共培养模型,为体外模拟人肺动脉血管壁结构功能和研究两种细胞间相互作用构建了良好平台。     

视网膜色素上皮单细胞层的培养

目的：利用微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统培养视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞，为视网膜色素上皮细胞转运等功能的研究提供体外模型。方法：将ARPE-19细胞接种到底部为层黏蛋白包被的微孔滤膜的小室（内室）中，并将此小室放到6孔培养板（外室）内进行培养。用吉姆萨染色观察细胞生长情况，并用含有台酚蓝的培养液检测细胞间的紧密连接。结 果：将1.0×10⁵•mL^-1的ARPE-19细胞混悬液1.5 mL接种于内室的层黏连蛋白包被的微孔滤膜上进行培养，大约第5天细胞长满滤膜，经吉姆萨染色，在光学显微镜下确认视网膜色素上皮细胞充分融合，在层黏连蛋白表面形成一整齐的单细胞层，且台酚蓝不能通过该单细胞层。结论：培养在层黏连蛋白包被的微孔滤膜上的视网膜色素上皮细胞，如同体内的视网膜色素上皮细胞一样形成单 细胞层，细胞间形成功能性的紧密连接，可作为视网膜色素上皮细胞转运等功能研究的体外模型。     

人脐动脉内皮细胞-平滑肌细胞共培养模型的建立及鉴定

 目的 建立人脐动脉内皮细胞-平滑肌细胞共培养模型,以体外模拟人动脉壁,为动脉粥样硬化及炎症等疾病的发病机制和治疗研究打下基础。方法 采用胶原酶灌注消化法从人脐动脉中原代培养获得人脐动脉内皮细胞（human umbilical artery endothelial cell,HUAEC）,采用组织块贴块法从人脐动脉中原代培养获得人脐动脉平滑肌细胞（human umbilical artery smooth muscle cell,HUASMC）。用含有抗坏血酸（≥50 μg/mL）的培养基孵育平滑肌细胞,使之合成并分泌胶原蛋白,形成内皮细胞的生长基质;然后将内皮细胞以饱和密度接种到平滑肌细胞上,使内皮细胞和平滑肌细胞直接接触并整合形成内皮细胞-平滑肌细胞共培养（EC-SMC co-culture）模型。分别用免疫荧光染色和Dil-Ac-LDL吞噬实验对共培养模型进行形态学和功能学的鉴定。结果 形态学鉴定结果显示,两种细胞已成功整合,模拟出体内动脉壁的形态。Dil-Ac-LDL吞噬实验的结果显示共培养模型的内皮细胞中有荧光信号,并且共培养模型中内皮细胞Dil-Ac-LDL的内吞量显著高于单纯内皮细胞（EC monoculture or EC monolayer）,证明共培养模型中内皮细胞与平滑肌细胞已建立联系。结论 本实验成功建立人脐动脉内皮细胞-平滑肌细胞共培养模型,可在体外更好地模拟人动脉壁形态和基本功能。     

放射性32P对兔平滑肌细胞和内皮细胞增殖的影响

目的 评价放射性次磷酸钙[32P-Ca（H2PO2）2]溶液和以化学镀法制备的32P钢丝对体外培养的兔平滑肌细胞（SMC）和内皮细胞（EC）增殖的影响。方法 分别将5、10、20、40、80μCi的32P-Ca（H2PO2）2液加人体外培养的兔SMC和EC培养液中,72h后检测细胞生存力;以化学镀法制备不同活度的32P放射性钢丝,观察其对细胞生长的抑制范围。结果 当32P-Ca（H2PO2）2放射活度为5μCi时,对EC的生存力并无明显影响,却可导致SMC生存力显著降低（P<0.05）;当放射活度增加至10μCi时,虽然SMC和EC的生存力均显著降低,但对SMC生存力的影响显著大于对EC的影响（P<0.05）;高于20μCi则两种细胞的敏感性趋于一致。32P放射性钢丝对细胞生长有明显的抑制作用,而且这种作用有量一效关系。同一活度组的钢丝对SMC的抑制作用显著强于对EC的抑制（P<0.05）。结论32P-Ca（H2PO2）溶液和以化学镀法制备的32P钢丝可显著抑制SMC和EC的增殖;对较低的放射活度,EC耐受力大于SMC;在冠状动脉内进行低活度的放射,对再狭窄的预防有重要意义。     

心肌细胞体外微环境中骨髓间质干细胞向心肌样细胞的分化

目的：分析心肌组织内何种细胞对骨髓间质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的定向分化起决定作用。方法：利用BMSCs与心肌细胞（cardiomyocytes,CM)、内皮细胞（endothelial cells,EC)共培养和单独培养，分析形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果：与CM共培养后，相邻的BMSCs之间融合成肌管样结构，并与相邻胎鼠CM初步形成闫盘样结构。心肌肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC)抗体染色呈阳性。在与EC共培养以及BMSCs单独培养时，BMSCs均未出现肌管样结构，MHC染色呈阴性。结论：CM对BMSCs的定向分化具有一定作用。     

高葡萄糖诱导的与内皮细胞共培养的雪旺细胞的损伤作用

 目的 观察高葡萄糖对与内皮细胞（endothelial cells ,EC）共培养的雪旺细胞（Schwann cells ,SC）的损伤情况。方法 建立大鼠SC与EC的共培养模型,根据形态学和MTT选定25mmol/L高葡萄糖浓度和48h作用时间。将细胞分为正常葡萄糖SC与EC共培养组、高葡萄糖SC与EC共培养组及高葡萄糖SC组,通过形态学和MTT、凋亡率（流式细胞仪）和Casepase-3mRNA表达（Realtime PCR）观察细胞损伤。结果 形态学及MTT显示,与EC共培养的SC在高葡萄糖条件下,比正常葡萄糖共培养以及高葡萄糖单培养的SC存活率明显下降;SC凋亡率比正常葡萄糖共培养及高葡萄糖单培养的SC明显增高;Casepase-3mRNA表达较正常葡萄糖共培养组明显升高,但与高葡萄糖单培养组相比其增高尚无统计学显著性意义。结论 在高葡萄糖环境下,与EC共培养的SC损伤更明显,可能与两种细胞相互作用加重SC损伤有关。     

间充质干细胞增强结直肠癌细胞可提高正常肠上皮细胞迁移能力并诱导上皮间质转化

目的：体外构建肠癌细胞或间充质干细胞与正常结肠上皮细胞的共培养模型,模拟体外肿瘤微环境,探讨在体外共培养环境下肠癌细胞或间充质干细胞对正常结肠上皮细胞迁移能力和上皮-间质转化的影响。方法：用Transwell小室建立结肠癌细胞株（SW480）、人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）或二者同时与人正常结肠上皮细胞（NCM460）的体外共培养模型;按照共培养模型中上室或下室接种的细胞共分成4组：A：空白对照组（不接种细胞）,B：只接种hUC-MSCs,C：只接种SW480,D：混合接种hUC-MSCs和SW480;另一侧均接种NCM460细胞,上下室接种细胞的数目比例均为1∶1。观察共培养后NCM460的形态学改变,并通过划痕实验和Transwell实验检测NCM460迁移能力变化;同时用Western blot检测NCM460共培养后的上皮-间质转化标志物改变。结果：各实验组NCM460细胞形态学上未发现显著改变;Transwell迁移实验结果表明,与hUC-MSC或SW480共培养时,NCM460的迁移能力有增强的趋势,Vimentin表达显著升高（P<0.05）,E-cadhe...     

缝隙连接蛋白与大脑缺血再灌注损伤

缝隙连接蛋白（eonnexin,Cx）是构成细胞间缝隙连接（gap juncti on,GJ）通道的基冬结构和功能的一大类膜蛋白。一个连接蛋白分子包括四个跨膜区域,两个细胞外环和一个细胞内环,其羧基端与氨基端位于细胞内。而在胞浆内的羧基末端区域具有明显的差异,它可以因为胞内信号变化而改变蛋白构象,从而对缝隙连接功能状态有影响。     

细胞间接触诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的实验研究

目的通过两种细胞的共培养探讨细胞间接触对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化的影响。方法分别采用密度梯度离心法和胶原酶消化法分离培养了骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和膀胱平滑肌细胞(bladder smooth muscle cells,BSMCs)。并对其进行了鉴定。在此基础上以单独培养的BMSCs和BSMCs分别作为阴性和阳性对照组,将获得的BMSCs和BSMCs在体外通过接触与非接触共培养作为实验组,对诱导后的BMSCs是否向平滑肌(smooth muscle cells,SMCs)分化通过免疫荧光和Western blot进行鉴定。结果对BMSCs进行流式细胞术检测结果显示CD90、CD44表达阳性率分别为99.78%,60.27%,CD45表达阴性,阳性率为0.21%。在BMSCs与BMSCs共同培养的实验中,Western blot结果显示:BMSCs本身表达少量calponin蛋白,接触组calponin的表达随培养时间的延长逐渐增多,非接触组无明显变化;免疫荧光显示:接触组在共培养第8天...     

血管内皮和平滑肌细胞联合培养构建组织工程化血管的方法

目的：探讨组织工程血管种子细胞原代培养、传代扩增、鉴定的方法，为组织工程血管的构建提供理想的种子细胞。方法：无菌条件下取正常产妇分娩的脐带动静脉，ROSS法（即组织贴块法）原代培养混合血管细胞。倒置相差显微镜、免疫组化法对细胞进行鉴定。结果：倒置显微镜显示原代细胞及经传代培养后的细胞，呈现内皮样细胞、平滑肌样细胞混合生长的特征。免疫组化法检测示内皮细胞Ⅷ因子、平滑肌细胞α-肌动蛋白呈阳性反应。细胞经3次～5次传代，数量可增殖达到8×10^6—10×10^6。结论：使用组织贴块法原代培养可获得内皮细胞、平滑肌细胞混合体，细胞经体外联合培养、传代可以达到组织工程血管种子细胞所需的数量。     

无或低血清条件下高压培养促进平滑肌细胞和内皮细胞生长

目的观察高压培养对无或低血清条件下平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响。方法用无或0.5%血清培养基,在高于1个标准大气压（标准大气压设定为0 mmHg）30-180 mmHg压力下培养人脐静脉内皮细胞和大鼠血管平滑肌细胞。用台盼蓝染色细胞计数法和MTT评价细胞的生长情况。结果在低血清条件下,高压培养的血管内皮细胞生长速度明显快于标准大气压培养的血管内皮细胞,细胞计数和MTT结果显示高压培养比大气压培养细胞生长增加约30%。无血清大气压培养平滑肌细胞2天后,未见明显的活细胞,而高压培养大鼠平滑肌细胞仍能保持生长。结论无或低血清条件下,高压培养能保持血管平滑肌和血管内皮细胞的生长。     

Differences in the primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta

Objective: To investigate the differences of primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta. Methods: Endothelial cells were obtained using the vascular ring adherence, collagenase digestion method and an improved vascular ring adherence method, while smooth muscle cells were separated from tissue sections of rat aorta. Clones of endothelial cells were selected by limiting dilution assay. Both cell types were identified using specific cell immunofluorescent markers,and phase contrast microscopy was used to observe the morphological disparity between endothelial cells and smooth muscle cells at the single cell and colony level. Cell proliferation was determined by the cell counting kit-8. Differences between endothelial cells and smooth muscle cells were evaluated in trypsin digestion 6me, attachment time and recovery after cryopreservation. Results: Endothelial cells were obtained by all three methods. The improved vascular ring method provided the most reproducible results. Cells were in good condition, and of high purity. Smooth muscle cells were cultured successfully by the tissue fragment culture method. Clonal expansion of singleendothelial cells was attained. The two cell types expressed their respective specific markers, and the rate of proliferation of smooth muscle cells exceeded that of endothelial cells. Endothelial cells were more sensitive to trypsin digestion than smooth muscle cells. In addition, they had a shorter adherence time and better recovery following cryopreservation than smooth muscle cells. Conclusion: The improved vascular ring method was optimal for yielding endothelial cells. Limiting dilution is a novel and valid method for purifying primary endothelial cells from rat aorta. Primary rat endothelial cell and vascular smooth muscle cell cultures exhibited different morphological characteristics, proliferation rate, adherence time, susceptibility to trypsin digestion and recovery after cryopreservation. Our research can be a good foundation for further application in the regeneration of blood vessel.     

免膀胱平滑肌细胞的分离培养与鉴定

目的 建立分离、培养高纯度兔膀胱平滑肌细胞的方法,并进行细胞学鉴定与分析。方法 正常成年新西兰白兔共6只,运用显微手术器械在肉眼下仔细剔除膀胱黏膜层及浆膜层后,完整分离膀胱平滑肌层。然后以酶分离法获取兔膀胱平滑肌细胞,体外原代和传代培养分离细胞。在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况,同时进行细胞爬片H-E染色和透射电镜等形态学观察分析,并应用免疫荧光染色平滑肌特有的α-肌动蛋白进行细胞学鉴定分析。最后根据细胞计数绘制细胞生长曲线和增殖曲线。结果 24 h可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长,7 d可进行传代,传至第10代时细胞仍迅速生长,倒置显微镜下观察细胞相互交叉、重叠生长形成多层,高低起伏呈“谷和峰”样结构,至第12代时,细胞开始变形,至第15代时细胞已失去平滑肌细胞的典型形态特点,细胞生长杂乱且不规则,至第20代时细胞已死亡。以第4代细胞进行形态学细胞爬片H-E染色和透射电镜观察分析,以及平滑肌特有的α-肌动蛋白免疫荧光染色分析均证实,该分离培养的细胞为膀胱平滑肌细胞,且纯度高达100%。结论 酶分离法在短时间内成功培养大量高纯度的膀胱平滑肌细胞,为深入研究膀胱平滑肌细胞的病理生理及分子生物学奠定了基础。     

犬骨髓间充质干细胞体外诱导分化的平滑肌细胞的组织培养及鉴定

目的：应用条件培养基体外诱导成年犬骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞,探讨其作为构建组织工程血管种子细胞的可行性。方法：应用DMEM添加PDGF-BB和维生素C(VIT-C)体外培养通过密度梯度离心法得到的骨髓单核细胞,通过形态学观察鉴定培养的细胞,采用免疫荧光法检测4～6代细胞中平滑肌细胞特异性标记α-肌动蛋白（α-SMA）和肌球蛋白重链SMMHC,应用流式细胞术检测第5、6代细胞中平滑肌细胞的阳性率。结果：犬骨髓间充质干细胞在条件培养基的诱导下稳定传代至第6代后达到种子细胞的种植数量10⁷～10⁸,单独DMEM培养需要42　d,添加PDGF-BB/VIT-C后时间减少为33　d。细胞免疫荧光结果提示,大部分细胞α-SMA阳性、SMMHC阴性;流式细胞术结果显示,第5、6代细胞的α-SMA阳性率分别为57.8%和66.8%。结论：体外条件培养基能诱导犬骨髓间充质干细胞增殖分化为平滑肌细胞,并可作为组织工程血管构建的种子细胞。     

血小板衍生生长因子-BB对血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞胶原蛋白合成的影响

目的:观察血小板衍生生长因子-BB对培养的人血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞胶原蛋白合成的影响.方法:采用培养的人血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞,应用3H-脯氨酸掺入方法,观察血小板衍生生长因子-BB对3种细胞胶原蛋白合成的影响.结果:血小板衍生生长因子-BB可促进处于静止状态的成纤维细胞和平滑肌细胞胶原蛋白合成,并呈现出明显的浓度依赖关系,成纤维细胞和平滑肌细胞胶原蛋白合成分别在30 ng/ml和40 ng/ml时达到高峰,血小板衍生生长因子-BB对血管内皮细胞胶原蛋白合成总量无明显促进作用.在30 ng/ml的血小板衍生生长因子-BB作用下,成纤维细胞和平滑肌细胞分别在36 h和48 h时胶原蛋白合成达到高峰.结论:血小板衍生生长因子-BB可明显促进培养的人血管平滑肌细胞和成纤维细胞的胶原蛋白的合成,对血管内皮细胞胶原蛋白合成总量无明显促进作用.     

壳多糖对兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞增殖的影响

目的：研究壳多糖对体外培养的兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响。方法：将不同质量浓度（０．２,２,２０,２００,２０００μｇ／ｍｌ）的壳多糖溶液分别加入兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞培养液中,培养１２,２４,４８ｈ后用ＭＴＴ经色法测定细胞数。结果：平滑肌细胞数随着壳多糖质量浓度和作用时间的增加而减少;内皮细胞数随着其质量浓度和作用时间的增加,在一定范围内相应增加。结论：壳多糖能抑制兔主动脉平滑肌     

腺病毒载体介导的bFGF基因体外转染大鼠平滑肌细胞的实验研究

目的观察携带bFGF基因的重组腺病毒体外转染平滑肌细胞的效率及转染后目的基因的表达。方法应用磷酸钙共沉淀法分别构建携带bFGF基因和大肠杆菌LacZ报道基因的重组腺病毒载体Ad．bFGF和Ad．LacZ,并以Ad．bFGF（组Ⅰ）、Ad．LacZ（组Ⅱ）、PBS（组Ⅲ,对照组）转染体外培养的大鼠平滑肌细胞（SMCs）。X—gal染色检测腺病毒载体的转染效率,噻唑蓝（MTT）检测各组SMCs的增殖情况,酶联免疫吸附（ELISA）检测各组培养液中bFGF蛋白的浓度。结果当MOI值为100时,X-gal核蓝染细胞比率达95％以上;组ⅠSMCs的增殖水平显著高于组Ⅱ和组Ⅲ（P〈0．01）;ELISA方法检测,在转染后第1天组Ⅰ培养波中即有bFGF蛋白的分泌表达,第3天达峰值后分泌量逐渐下降,第8天仍能检测到少量分泌,而组Ⅱ和组Ⅲ培养液中均未检测到bFGF蛋白。结论成功地将所构建的Ad. bFGF转染体外培养的SMCs,并在培养液中检测到目的基因的蛋白表达。     

豚鼠膀胱组织ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin 43表达意义

目的 探讨体外培养豚鼠膀胱组织ICCs细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)间隙连接蛋白Connexin 43的表达.方法 胶原酶消化法进行豚鼠膀胱组织ICCs细胞的原代培养, 对照为原代培养膀胱平滑肌细胞,免疫荧光法进行两种细胞的特征性蛋白c-kit及平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)染色观察,免疫荧光法及Western blot法进行培养细胞Connexin43的检测.结果 豚鼠膀胱ICCs细胞特征性蛋白c-kit染色阳性,SMA染色阴性.豚鼠膀胱ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin 43表达水平较高,显著高于膀胱平滑肌细胞.结论 豚鼠离体膀胱ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin43高表达可能是其信号传递的重要物质基础.