Ⅱ型胶原多肽263～272序列中多个氨基酸替换的意义及其在胶原性关节炎治疗中的作用

目的:研究Ⅱ型胶原变构肽(APL)中氨基酸替换对胶原性关节炎(CIA)的抑制作用,为类风湿关节炎(RA)的多肽免疫治疗提供试验依据.方法:以丙氨酸替换Ⅱ型胶原(CⅡ)263～272多肽中与T细胞受体(TCR)结合的氨基酸,3H掺入法检测变构肽对RA患者外周血T细胞活化的竞争抑制作用,筛选用于CIA治疗的变构肽.以牛CⅡ诱导大鼠CIA模型,应用不同剂量(1, 10, 100 μg)的CⅡ变构肽每周2次皮下注射,观察大鼠关节肿胀的变化情况.治疗3周后(初次免疫后第35天)处死大鼠,进行X线及病理评分.ELISA法检测血清IFN-γ水平.结果:3条CⅡ263～272变构肽均不同程度抑制CⅡ原型肽对RA患者T 细胞的活化.其中,同时替换267位谷氨酰胺(Q)、270位赖氨酸(K)和271位甘氨酸(G)为丙氨酸(A)的APL3效果最好.应用APL3对CIA进行治疗的结果发现,100 μg治疗组CIA大鼠的关节炎指数、X线及病理评分均显著低于PBS对照组.血清IFN-γ水平也较PBS对照组明显下降.而无关肽组与PBS对照组相比,关节炎指数、X线和病理评分以及血清IFN-γ水平均无明显差别.结论:TCR结合氨基酸位点替换后的CⅡ263～272多肽具有T细胞低反应性和对原型肽的竞争抑制作用,并可抑制大鼠胶原性关节炎的发展,提示其抑制RA免疫异常的可能性.     

小儿类风湿关节炎患者外周血CD4+、CD8+ T细胞CD69表达及意义

目的分析小儿类风湿关节炎（RA）患者的外周血CD4^＋、cDB^＋T细胞CD69表达水平，探讨其在小儿关节炎症发生过程中的免疫病理作用。方法收集32例RA患儿和30例健康儿童外周血标本，利用流式细胞仪检测CD4^＋、cD8^＋T细胞CD69表达，分析它们在疾病发展过程中的作用。结果RA患儿外周血CD4^＋、CD5^＋T细胞CD69表达明显升高，与健康者比较有统计学差异（P〈0．05），所有患儿均接受了有效的药物治疗，待症状控制后，分析发现患者的CD4^＋、CD8^＋T细胞表达CD69水平显著下降（P〈O．05）。结论RA患儿外周血T细胞表达CD69水平明显升高，提示T细胞在关节炎症病变过程中激活、增殖，参与关节滑膜组织及全身免疫应答。     

类风湿关节炎患者外周血调节性B细胞比例及功能变化的研究

目的 检测类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)比例及功能的变化情况,初步探讨Bregs在RA发病中的作用。 方法 采用流式细胞染色方法检测健康对照组及RA患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中CD19+CD24hiCD38hi B细胞和CD4 T细胞比例变化情况;活细胞荧光染料CFSE染色方法检测CD19+CD24hiCD38hi B细胞对Nave CD4 T细胞增殖能力的影响;同时检测CD19+CD24hiCD38hi B细胞分泌IL-10的能力及对CD4 T细胞分泌IFN-γ能力的影响。 结果 与健康对照组相比,RA患者外周血CD19+CD24hiCD38hi B细胞比例显著降低,而CD4 T细胞比例显著升高,且随着病情严重程度升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。功能研究显示,RA患者外周血CD19+CD24hiCD38hi B细胞分泌IL-10水平显著降低(P＜0.01),且其抑制Nave CD4 T细胞增殖及分泌IFN-γ的能力均显著降低(P＜0.01)。 结论 RA患者外周血CD19+CD24hiCD38hi B细胞分泌IL-10能力下降,导致免疫抑制功能降低,进而引起CD4 T细胞比例升高和IFN-γ水平升高,影响RA病情进展。      

树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究

目的探讨通过聚肌胞体外作用树突状细胞后改善慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能,并在体外活化自身T细胞获得高频数HBV特异性细胞毒性T细胞(CTL)的方法。方法分离慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞,在粒巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)和白细胞介素4(IL4)的诱导下培养树突状细胞。培养的第7天加入聚肌胞刺激获得成熟树突状细胞,经HBVcore1827肽负载后与自身T淋巴细胞共培养,通过酶联斑点计数法(Elispot)及MHC肽四聚体法(Tetramer)比较病人T细胞未经自身树突状细胞刺激组、经HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组、经聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组中HBV特异性的CTL的功能和频数。结果慢性乙型肝炎病人外周血单核细胞体外经GM CSF和IL4诱导可转化为树突状细胞,树突状细胞转化过程中聚肌胞的刺激可显著上调树突状细胞表面分子CD80、CD83的表达(P<0.01),促进树突状细胞的成熟。Elispot法检测分泌IFNγ的CTL的频数病人T细胞未经自身树突状细胞刺激组分泌频数为(9～28)/1×105T细胞,均值16;经HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组频数为(30～67)/1×105T细胞,均值为46;经聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组频数为(59～130)/1×105T细胞,均值为98。三组数据     

类风湿关节炎患者HLA-DR4/1表型与流感病毒血凝素特异性T细胞增殖及其抗体的关系

目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者人类白细胞抗原(HLA)-DR4/1表型与流感病毒血凝素(HA)308-317多肽特异性T细胞增殖和血清抗HA308-317抗体之间的关系.方法 将HA308-317多肽与70例RA患者外周血单个核细胞(PBMC)共孵育5 d,3H掺入法测定T细胞增殖.用ELISA法检测RA患者血清HA308-317抗体水平.以序列特异性引物聚合酶链反应(PCR.SSP)技术对RA患者进行HLA-DR分型.结果 在70例RA患者中,27例HLA-DR4/1表型阳性.其中,HA308-317多肽可刺激T细胞增殖的RA患者有17例(62.9%),10例无反应性;15例(55.6%)HLA-DR4/阳性RA患者抗HA308-317抗体阳性.在HLA.DR4/I表型阴性的RA患者中,T细胞对HA308.317多肽有反应性者10例(23.3%),无反应性者33例;25例(58.1%)患者抗HA308-317抗体阳性.HLA-DR4/1表型阳性组HA308-317特异性细胞增殖高于HLA-DR4/1表型阴性组(P＜0.01),但两组血清中HA308-317抗体水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RA患者HA308-317特异性T细胞增殖与HLA-DR4/1表型有关,HA308-317抗体生成与HLA-DR4/l亚型无明显关系;HA308-317多肽可能通过诱导HLA-DR4/1特异性T细胞活化参与RA的发病.     

类风湿关节炎患者外周血辅助性T细胞1型/辅助性T细胞2型细胞因子模式及其与炎症指标的相关性

类风湿关节炎(RA)是一种累及全身多关节的自身免疫性炎症性疾病,病因和发病机制尚未阐明[1]。以往的研究表明,细胞因子是RA的主要炎症介质,辅助性T细胞2型(Th2)细胞因子如白介素(IL)4和IL10对疾病起保护性作用,相反辅助性T细胞1型(Th1)细胞因子如IL2和γ干扰素(IFN)支持RA患者关节前炎症微环境。Th1/Th2细胞因子失平衡状态在RA患者的发病机制中起重要作用[2]。不同于以往的酶联免疫吸附试验(ELISA)或逆转录聚合酶链反应(RT PCR),为进一步探讨Th1/Th2细胞及其分泌的细胞因子在RA患者体内的表达模式和临床意义,本实验应用先进…     

脓毒症患者外周血调节性Vδ1 T细胞比例及功能变化

目的:观察脓毒症患者外周血Vδ1 T细胞数量和功能的改变,初步探讨Vδ1 T细胞在脓毒症发病中的作用?方法:选取2013年12月—2014年12月在本院ICU入住的脓毒症患者40例及同期入院进行健康体检者(health control,HC)40例,清晨空腹抽取外周静脉血10 mL?采用流式细胞术测定其外周血Vδ1 T细胞比例及Vδ1 T细胞表面Foxp3表达情况,采用CFSE染色方法检测Vδ1 T细胞对CD4+ T细胞增殖能力的影响,采用流式细胞术测定Vδ1 T细胞与CD4+ T细胞共孵育后对CD4+ T细胞分泌γ-干扰素(interferon γ,IFN-γ)及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)能力的影响?结果:脓毒症患者外周血Vδ1 T细胞数量(3.35 ± 0.55)%与HC(1.04 ± 0.22)%相比显著升高(P < 0.01)?与HC外周血Vδ1 T细胞表面Foxp3表达水平(10.02 ± 2.31)%相比,脓毒症患者外周血Vδ1 T细胞表面Foxp3表达水平(16.83 ± 3.63)%显著升高(P < 0.01)?HC外周血Vδ1 T细胞对CD4+ T细胞增殖?分泌IFN-γ和TNF-κ的抑制百分率分别为(44.26 ± 6.31)%?(34.84 ± 4.83)%和(39.31 ± 4.91)%,脓毒症患者外周血Vδ1 T细胞对CD4+ T细胞增殖?分泌IFN-γ和TNF-κ的抑制百分率分别为(62.35 ± 5.91)%?(50.37 ± 4.77)%和(54.94 ± 5.71)%?提示,脓毒症外周血Vδ1 T细胞较HC外周血Vδ1 T细胞具有更强的免疫抑制功能(P < 0.01)?结论:脓毒症患者外周血Vδ1 T细胞免疫抑制功能增强,致使脓毒症患者免疫功能受到抑制,脓毒症患者免疫功能的这种改变可能与脓毒症的发生相关?     

瓜氨酸化修饰对纤维蛋白原多肽抗原性的影响

目的 研究瓜氨酸化修饰对人纤维蛋白原(Fg)多肽抗原性的影响,探讨针对瓜氨酸化Fg的自身免疫应答在类风湿关节炎(RA)发病中的分子机制.方法 体外对人Fg进行瓜氨酸化修饰,用修饰后Fg刺激RA患者及对照组外周血单个核细胞,通过~3H掺人法观察细胞增殖情况;通过计算机软件对人Fg α链进行瓜氨酸化修饰前后的抗原性分析,从中筛选出1条多肽,并体外合成原型肽和瓜氨酸替换肽,通过在表达HLA-DRB1细胞系中的直接肽结合试验和抗体竞争肽结合试验,评价瓜氨酸化修饰对Fg多肽与HLA-DRB1亲合力的影响;另外,在体外采用抗原提呈及活化系统,通过检测细胞增殖情况观察瓜氨酸化修饰对Fg多肽激活T细胞作用的影响.结果 瓜氨酸化修饰的Fg和野生型Fg对RA患者外周血单个核细胞的激活作用略高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05).多肽结合试验和细胞活化试验证实,瓜氨酸替换肽与HLA-DRB1的结合力明显高于原型肽,而且瓜氨酸替换肽对T细胞的活化作用强于原型肽,二者差异有统计学意义(SI为2.26±0.14比1.65±0.53,P<0.01).结论 瓜氨酸化修饰能够增加Fg多肽与HLA-DRB1的结合力,诱导T细胞活化,从而增强Fg多肽的抗原性.     

类风湿关节炎患者外周血调节性T细胞的检测及意义

类风湿关节炎(RA)是一种以细胞免疫紊乱为主的自身免疫性疾病,RA的免疫学异常包括T细胞亚群失调和T细胞的异常活化.调节性T细胞(Treg)可通过抑制自身反应性淋巴细胞的活化、增殖来维持机体的免疫耐受.本研究对RA患者外周血的Treg(CD4 CD25 high)以及活化的CD4 T(CD4 CD25 )细胞的表达进行了检测,并结合临床资料进行分析,现报道如下.     

三七总皂苷对类风湿关节炎患者CCP/AST增殖及分泌INF-γ的影响

[目的]观察三七总皂苷(PNs)对类风湿关节炎(RA)患者环瓜氨酸肽(CCP)抗原特异性T细胞(CCP/AST)体外增殖及分泌干扰素-γ(INF-γ)的影响.[方法]体外分离培养24例RA患者外周血淋巴细胞,分为空白对照组、CCP组、甲氨喋呤(MTX)对照组及PNS组.体外培养72 h后,采用CCK-8法测定T细胞增殖...     

类风湿关节炎患者人类白细胞抗原-DR4/1表型与Ⅱ型胶原特异性T细胞增殖及血清Ⅱ型胶原抗体的关系

目的:探讨类风湿关节炎 (RA) 患者HLA-DR4/1表型与Ⅱ型胶原 (CⅡ) 263-272 多肽特异性T细胞增殖和血清CⅡ263-272抗体之间的关系. 方法:将CⅡ263-272多肽与70例RA患者外周血单个核细胞(PBMC)共孵育5天,用3H参入法测定T细胞增殖,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测患者血清CⅡ263-272抗体水平.以序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)技术对上述患者进行HLA-DR分型.结果:在70例RA患者中,27例HLA-DR4/1表型阳性,43例HLA-DR4/1表型阴性.在HLA-DR4/1表型阳性的RA患者中,CⅡ263-272多肽可刺激T细胞增殖的有15例(55.6%),12例(44.4%)呈无反应性;18例(66.7%) 患者抗CⅡ263-272抗体阳性.而在HLA-DR4/1表型阴性的RA患者中,T细胞对CⅡ263-272多肽有反应性者13例(30.3%),无反应性者30例(69.7%);15例(34.8%) RA患者抗CⅡ263-272抗体阳性.HLA-DR4/1表型阳性组CⅡ263-272特异性细胞增殖和CⅡ263-272抗体生成均高于HLA-DR4/1表型阴性组.结论:RA 患者CⅡ263-272 特异性T细胞增殖和CⅡ263-272抗体生成与HLA-DR4/1表型有关.     

类风湿关节炎患者Ⅱ型胶原特异性T细胞增殖及抗体生成与HLA-DR4的关系

目的　探讨类风湿关节炎(RA)患者Ⅱ型胶原 (CⅡ)特异性T细胞增殖和CⅡ抗体生成,及与人类白细胞抗原(HLA)- DR_4亚型之间的关系。方法　将CⅡ263 -272十肽与 62例RA患者外周血单个核细胞(PBMC)共孵育 5d,应用四甲基偶氮唑盐法测定T细胞增殖。酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定患者血清CⅡ抗体水平。提取 40例患者外周血基因组DNA,以 33种HLA- DR_4等位基因亚型的特异引物PCR扩增后测定患者HLA DR分型情况。结果　在 62例RA患者中, 38例(61 .3% )患者的T细胞在加入CⅡ263- 272后出现明显增殖,CⅡ263 -272抗体阳性率为 53. 2%。细胞增殖反应阳性的患者CⅡ263- 272抗体的阳性率为 66. 7%,增殖反应阴性的患者为 34 6%,两者比较P<0 .05。CⅡ263 -272抗体阳性的患者T细胞增殖反应率为 69 7%,阴性患者为 42 .1%, 两者比较P<0 .05。所有患者T细胞增殖刺激指数 (SI)与CⅡ263- 272抗体浓度呈显著正相关 (r=0 68,P<0. 01)。40例患者HLA分型中,有 16例携带HLA -DR_4等位基因,未发现HLA DR_4与CⅡ特异性T细胞增殖反应、CⅡ抗体阳性有显著相关性。结论　CⅡ抗体的生成可能与CⅡ特异性T细胞介导的B细胞活化有关。     

人类白细胞抗原-DRβ1特异性低T细胞反应性肽对T细胞激活的抑制作用

目的　研究人类白细胞抗原 (HLA) DRβ1特异性Ⅱ型胶原 (CII)多肽的T细胞受体(TCR)结合表位改变对T细胞激活的影响。探讨通过抑制T细胞对抗原肽的识别治疗类风湿关节炎的新途径。方法　利用AutoDock3 0系统设计非T细胞结合肽 ;以激光共焦显微镜及流式细胞仪观察荧光标记的CⅡ 2 6 3 2 72修饰肽的细胞内转运及其在细胞膜上的表达 ;应用HLA DR1转基因抗原呈递细胞和特异性T细胞的激活体系 ,研究替换TCR识别氨基酸的CII修饰肽在T细胞激活中的作用。结果　计算机模拟显示CII第 2 6 3位苯丙氨酸 (F)、2 6 6位谷氨酸 (E)是与HLA DR1结合的关键位点 ,而 2 6 7位谷氨酰胺 (Q)、2 6 9位脯氨酸 (P)和 2 70位赖氨酸 (K)是T细胞识别的主要功能氨基酸。用甘氨酸 (G)、和 /或丙氨酸 (A)替换上述位点可去除功能性侧链。CⅡ修饰肽可被HLA DR1转基因抗原呈递细胞摄取并与膜表面的HLA DR1分子结合。CⅡ 2 6 3 2 72原型肽可激活T细胞 ,而用A或G单一替换 2 6 7、2 6 8、2 6 9、2 70位氨基酸或连续替换 2 6 8 2 70位氨基酸的修饰肽对T细胞的激活能力明显降低 (P <0 0 1)。低反应性修饰肽 2 70A、sub2 6 8 2 70对CⅡ诱导的T细胞激活有显著抑制作用。结论　通过替换CII中TCR特异性氨基酸可减弱或消除其对T细胞的结合能力及激     

p53 in fibroblast-like synoviocytes can regulate T helper cell functions in patients with active rheumatoid arthritis

Background  p53 is a tumor suppressor and plays a key role in regulating cell hyperplasia, repairing DNA and inducing apoptosis. This study was to investigate p53 expression in fibroblast-like synoviocytes (FLS) and its effect on CD4⁺ T lymphocytes from patients with active rheumatoid arthritis (RA).

Methods  Human FLS were transfected with p53 siRNA and cocultured with CD4⁺ T lymphocytes from patients with active RA. The expressions of osteoprotegerin and interleukin (IL)-6 were detected in p53 siRNA and scramble siRNA-transfected FLS. In addition, protein levels of interferon (IFN)-γ, IL-17, IL-4 and CD25 as well as mRNAs of IFN-γ, retinoic acid-related orphan receptor (ROR)-γt, IL-17 and Foxp3 in cocultured CD4⁺ T lymphocytes were also measured.

Results  IL-6 decreased in p53-knockdown FLS while osteoprotegerin expression was not altered. FLS with p53 deletion significantly increased the production of IL-17 and IFN-γ by CD4⁺ T cells and upregulated Foxp3 mRNA expression without effects on the proportion of CD4⁺CD25^high T lymphocytes.

Conclusion  p53 in FLS might regulate Th1 and Th17 functions in patients with RA and participate in the pathogenesis of RA.

     

类风湿关节炎患者外周血Treg细胞及其分泌IL-35水平检测与临床意义

目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者外周血中调节性T细胞(Treg)的数量,以及其所分泌的白细胞介素(IL)-35表达水平与RA发病的相关性.方法 采集45例RA患者(RA组),22例骨关节炎(OA)患者(OA组),26例健康体检者(对照组)的外周血,流式细胞术检测CD4+ CD25+ foxp3+ Treg数量,ELISA检测血浆IL-35水平.分析Treg细胞及其表达的IL-35与临床指标间的相关性.结果 RA组外周血中Treg细胞占CD4+T细胞的百分率[(5.65±2.33)％]较对照组[(4.12±1.75)％]明显升高(P＜0.05);OA组与RA组比较,差异无统计学意义(P=0.086).3组对象foxp3平均荧光强度比较,差异无统计学意义(P＞0.05);DAS28评分越高的患者,其外周血Treg细胞数量和foxp3荧光强度越低.RA组血浆IL-35[(34.22±14.35)ng/L]水平明显低于OA组[(78.63±24.58)ng/L]和对照组[(67.56±25.43)ng/L],差异均有统计学意义(P＜0.05).RA患者Treg细胞数量与红细胞沉降率(ERS)、DAS28评分呈负相关(r=-0.223、-0.343,P=0.023、0.011),而与类风湿因子、C反应蛋白、抗CCP抗体无相关性.结论 RA患者外周血中Treg细胞数量增高,IL-35水平降低;Treg细胞功能缺陷致负调控能力减弱.     

探讨外周血CD4^＋、CD8^＋T细胞CD69在小儿类风湿关节炎发生过程中的免疫病理作用

目的：对小儿类风湿关节炎（RA）在发生过程中外周血中CD4＋、CD8＋T细胞CD69的表达水平与免疫病理作用进行探讨。方法：选取本院在2011年7月-2012年9月间采集的30例类风湿关节炎患儿与30例健康儿童的外周血标本,将前者定为观察组,后者定为对照组。对这两组儿童外周血中的CD4＋、CD8＋T细胞CD69采用流式细胞仪进行检测;观察组患儿采用药物治疗后,检测CD4＋、CD8＋T细胞CD69的表达水平情况。结果：观察组患儿的CD4＋、CD8＋T细胞CD69的表达水平明显高于对照组（P〈0.05）;且观察组患儿经过药物治疗后,RA症状明显有了改善,重新抽取其外周血进行检测,发现患儿CD4＋、CD8＋T细胞CD69的表达水平明显比治疗前要下降（P〈0.05）。结论：CD4＋、CD8＋T细胞CD69在疾病的发生过程中是起着一种激活、增殖的作用,通过控制CD4＋、CD8＋T细胞CD69能够达到缓解病情的作用。