胚胎培养液中低密度脂蛋白受体相关蛋白-1的表达与胚胎质量和妊娠率的关系

目的:探讨胚胎培养液中低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(LRP-1)的表达与胚胎形态学评分及其与移植后妊娠率的关系。方法:收集培养第3天可利用胚胎的培养液,用ELISA方法检测其中LRP-1的表达水平,比较不同胚胎形态学评分间胚胎培养液中LRP-1水平的差异,并比较妊娠组与未妊娠组间移植胚胎培养液中LRP-1水平。结果:(1)优质胚胎对应的培养液中LRP-1的表达水平高于Ⅲ级胚胎的表达水平[(991.79±182.60)pg/ml vs(639.22±108.09)pg/ml],差异具有统计学意义(P<0.05);(2)妊娠组胚胎培养液中LRP-1的表达水平[(1 056.34±166.82)pg/ml]高于未妊娠组的表达水平[(899.46±169.37)pg/ml],差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:胚胎培养液中LRP-1的表达水平可作为预测胚胎发育潜能及妊娠结局的参考指标之一。     

遗忘型轻度认知功能损害患者认知特征与低密度脂蛋白受体相关蛋白1基因的关联研究

目的 探讨遗忘型轻度认知功能损害(amnestic mild cognitive impairment,aMCI)的认知特征及其与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low density lipoprotein receptor related protein1,LRP1)基因C766T多态性的关联性.方法 应用多维度神经心理测试评估109例aMCI患者和104例正常对照者的神经认知功能;采用等位基因鉴别方法分析LRPI基因C766T多态性.结果 aMCI组的各项神经认知测试成绩均显著差于正常对照组(P<0.01),尤以反映情节记忆的听觉词语记忆测试(AVMT)的20分钟延迟回忆受损最明显[aMCI组:3(0～4),正常对照组:7.5(6～12),Z=-12.697,P<0.01];aMCI组和正常对照组间LRP1基因C766T基因型和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05).aMCI组LRP1基因C766T等位基因亚组间各神经认知测试成绩差异无统计学意义(均P>0.05).结论 aMCI患者存在明显的情节记忆减退;LRP1基因C766T多态性不是aMCI主要的遗传风险因素.     

遗忘型轻度认知功能损害患者认知特征与低密度脂蛋白受体相关蛋白1基因的关联研究

Objective To investigate the relationship between neuropsychological characteristics and low density lipoprotein receptor related protein 1 (LRP1) gene C766T polymorphism in amnestic mild cognitive impair-ment (Amci). Methods 109 Amci patients and 104 matched normal controls were recruited for the study. Multi-dimension neuropsychologic tests were used to extensively assess the cognitive function. Assay-on-demand was used to analyse LRP1 gene C766T polymorphism in the subjects. Results The scores of neuropsychologic tests in Amci patients were significantly lower than those in the normal controls ( all P<0.01), with the largest im-pairment on 20 minute delayed recall of the auditory verbal memory test (AVMT) ,which reflects episodic memory [Amci patients :3 (0-4) ,normal controls :7.5 (6～12), Z=-12.697, P<0.01]. No significant differences were found for the genotype and allele distribution of C766T polymorphism between Amci patients and the normal controls. C766T polymorphism was not associated with cognitive assessment scores in Amci patients (P>0.05). Conclusion Amci is characterized by episodic memory impairment;and LRP1 gene C766T polymorphism may not be an important genetic factor in susceptibility to aMCI.     

人源受体相关蛋白在大肠杆菌中表达的优化及纯化

目的 获得人源受体相关蛋白(RAP)，对表达条件进行优化。方法 RAP cDNA被插入到原核表达质粒pT7-PL和pET-28a( )中。分别构建成RAP重组表达载体，转化两种BL21菌株后，转化菌用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，选择pT7-PL-RAP质粒进行表达条件的优化，采用镍离子亲和层析纯化所获得的RAP，通过检测与巨噬细胞的结合能力评估其生物活性。结果 两个重组质粒均获得了RAP的高表达，对于pT7-PL-RAP质粒。RAP在BL21 (DE3，plysS)菌株中的表达显著高于在BL21 (DE3)菌株的表达；有氯霉素存在时表达高于无氯霉素时；诱导表达的RAP大部分为可溶性的；镍离子亲和层析树脂纯化所获得的RAP，可与富含低密度脂蛋白受体(LDLR)家族受体的小鼠巨噬细胞系RAW264．7结合。结论 本实验获得了有生物学功能的RAP，为进一步开发生产此蛋白打下良好的基础。     

阿仑膦酸钠治疗绝经后骨质疏松的效果及与低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因N740N多态性的关系研究

目的通过分析阿仑膦酸钠治疗绝经后骨质疏松患者骨密度变化及与低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)基因N740N位点多态性的关系,明确该多态性与疗效的关系。方法本研究为自身前后对照研究,共入选67例绝经后骨质疏松患者,平均年龄(64.2±7.7)岁,口服阿仑膦酸钠70 mg,1次/周,钙尔奇D 600 mg/次,1次/d,治疗1年。治疗前后分别使用双能X线吸收仪检测第2～4腰椎以及左股骨近端各部位骨密度,利用PCR和琼脂糖凝胶电泳检测LRP5基因N740N多态性。结果共63例患者完成阿仑膦酸钠1年治疗,第2～4腰椎骨密度上升(4.05±3.39)%、股骨颈骨密度上升(1.05±2.63)%、大转子区骨密度上升(2.00±2.89)%、转子间骨密度上升(2.17±2.62)%、总髋部骨密度上升(1.79±2.29)%;治疗前与治疗后各部位骨密度比较,差异有统计学意义(P<0.01)。本研究人群中LRP5基因N740N位点CC基因型和CT基因型频率分别为65.1%和34.9%。TT基因型未检出,符合Hardy-Weinberg定律。治疗前后大转子区骨密度变化百分比,CC基因型上升(2.53±3.77)%,CT基因型上升(6.35±6.43)%;总髋部骨密度变化百分比,CC基因型上升(1.93±2.33)%,而CT基因型上升(3.79±4.15)%。CC基因型和CT基因型患者治疗前后各部位骨密度比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论阿仑膦酸钠对于绝经后骨质疏松患者骨密度的提高有显著疗效,腰椎骨密度升高超过髋部,而对于LRP5基因N740N多态性为位点各基因型之间骨密度的分析,发现CT基因型治疗前后大转子和总髋部骨密度变化百分比高于CC基因型,故此基因型疗效较好,提示该基因型与阿仑膦酸钠疗效相关。可进一步扩大样本量并对该基因型多个多态性位点予以证实。     

何首乌二苯乙烯苷对拟痴呆大鼠学习记忆和海马组织CA1区脑啡肽酶及低密度脂蛋白相关受体1表达的影响

目的 探讨何首乌二苯乙烯苷（TSG）对拟痴呆大鼠学习记忆能力及海马组织CA1区脑啡肽酶（NEP）及低密度脂蛋白相关受体（LRP）-1表达的影响。方法 采用随机数字表法将60只大鼠分为A~F组,每组10只。A组为对照,背部皮下注射0.9%氯化钠溶液300 mg/kg,连续6周,1次/d。B~F组背部皮下注射D-半乳糖300 mg/kg拟阿尔茨海默病（AD）模型,连续6周,1次/d。造模同时,C组采用盐酸多奈哌齐0.9 mg/kg灌胃,D~F组分别给予TSG 0.05、0.10和0.20 g/kg灌胃,连续12 周,1次/d。采用Morris水迷宫实验观察大鼠空间记忆能力,前5 d进行定位航行实验,训练大鼠学习能力,第6天进行空间探索实验,记录大鼠入水角度及穿越平台次数。采用避暗实验观察大鼠被动回避记忆功能,第1天进行训练,24 h后进行测试,记录5 min内大鼠进入暗室的次数和潜伏期。大鼠麻醉后眼眶取血,采用放射免疫法检测血清β淀粉样蛋白（Aβ）1-42水平。大鼠处死取脑,采用免疫组化染色,以累计光密度反映海马CA1区NEP和LRP-1的表达水平。结果 各组大鼠入水角度和穿越平台次数比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中,B组大鼠入水角度大于A组及C~F组（P＜0.05）;B组穿越平台次数低于A组及C~F组（P＜0.05）。各组大鼠潜伏期及遭电击次数比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中,B组大鼠潜伏期短于A组及C~F组（P＜0.05）;B组大鼠遭电击次数多于A、E组（P＜0.05）。各组大鼠血清Aβ1-42水平及海马CA1区NEP、LRP-1累计光密度比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中,B组血清Aβ1-42水平高于A、E、F组（P＜0.05）;B组NEP累计光密度低于A组及D~F组（P＜0.05）;B组LRP-1累计光密度低于A、E组（P＜0.05）。结论 何首乌TSG可改善拟痴呆大鼠的学习记忆能力,提高大鼠海马组织CA1区NEP、LRP-1的表达,增强对Aβ的降解和转运。     

高迁移率族蛋白1及生长因子受体Ⅲ在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

目的 探讨高迁移率族蛋白1HMGB1)和生长因子受体Ⅲ,EGFrvⅢ)在乳腺癌组织中的表达情况及其与乳腺癌临床特征的关系.方法 用免疫组织化学染色法分别对48例术前未行放化疗的乳腺癌患者手术后的蜡块标本及16例癌旁组织进行HMGB1和EGFr vⅢ检测.结果 肿瘤组织及癌旁组织中HMGB1阳性率分别是75.0%(36/48)和6.3%(1/16),EGFr vⅢ表达的阳性率分别为70.8%(34/48)和0%(0/16),肿瘤组织及癌旁组织之间的阳性率均有统计学意义,HMGB1表达与EGFR vⅢ表达正相关.结论 HMGB1和EGFrvⅢ在乳腺癌发生发展中起重要作用,HMGB1与EGFrvⅢ联合检测对预测乳腺癌发展及预后评价有重要意义.     

乳腺癌组织中蛋白激酶C-βΙ与周期蛋白D1的表达

目的:观察蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)-βΙ与周期蛋白D1(cyclin D1)在乳腺癌组织中的表达状况,探讨癌细胞信息传递的分子生物学机制.方法:应用半定量RT-PCR检测31例乳腺癌组织与12例癌旁正常乳腺组织中PKC-βΙ mRNA表达;应用Western blot和免疫组化法检测以上组织中PKC-βΙ蛋白与cyclin D1表达. 结果:乳腺癌组织中PKC-βΙ mRNA与蛋白表达均高于癌旁正常乳腺组织(P＜0.01);癌组织cyclin D1表达阳性率高于癌旁正常乳腺组织(P＜0.05). 结论:乳腺癌组织中存在PKC-βΙ同工酶过度表达,它可能介导乳腺癌细胞分化的信号转导过程.cyclin D1与细胞恶性增生密切相关.     

S期激酶相关蛋白2在骨肿瘤组织中的表达及其与恶性程度的关系

目的探讨S期激酶相关蛋白2在骨肿瘤组织上的表达及其与肿瘤恶性程度的关系。方法收集了湘雅医院1999～2004年经外科手术切除的52例骨肉瘤,29例骨巨细胞瘤,15例骨软骨瘤并经病理确诊的石蜡包埋标本。另取10例来源于非肿瘤患者的新鲜正常骨组织常规固定、脱钙包埋切片作为对照组。采用免疫组织化学SP染色法检测上述标本的Skp2表达情况。结果Skp2蛋白在正常骨组织不表达（按Bresalier法染色强度为0）;骨软骨瘤中呈低度表达（均值为0.59）;骨巨细胞瘤中度表达（均值为1.17）;骨肉瘤高度表达（均值为1.74）;差异有显著性（P〈0.05）。Skp2蛋白在骨肉瘤Ⅱa期均值为1.42,Ⅱb期为1.54,Ⅲ期为2.60。差异也均有显著性（P〈0.05）。结论Skp2的表达水平与骨肿瘤的恶性程度相关,有望成为骨肉瘤新的基因诊断指标。     

高糖对足细胞表达结缔组织生长因子及其受体蛋白的调节

目的:研究长期高糖对体外培养的足细胞表达结缔组织生长因子(CTGF)及其受体--低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的影响以及可能涉及的信号途径.方法:以体外培养的小鼠肾小球足细胞为研究对象,应用Western印迹分析技术,检测高糖刺激不同时间对足细胞表达CTGF蛋白的影响.观察高糖对丝裂素激活蛋白激酶(MAPKS)信号途径活化的影响以及MAPKS信号途径在高糖调节足细胞表达CTGF中的作用,同时检测高糖对足细胞CTGF的受体LRP蛋白的影响.结果:体外培养足细胞表达基础水平的CTGF蛋白,高糖刺激2天后足细胞表达CTGF水平开始升高,第4天达高峰,第6天下降,第8天降至对照组水平.正常糖和甘露醇组CTGF蛋白没有明显变化.高糖可以激活足细胞外信号调节激酶(ERK1/2),于刺激30 min时ERK1/2即开始活化,6 h达高峰,持续至24h,48 h接近基础水平.正常糖和甘露醇在各个时间点均不活化ERK1/2.应用ERK1/2活化特异抑制剂PD98059可以消减高糖刺激CTGF表达增加的效应.在各个时间点,长期高糖环境对足细胞CTGF的受体LRP蛋白没有明显作用.结论:短期(2～4 d)高糖通过活化ERK1/2信号通路刺激足细胞CTGF的表达,高糖继续培养(6～8 d)对足细胞内的CTGF蛋白表达水平没有影响.长期高糖环境对足细胞上CTGF的受体LRP蛋白的表达无影响.     

转化生长因子β1对人胚肺成纤维细胞结缔组织生长因子及低密度脂蛋白受体相关蛋白表达的影响

目的:探讨体外培养人胚肺成纤维细胞(human pulmonary fibroblasts-1,HPF-1)在外源性转化生长因子β1(transforming growth factor beta, TGF-β1)作用下结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)与低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor related proteins, LRP) 的表达变化及意义.方法:将HPF-1用5 μg/L的TGF-β1分别作用0, 3, 6, 12和 24 h.用RT-PCR方法检测CTGF及LRP mRNA的表达;用蛋白免疫印迹检测LRP蛋白表达变化;用免疫沉淀方法检测TGF-β1作用不同时间,与LRP结合的CTGF的数量变化;用细胞免疫荧光检测细胞中LRP表达情况.结果:相关分析显示,以3 h为关键点,CTGF mRNA(131.53±2.86)与LRP mRNA(224.87±7.00)表达变化具有正相关性(r=0.840 2,P＜0.05);LRP蛋白随TGF-β1作用时间不同,表达水平先升高,于3 h达高峰,而后逐渐下降,用免疫印迹法分析,相对于0 h组(190.85±2.86),3 h组(222.45±3.66)表达具有统计学意义(F=18.06,P＜0.05);用免疫荧光标记细胞LRP也得到类似的结果,比较0 h组(27.56±6.72)和3 h组(88.66±15.72)LRP蛋白表达(F=244.36,P＜0.01)差异具有统计学意义.结论:LRP作为CTGF的受体蛋白,在TGF-β1作用不同时间的情况下,表达量发生变化,并与CTGF的表达成正相关,提示其在肺间质纤维发生中发挥作用.     

肾移植患者低密度脂蛋白受体相关蛋白基因多态性与血脂水平检测

目的：探讨肾移植患者脂代谢紊乱的临床特征及低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density)lipoprotein receptor related protein,LRP)基因多态性对血脂水平的影响。方法：用生化方法检测207例肾移植患者移植前及移植后3个月、6个月、1年、1．5年时的血脂水平,多聚合酶链反应．限制性片断长度方法检测LRP 5′端上游区域四核苷酸重复序列及外显子3RsaⅠ位点基因多态性。结果：肾移植患者移植前甘油三酯(total trilyceride,TG)水平显著高于正常对照组,血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDLC)、脂蛋白(a)[lipoprotein(a),Lp(a)]水平均显著低于正常对照组,移植后3个月TC、TG、HDLC、LDLC、载脂蛋白[(apolipoprotein,Apo）,Apo B、Apo E]水平均显著高于对照组及移植前水平,于移植后6个月、1年时进一步升高。移植前血清TC、TG高于正常范围上限者仅为3．4％、17．4％,移植后3个月时显著增高至30．9％、44．9％,移植后6个月时升高至45．9％、58．9％,1年时升高至48．3％、64．4％,1．5年为37．7％、47．8％,显著高于移植后3个月时的比率。肾移植患者LRP 5′端四核苷酸重复序列基因型91／91、91／87与等位基因91bp频率较高,LRP外显子3RsaⅠ位点基因型C／C与等位基因C发生频率较高,对照组与病例组间LRP 5′端及外显子3RsaⅠ位点基因型分布频率及等位基因发生频率无显著差异。肾移植患者LRP 5′端四核苷酸重复序列不同基因型间血脂水平无显著差异。对照组LRP外显子3RsaⅠ位点基因型C／T者血清LDLC水平显著增高,病例组血脂水平无显著差异。结论：肾移植患者易发生高脂血症,移植后6个月～1年时高脂血症的程度最为显著,LRP 5′端四核苷酸重复序列与外显子3RsaⅠ位点基因多态性对肾移植患者血脂水平无显著影响。     

Effects of Oxidized Low Density Lipoprotein on the Expression and Function of ABCA1 in Macrophages

In the present study, we examined the regulation of the expression and function of ABCA1 by modified LDL (ox-LDL) in vitro. After incubation with apoA-I for 24 h, RAW264.7 cells effluxed 37.65 % cholesterol loaded by acetyl LDL (ac-LDL), and 9.78% cholesterol in ox-LDL group. The level of ABCA1 mRNA increased about three times either when cells were incubated with .100 μg/mL ac-LDL or with 100 μg/mL ox-LDL. However, the level of ABCA1 protein rose by 1.57 times in ac-LDL group and 1.26 times in ox-LDL group. These results demonstrated that ox-LDL had different effect on the expression and function of ABCA1, ox-LDL might decrease the cholesterol efflux mediated by ABCA1 through other unknown mechanisms.     

氧化修饰的低密度和极低密度脂蛋白对巨噬细胞单核趋化蛋白表达的影响

探讨氧化修饰的低密度脂蛋白（ＯＸ－ＬＤＬ）和氧化修饰的极低密度脂蛋白（ＯＸ－ＶＬＤＬ）是否能诱导巨噬细胞表达单核细胞趋化蛋白１（ＭＣＰ－１）ｍＲＮＡ和蛋白，以阐明二者在动脉粥样硬化发生中的作用。方法在巨噬细胞的培养基中分别加入２５μｇ／ｍｌ的低密度脂蛋白（ＬＤＬ）、极低密度脂蛋白（ＶＬＤＬ）、ＯＸ－ＬＤＬ和ＯＸ－ＶＬＤＬ，３７℃下温育２４小时，收集巨噬细胞的条件培养基，同时用异硫氰酸胍法提取巨噬细胞总ＲＮＡ。用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析的方法检测巨噬细胞ＭＣＰ－１ｍＲＮＡ的表达，用夹心ＥＬＩＳＡ检测其条件培养基中ＭＣＰ－１蛋白的含量。用微孔滤膜法进行单核细胞的趋化试验。结果当巨噬细胞分别暴露于ＯＸ－ＬＤＬ和ＯＸ－ＶＬＤＬ２４小时后，其ＭＣＰ－１ｍＲＮＡ和蛋白的表达明显增加，同时单核细胞迁移距离的明显增加。而当巨噬细胞分别暴露于ＬＤＬ和ＶＬＤＬ２４小时，其ＭＣＰ－１ｍＲＮＡ和蛋白的表达只有轻微的增加，单核细胞迁移距离亦无明显的增加。结论巨噬细胞能表达ＭＣＰ－１ｍＲＮＡ和蛋白，ＯＸ－ＬＤＬ和ＯＸ－ＶＬＤＬ能诱导该细胞更强地表达ＭＣＰ－１ｍＲＮＡ和蛋白     

肺癌组织中WISP-1 mRNA和蛋白的表达

目的:探讨人肺癌组织中WNT诱导的分泌型蛋白-1(WISP-1)基因的表达与临床病理因素的关系.方法:采用real-time PCR和免疫组化法检测原发性肺癌患者的癌组织和癌旁正常肺组织中 WISP-1 mRNA和蛋白的表达.结果:肺癌组织和正常肺组织中WISP-1 mRNA的相对表达量分别为(-3.09±3.53)μg/L和(-5.82±3.67)μg/L,WISP-1蛋白阳性率分别为63.3%和39.2%,肺癌组织中WISP-1 mRNA的相对表达量和蛋白阳性率均高于正常肺组织(P均＜0.05).肺癌组织中WISP-1 mRNA的表达与病理学类型、年龄有关(P＜0.05).多元线性回归分析显示:病理类型、年龄、家族史、转移、性别等对WISP-1 mRNA的表达有影响.结论:WISP-1基因可能是原发性肺癌发生发展过程中的重要生物学标志物,WISP-1基因表达的蛋白产物可作为临床干预治疗的重要靶蛋白.     

肝癌患者的癌因性疲乏与生存质量的分析

目的　研究肝癌患者的癌因性疲乏与生存质量的相互关系。方法　对 5 0例肝癌患者进行癌症疲乏量表与世界卫生组织生存质量测定量表简表调查 ,以分析两者的相互关系。结果　肝癌患者对自身生存质量及自身健康状况的评价不满意者占半数以上 ,癌因性疲乏与生存质量呈负相关 (P <0 0 5 )。结论　肝癌患者癌因性疲乏与生存质量两者相互影响 ,如何使肝癌患者的疲乏与生存质量都得到改善 ,是我们进一步的目标。     

表皮黏钙素基因突变及蛋白表达异常与喉癌转移的关系

目的：探讨表皮黏钙素（E-cd）基因突变及蛋白表达异常在喉癌转移中的作用。方法：采用PCR-SSCP-DNA测序和免疫组化ABC方法,检测64例喉癌组织和9例正常喉组织E-cd 基因第5和第7外显子的突变及E-cd蛋白表达。结果：64例喉癌组织中,E-cd基因第5和第7外显子的突变率分别为7.8% (5/64) 和9.4% (6/64),基因突变随喉癌临床分期的提高而有增加的趋势,并与淋巴结转移间有密切相关性(P<0.05)。正常喉组织中可见有功能蛋白的表达,在喉癌组织标本中,E-cd呈现异型性表达。染色强度随病理分级提高而减弱趋势。在有淋巴结转移组中,E-cd表达多为阴性或弱阳性,与无转移组比较差异显著(P<0.05)。结论：E-cd基因突变及蛋白表达异常可能在喉癌发生及淋巴结转移过程中起作用。     

血清MUC1、MUC2及MUC5AC表达与胃癌的关系

目的:检测胃癌患者血清中MUC1、MUC2及MUC5AC含量,探讨与胃癌的关系。方法:制备MUC1、MUC2及MUC5AC黏蛋白芯片,免疫荧光检测,采用CEA作为指示指标,对30例胃癌患者及30例健康人进行黏蛋白血清水平的检测。结果:胃癌组三种黏蛋白血清水平增高,两组间差异显著(P<0.01)。MUC1的阳性表达与胃癌TNM分期相关(P<0.01),MUC2、MUC5AC的阳性表达与TNM分期无关(P>0.05)。三种黏蛋白(MUC1、MUC2、MUC5AC)的表达随胃癌分化程度降低有增高的趋势。各单一黏蛋白以及黏蛋白两两之间和联合诊用于胃癌诊断的敏感性及特异性均较高,其中单一黏蛋白中,MUC1的的敏感性和特异性最好,分别达到81.5%、75.8%,联合诊断(三种黏蛋白中至少两种阳性)的敏感性和特异性达到96.0%、82.9%。结论:检测血清黏蛋白MUC1、MUC2及MUC5AC水平,可以提高胃癌诊断的敏感性及特异性,为胃癌的早期诊断提供新的思路。     

P53与端粒重复序列结合蛋白质1的体外相互作用

目的:通过分析端粒主要结合蛋白中端粒重复序列结合蛋白质1(Telomeric repeat binding protein 1,TRBP1)与P53的体外结合,探讨P53通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制.方法:谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)和人P53-GST融合蛋白经大肠杆菌表达、谷胱甘肽-SepharoseTM4B纯化后,和人乳腺癌细胞MCF-7细胞蛋白进行体外结合反应(pull down),Western blot检测反应物中P53和TRBP1的结合.融合蛋白中人P53包括野生型(1～393)、C端缺失体P53 N5(2～293)、N端缺失体P53 2C(95～393)、175单个氨基酸突变体P53 R175H(R→H).结果:聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝R250染色显示,纯化的GST和4种P53-GST蛋白纯度在90%以上,且分子量与预计的完全一致.TRBP1的Western blot显示,野生型P53和P53-R175H均能沉淀MCF-7中的TRBP1,且结合力相似,而单独的GST则无沉淀TRBP1的作用.与野生型P53和P53 R175H相比,P53 2C与TRBP1的结合力明显增加,P53 N5与TRBP1的结合力明显减弱.结论:P53和TRBP1可以直接体外结合,P53的C端(293～393)是与TRBP1结合的结构域.P53和TRBP1结构域依赖性的结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关.