钛合金颗粒对成骨细胞增殖、分化、表型表达的影响

目的　观察钛合金颗粒对成骨细胞的作用。方法　成骨细胞暴露于各种浓度的钛合金颗粒 ,用 MTT比色法检测成骨细胞增殖。免疫组化染色观察 、 型胶原、TGF- β1 :末端原位标记法和流式细胞仪检测成骨细胞凋亡。双抗夹心法测上清液中 型胶原 ,对硝基苯酯二钠盐比色法测上清液中碱性磷酸酶 ,放免法测上清液中骨钙素。反转录聚合酶链反应法 (RT- PCR)检测 型前胶原、 型前胶原 ,AL P,OCNm RNA表达。结果　钛合金颗粒可抑制成骨细胞增殖 ,浓度高的抑制更明显 ;免疫组化染色见成骨细胞 、TGF- β1 的合成减少 ,部分成骨细胞变性、产生 型胶原 ;TUNEL 检测成骨细胞凋亡发生比率为 :11.5 0 %± 3.6 7% ,Ti- 0 ,4 1.0 0 %± 14 .0 9% ,Ti- 10 ,4 7.33%± 14 .4 3% ,Ti-10 0 ;流式细胞仪检测成骨细胞凋亡发生比率 Ti- 0组 4 8h约 9.2 7% ,Ti- 10组 4 0 .8% ,Ti- 10 0组为 5 0 .4 8% ;上清液中 型胶原 ,AL P和骨钙素 (OCN)含量减少 ,RT- PCR分析其 m RNA的表达受抑制 ,少量成骨细胞出现异常的 型前胶原 m RNA表达。结论　钛合金颗粒抑制成骨细胞增殖、成骨表型表达 ,诱发成骨细胞凋亡和变性     

TGF-β1基因转染对间充质干细胞生物学行为的影响

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染对间充质干细胞(MSCs)增殖、向成软骨方向定向分化等生物学行为的调控作用及其机制。方法 体外将具有促进MSCs增殖分化及抑制多种炎性介质活性等多重生物学效应的TGF-β1基因以不同剂量转入MSCs，通过免疫组化、R3T-PCR、水貂肺上皮细胞生长抑制法、^3H-TdR、Na2^35SO4掺入法、流式细胞仪Ⅱ型胶原原位杂交及透射电镜等系列方法检测TGF-β1基因转染的瞬时和稳定表达情况，分析TGF-β1基因转染对MSCs增殖和向成软骨方向定向分化的调控及其作用机制.结果 TGF-β1基因转人MSCs能获得瞬时及稳定表述．表达产物具有生物活性；3μl脂质体介导1μg TGF-β1基因转染能获得最佳促MSCs增殖及蛋白多糖，Ⅱ型胶原合成效应；TGF-β1基因转染能显著抑制IL-1对羟脯氨酸合成的降解作用，结论 MSCs能作为基因治疗的受体细胞并可稳定高效表达具有生物学活性的TGF-β1；通过增强增殖细胞核抗原表达来提高S期细胞DNA含量，促进软骨特异性细胞外基质合成,从而促进MSCs增殖并调控其向成软骨方向定向分化、抑制多种炎性介质生物学活性以保护关节软骨．使提高关节软骨缺损的修复质量成为可能．     

骨保护蛋白基因转染成骨细胞后的表达及对其生物学行为的影响

目的 将人骨保护蛋白(OPG)基因转入体外培养的人成骨细胞,研究OPG基因在转染成骨细胞中的表达,并分析OPG基因转染对成骨细胞生物学行为的影响.方法 首先行人成骨细胞体外培养,然后用质粒peDNA3.1-hOPG转染成骨细胞,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测转染细胞OPG mRNA和蛋白质的表达.观察OPG基因转染后成骨细胞的增殖情况,对成骨细胞表达的碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)的含量进行检测,观察转基因细胞的生物学特性.结果 RT-PCR和Western blot检测结果表明在OPG基因转染后,成骨细胞表达的OPGmRNA和蛋白质含量均较未转染组增加.在OPG基因转染后,可明显促进成骨细胞的增殖,成骨细胞表达的ALP和BGP的含量均显著上升,而且在量效图中可以观察到随着OPG基因转染剂量增加,其增加程度也增加.结论 成骨细胞可作为转基因的受体细胞,成功表达目的 基因.转染OPG基因的成骨细胞可稳定、高效的表达OPG.OPG基因转染成骨细胞生物学特性稳定,而且可明显促进转染成骨细胞的成骨特性的表达.     

人arresten基因的真核表达及其对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 真核表达人arresten蛋白,并观察其对血管平滑肌细胞体外增殖的影响.方法 用脂质体介导,将含有人arresten基因的重组质粒pSecTag2-AT转染COS-7细胞;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞目的 基因mRNA表达;收集浓缩转染48 h细胞上清液,Western blot检测目的 蛋白的表达.离体培养大鼠血管平滑肌细胞,用CCK-8法检测转染细胞上清液对平滑肌细胞体外增殖的影响.结果 重组质粒pSecTag2-AT转染的COS-7细胞有目的 基因mRNA的表达;转染细胞上清液中有arresten蛋白的表达.细胞体外增殖分析显示转染细胞上清液可显著抑制血管平滑肌细胞的体外增殖(F=40.154,P＜0.01).结论 真核表达的人arresten蛋白能有效抑制血管平滑肌细胞的体外增殖,为日后开展抑制血管新生内膜增生的基因治疗奠定了基础.     

反义转化生长因子-β1基因对骨肉瘤细胞表达转移相关因子的影响

目的　探讨反义转化生长因子(TGF) β1基因转染对骨肉瘤细胞MG 63表达基质金属蛋白酶(MMPs)和尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA )等肿瘤转移相关因子的影响。方法　将反义TGF β1基因转染MG 63 ,G418筛选转染细胞后,采用Northernblot法检测转染细胞MMP 2、MMP 9和uPA的表达情况。结果　反义TGF β1基因转染骨肉瘤细胞上清培养的Mv 1 Lu细胞增殖活性为0 .975±0 .0 16(对照组1.0 3 2±0 .0 2 7,P >0 .0 5 ) ;Northernblot法检测显示MMP 2和uPAmRNA的表达明显降低。结论　通过反义基因技术阻断骨肉瘤细胞TGF β1自分泌环,在降低肿瘤细胞TGF β1表达的同时,也降低了转移相关因子MMP 2、uPA的表达,从而可能抑制肿瘤的侵袭和转移     

Smad7在肌腱粘连组织中的表达及对肌腱成纤维细胞纤维化的作用

[目的]通过观察人肌腱粘连组织中Smad7的表达情况,并在TGF-β1诱导的肌腱成纤维细胞(TDFs))中沉默或过表达Smad7,观察细胞纤维化相关指标的变化,讨论Smad7在肌腱粘连中的作用及调控机制。[方法]收集肌腱粘连组织及正常肌腱腱周组织,Western blotting检测Smad7蛋白含量。设计并合成针对Smad7基因编码区的siRNA,同时构建Smad7基因表达载体,经脂质体转染至TDFs细胞,Real Time-PCR检测胞内Smad7基因含量,Western-blot检测细胞中Smad7蛋白表达;使用TGF-β1诱导转染后TDFs细胞,CCK-8检测细胞增殖活性变化,Western blotting检测纤维化相关的蛋白指标。[结果]与正常腱周组织比较,肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少。siRNA及Smad7基因过表达载体转染TDFs,可以明显抑制或者上调细胞内Smad7基因含量及蛋白表达,与未转染组比较,差异均有统计学意义(P0.05);TGF-β1诱导的TDFs细胞,可以明显增强细胞增殖活性(P0.01,vs未诱导组),siRNA转染后,TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标上升的趋势进一步增强,Smad7基因表达载体转染则使得TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标增强的趋势得到明显抑制,基因干预且诱导组与只诱导组细胞活性和蛋白含量相比较,差异均有统计学意义(P0.05)。[结论]肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少,提示肌腱粘连发生过程中Smad7表达受抑制;Smad7基因过表达可以抑制TGF-β1诱导TDFs细胞纤维化。     

转染HGF基因对肝细胞的生物学效应

目的探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)基因对肝细胞生长增殖能力的影响。方法通过脂质体介导法，将HGF基因导入肝细胞中。用荧光显微镜以及原位杂交观察到HGF基因表达。采用检测细胞生长曲线、Ki-67蛋白和嗜银蛋白免疫组化观察肝细胞生长增殖能力及DNA合成能力的变化。结果荧光显微镜观察可见到绿色荧光蛋白的表达，用原位杂交方法进一步证实了HGF蛋白在细胞中的表达。细胞生长曲线显示，转染HGF基因的肝细胞增殖速度明显增快，Ki-67蛋白和嗜银蛋白表达明显增多，提示转导HGF基因使肝细胞增殖活性增加。结论本实验显示转染的HGF可表达并有促细胞分裂活性。为进一步了解HGF分子生物学特性及治疗应用提供了理论基础。     

脂肪特异性蛋白27基因抑制大鼠肝星状细胞增殖活化

目的 探讨脂肪特异性蛋白27(Fsp27)基因对活化态肝星状细胞(HSCs)增殖、活化的影响及其对纤维化相关基因的调节作用.方法 提取HSCs并培养.用实时定量PCR技术检测原代HSCs及活化HSCs中的Fsp27基因表达.构建携带Fsp27目的基因的慢病毒,转染活化的HSCs并继续培养72 h.通过CCK-8比色法检测Fsp27基因对HSCs增殖的影响.Western blot检测HSCsα-肌动蛋白(α-SMA)的表达,了解HSCs的活化状态.实时定量PCR技术研究Fsp27基因对HSCs纤维化相关基因表达的影响.结果 成功分离原代HSCs,Fsp27基因在原代HSCs及活化HSCs中表达差异显著(P＜0.01).活化HSCs成功转染携带Fsp27目的基因的慢病毒后继续培养72 h,与对照组比较,HSCs的活化与增殖受到明显抑制(P＜0.05);Fsp27基因促进MMP-2的表达(P＜0.05),降低了TIMP-1及TGF-β1的表达(P＜0.05).结论 Fsp27基因具有抑制HSCs活化增殖的潜能,Fsp27基因可调节纤维化相关基因的表达.Fsp27基因的作用可能与维持HSCs静息状态细胞表型有关.     

载基因基质材料转染骨髓基质干细胞的实验研究

目的　评价载基因仿生基质材料能否转染骨髓基质干细胞 (BMSCs)并表达具有生物学活性的转化生长因子 (TGF) β1。 方法　将配体 /聚赖氨酸 /改性聚 (丙交酯 /乙交酯 )非病毒基因转染体系与TGF β1基因复合 ,制备成载基因仿生基质材料 ,用改良的Friedenstein分层离心法分离培养BMSCs。通过TGF β1敏感细胞株MV1生长抑制法检测。 结果　实验组不同时间点之活化上清均使MV1增殖受到不同程度的抑制 ,其中以第 2、3天为最强 ,与对照组比较差异有显著性(P <0 .0 5 )。结论　这种载基因基质材料既可以作为特异性地针对BMSCs的非病毒基因转染载体 ,又可以作为骨组织工程支架材料 ,可能为具有多重生物学效应的TGF β1的持续高效发挥作用提供一种崭新的方法。     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的:研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响.方法:利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响.结果:转染后,hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达.蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达,S期细胞比例和ALP活性明显增高.结论:Ad-BMP-2可高效转染hBMSC,且促进细胞增殖和成骨转化.     

转染RECK基因对肝癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨RECK基因对HepG2肝癌细胞生物学活性的影响。方法 构建真核表达载体pcDNA3-RECK，采用脂质体介导将重组质粒导人体外培养的HepG2细胞，Westernblot法检测转染前、后HepG2细胞中RECK蛋白的表达。明胶酶谱试验检测转染前、后MMP-9的表达。观察稳定转染RECK基因对HepG2细胞生物学行为的影响。结果 成功构建了RECK基因真核表达载体并建立了稳定表达的细胞株。转染后RECK基因稳定高表达，具有生物活性的MMP-9的表达显著降低。转染前、后HepG2细胞的增殖能力无明显改变，但其侵袭能力明显下降。结论 外源性的RECK基因能通过脂质体有效转染肝癌细胞，抑制MMP-9的活性，降低肝癌细胞HepG2的体外侵袭能力。     

BMP-2重组质粒转染人骨髓基质干细胞及表达蛋白的诱导活性观察

目的 构建骨形态发生蛋白-2(BMP-2)真核表达质粒，使其在人骨髓基质干细胞(hBMSCs)中表达，并观察表达产物的诱导成骨活性。方法在脂质体介导下将BMP-2基因导入hBMSCs，流式细胞仪、ALP检测和VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖、ALP活性和VEGF表达的影响。并利用转染后的培养液上清诱导小鼠成纤维细胞(L929)，检测其骨钙素、Ⅱ型胶原表达。结果 转染后细胞稳定表达BMIP-2基因，S期细胞比例增多，ALP活性和VEGF的表达明显增加。且诱导L929细胞骨钙素、Ⅱ型胶原阳性表达。结论 BMP-2重组质粒转染hBMSCs后表达目的蛋白，促进自身增殖、分化和上调VEGF的表达，并诱导成纤维细胞向成骨细胞转化，为BMP-2基因治疗奠定了实验基础。     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的：研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响。方法：利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞。BMP-2的表达。流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响。结果：转染后，hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达，S期细胞比例和ALP活性明显增高。结论：Ad-BMP-2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖和成骨转化。     

重组人IL-1Ra与TGF-β1联合基因体外转染兔膝关节软骨细胞的研究

背景:多基因联合转染具有增强功能基因协同效应、消除短板差异等作用,因而目前被受到广泛重视。目的:观察以逆转录病毒(RV)为载体,介导白介素-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)基因单独转染及其与转化生长因子-β1(TGF-β1)基因共同转染兔膝软骨细胞后的表达,及对其增殖代谢的影响。方法:构建逆转录病毒载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP 与 PLNCX2-TGF-β1-RFP,将其转染至包装细胞 PT67,待形成阳性克隆后扩增培养,收集病毒上清,并计算病毒上清滴度。将体外培养的软骨细胞分为空白转染组、PLNCX2空载体转染组、IL-1Ra单基因转染组及IL-1Ra +TGF-β1双基因转染组。酶联免疫吸附分析法(ELISA)进行瞬时基因表达(细胞转染后48 h)及稳定基因表达(筛选后4周)的检测;免疫组织化学染色法检测各组IL-1Ra、TGF-β1及Ⅱ型胶原的表达;流式细胞仪检测各组细胞生长周期比例。结果:PLNCX2-IL-1Ra-GFP 与 PLNCX2-TGF-β1-RFP 转染包装细胞后分别有绿色荧光与红色荧光表达;空白组与PLNCX2空载体转染组的上述指标无统计学差异(P>0.05);ELISA检测示基因转染组有明显基因表达;与空白组及PLNCX2空载体转染组相比,双基因转染组IL-1Ra、TGF-β1、Ⅱ型胶原含量明显提高,IL-1Ra基因转染组IL-1Ra含量提高明显,但TGF-β1、Ⅱ型胶原含量提高不明显;双基因转染组软骨细胞位于S期的比例明显增高,与其他组比较有统计学差异(P<0.05)。结论:逆转录病毒载体构建成功,基因转染软骨细胞后可获得稳定表达,双基因转染的软骨细胞生物学活性优于单基因转染,为基因治疗骨关节炎(OA)的研究提供实验基础。     

转Fas基因对膀胱癌细胞的作用

目的　探讨Fas基因转染对膀胱癌细胞的作用。　方法　将人FascDNA通过脂质体导入膀胱癌细胞EJ中 ,并利用Northernblot、原位杂交、流式细胞术检测细胞的FasmRNA和分子表达。用流式细胞仪、DNA梯形带和MTT法分析顺铂对转染前后的EJ细胞抑制增殖和诱导凋亡的能力。　结果　Fas基因转染可明显增强膀胱癌细胞EJ的Fas表达 ,顺铂对转染后的EJ细胞抑制细胞增殖和诱导凋亡的能力明显增强。　结论　转染的Fas基因可显著上调膀胱癌细胞EJ的Fas表达 ,促进细胞凋亡 ,联合应用Fas基因转染和顺铂可获得协同的细胞毒作用     

siRNA干扰ADAMTS2基因对肝星状细胞的影响

目的 探讨siRNA干扰大鼠含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶2(ADAMTS2)基因后对大鼠肝星状细胞(HSC)生物学特性的影响及其机制,评估ADAMTS2基因作为一种新的靶向基因在抗肝纤维化治疗中的应用前景.方法 设计并化学合成3对针对大鼠ADAMTS2 mRNA 2237、2597及690位点的siRNAs.用筛选出的抑制效率最高的siRNA体外转染HSC-T6,应用实时PCR、Westem blot及MTT等方法研究沉默ADAMTS2基因对大鼠HSC活化、增殖等生物学特性及对基因ADAMTS2、α-SMA、COL1α1、COL(I)、TGF-β1、MMP-2和TIMP-3表达的影响.结果 在相同注射剂量(50 nmol/L)及时间(48 h)下,2237位点的siRNA-ADAMTS2具有最高的抑制效率;能显著抑制ADAMTS2基因mRNA和蛋白表达(抑制率80％以上);显著抑制COL(I)、α-SMA和TGF-β1在HSC中的表达.HSC的增殖能力显著降低.结论 化学合成的siRNA-ADAMTS2干扰载体能有效抑制ADAMTS2基因在大鼠HSC-T6细胞系中的表达,抑制HSC的活化和增殖,同时显著降低COL(I)、α-SMA和TGF-β1的表达,具有潜在的阻止甚至逆转肝纤维化的作用.ADAMTS2可能是抗肝纤维化治疗的有效靶位,抑制ADAMTS2在肝脏的表达可能是一种有效的抗肝纤维化治疗策略.     

腺病毒介导的BMP-2基因诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞定向分化

目的探讨人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因通过腺病毒转染青山羊脂肪间充质干细胞(ADSCs)的可行性及其向成骨细胞定向分化的能力。方法取麻醉状态下青山羊腹股沟脂肪组织,经体外分离培养获得ADSCs,转染以腺病毒介导的人BMP-2基因。倒置相差显微镜观察细胞形态,MTT法检测ADSCs生长增殖情况,免疫细胞化学法对ADSCs细胞进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定,SABC法检测ADSCsⅠ型胶原的表达,通过RT-PCR、Western blot法检测BMP-2基因的表达水平。结果转染人BMP-2基因的ADSCs形态规则;细胞生长速度快,且随培养时间的延长逐渐增多(P0.05);成骨诱导后,转染组细胞ALP活性和Ⅰ型胶原表达强度明显高于未转染组(P0.05);转染组ADSCs BMP-2基因m RNA水平和蛋白含量均明显强于未转染组(P0.05)。结论经腺病毒介导的人BMP-2基因转染的青山羊ADSCs在体外诱导培养中可以向成骨细胞定向分化,并保持较强的增殖能力;转染后细胞BMP-2目的基因表达增高。     

雌激素受体β1上调p53基因表达促进乳腺癌细胞的凋亡

目的观察外源性雌激素受体β1(estrogen receptor β1,ERβ1)基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后对p53基因表达和细胞凋亡的影响,探讨ERβ1在乳腺癌中的生物学作用。方法应用脂质体法将ERβ1真核表达质粒转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,分别用荧光实时定量PCR法、Western blot法检测转染前、后细胞中ERβ1与p53 mRNA和蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞生长曲线显示转染前、后细胞增殖能力的改变。结果转染外源性ERβ1真核表达质粒后,MDA-MB-231细胞中ERβ1及p53 mRNA和蛋白表达明显增强(P0.01);细胞凋亡率明显增加(P0.01),增殖能力明显减弱(P0.01)。结论在乳腺癌中,ERβ1可以通过上调p53基因表达促进乳腺癌细胞凋亡,从而抑制乳腺癌细胞的增殖。     

转化生长因子－β1基因修饰的不成熟树突状细胞的免疫生物学功能

目的 探讨转化生长因子(TGF) -β1基因转染后树突状细胞(DC)细胞表型和免疫生物学功能的变化.方法 利用大鼠骨髓细胞诱导、培养不成熟树突状细胞(imDC),以脂质体介导的pIRES2-EGFP-hTGF-β1转染imDC细胞,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot法检测转染后各组imDC培养上清TGF-β1蛋白表达;通过流式细胞法、免疫细胞化学法及混合淋巴细胞反应检测各组imDC表面分子的分子表型和免疫功能变化.结果 TGF-β1基因转染的imDC上清中均检测相应蛋白的高表达,TGF-β1基因转染组TGF-β1蛋白表达(252.75±11.31) μg/L均高于mDC组(11.19±2.29) μg/L、imDC组(35.18±6.17) μg/L、空载体组(33.67±4.61)μg／L;基因转染组的表面分子CD86、CD80及MHCⅡ表达明显低于空载体组和无任何转染的imDC组;基因转染组的imDC对T的增殖研究结果显示有显著抑制作用,低于空载体和无任何转染的imDC组.结论 TGF-β1基因成功导人imDC,基因改造的imDC不但能维持不成熟状态同时分泌免疫耐受抑制蛋白,致免疫耐受作用显著增强.     

血管内皮生长因子重组腺病毒转染鼠骨髓基质细胞及其产物促内皮细胞增殖的研究

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子165(VEGF165)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后对VEGF基因的转录、表达及其产物生物活性的影响。方法体外培养4只大鼠骨髓基质细胞,用携带VEGF165基因的重组腺病毒转染培养细胞;通过逆转录聚合酶链反应、免疫印记法和酶联免疫吸附法检测VEGF在转染细胞内的转录、表达和细胞外分泌情况;通过血管内皮细胞增殖实验测定转染VEGF165基因后的BMSCs培养上清中VEGF蛋白的生物活性。结果腺病毒介导VEGF165基因转染BMSCs后可以获得有效的转录及表达,其分泌于培养上清中的表达产物可明显促进大鼠主动脉血管内皮细胞的增殖(P<001),具有很强的生物学活性。结论腺病毒可安全、有效地转染BMSCs,VEGF165基因转染的鼠BMSCs可有效表达具有生物活性的VEGF蛋白。