精子发生障碍患者精蛋白基因5′端及3′端核基质结合区的研究

运用PCR、PCR－SSCP、PCR产物直接测序等方法对61例少精子症及无精子症患者的精蛋白基因5′端及3′端核基质结合区（Matrix attachment region,MAR）进行了突变筛查。结果发现2例少精子患者在5′端核基因结合区存在PCR－SSCP带型变异,经测序分析发现其碱基序列存在一杂合性改变。     

精子发生的基因调控

在精子发生的整个过程中,基因的表达和调控都起着至关重要的作用。在有丝分裂阶段的精原细胞中有405个基因表达;精母细胞中无DNA复制,DNA修复至关重要,许多基因参与这个过程中的基因重组与DNA修复,有442个基因高表达于精母细胞;在减数分裂后的精子细胞中有175个基因表达[1]。本文对调控精子发生的常见基因作一综述。一、正常精子发生过程由精原干细胞经过一系列发育阶段发展成为精子的过程称为精子发生。哺乳动物的精子发生可分为3个阶段:①精原细胞经过数次有丝分裂,增殖分化为初级精母细胞;②初级精母细胞经过减数分裂(中间经过短暂的…     

LM23基因沉默引起大鼠睾丸生精细胞凋亡

目的 研究LM23基因敲低后生精细胞的凋亡状况及与凋亡相关基因表达改变.方法 用TUNEL方法检测睾丸细胞的凋亡情况,用大鼠全基因组表达谱芯片检测LM23基因敲低后凋亡相关基因的表达改变.结果 TUNEL结果显示,LM23基因敲低侧大鼠睾丸生精小管内大量生精细胞发生凋亡.大鼠全基因组表达谱芯片分析结果显示,许多促凋亡基因如Bcl-2家族的促凋亡基因表达上调,而抗凋亡基因如Faf1和Zfp91基因的表达明显下调.结论 敲低大鼠的LM23基因,启动了Bcl-2家族介导的线粒体凋亡途径,引发了生精细胞发生大量凋亡.     

差异显示法克隆精子发生相关基因

目的 :通过差异显示技术克隆精子发生相关基因 ,并对这些基因进行初步的研究。　方法 :应用mRNA差异显示技术 ,对唯支持细胞综合征病人、生精阻断在精原细胞的病人和正常人的睾丸组织进行基因表达图谱分析 ,获得在唯支持细胞综合征病人的睾丸组织中表达缺失、生精阻断在精原细胞病人和正常人中表达的一些差异片段 ,并对这些片段进行克隆和测序 ,同时与GenBank中的EST数据进行BLAST分析。　结果 :通过DDRT PCR获得了 17个不同的差异表达的EST片段 ,同时与GenBank中的数据进行BLAST分析 ,发现其中有 3个片段未见有同源性。　结论 :DDRT PCR在克隆精子发生相关基因研究中具有可行性 ,获得的 3个EST可能是与精子发生有关的新基因的EST或者某些基因的新的EST。     

铅致大鼠睾丸细胞凋亡的实验研究及临床意义

目的探讨铅致大鼠睾丸生精细胞凋亡及其机制。方法40只成年雄性Wistar大鼠随机均分为4组:对照组,低、中、高剂量实验组。实验组分别腹腔注射醋酸铅5、10、20mg/kg体重,对照组注射等体积生理盐水,3周后手术取睾丸,用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(Tunel法)及免疫组化技术检测睾丸组织生精细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果3周后,中、高剂量组细胞凋亡及Bax基因表达较对照组差异有显著性(P<0.01),低剂量组较对照组无显著性。3个实验组的Bcl-2基因表达较对照组差异有显著性,且各组间亦有显著性(P<0.01)。结论铅负荷至一定程度时可致大鼠生精细胞凋亡,且呈一定量效关系,这种作用可能与Bcl-2基因低表达和Bax基因高表达有关。     

胱蛋白酶抑制剂相关的附睾精子发生基因的调节和功能

CRES(cystatin relatedepididymalspermatogenic,胱蛋白酶抑制剂相关的附睾精子发生 )蛋白是胱蛋白酶抑制剂(cystatin)超家族中家族 2的一个亚类。然而 ,与cystatinC的广泛性表达不同 ,Cres基因只在分裂后的生殖细胞、附睾头部近端和腺垂体促性腺激素细胞中表达。cystatin对C1半胱氨酸蛋白酶抑制作用的发挥必须有 3个共有位点的参与 ,而CRES蛋白缺少其中的 2个位点。因此 ,CERS在生殖系统和神经内分泌系统中的功能也许是独特的和组织特异性的。本文概述了以下方面的研究 :①Cres基因启动子及其转录调节蛋白相关的可能对Cres的组织特异性表达有重要作用的DNA结合位点。②CRES蛋白的生物学功能。Norethern印迹法、凝胶转移分析和瞬时转染实验均表明 ,附睾和促性腺激素细胞中主要表达C EBP家族中的C EBPβ(CCAAT 增强子结合蛋白 ) ,且C EBPβ对于Cres基因在这两个组织中的高表达是必不可少的。另外 ,构建了表达氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的转基因小鼠 ,CAT报告基因由Cres基因 5′端 1 6kb的启动子所调控。分析显示 ,CATmRNA仅在生殖细胞中表达 ,说明Cres 5′端 1 6kb的侧翼区含有调控CAT在睾丸中表达的DNA序列 ,而缺乏指导CAT在附睾中表达的序列 ,或者此1 6kb的DNA片段存在Cres的负调节成分。最后 ,     

青春期前苯甲酸雌二醇暴露对大鼠睾丸基因表达谱的影响

目的研究青春期前苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate,EB)暴露对SD大鼠睾丸基因表达谱的影响。方法 12只21日龄雄性SD大鼠,随机分为EB[100.0μg/(kg·d)]暴露组(AEb组)和对照组(AC组)。于青春期前,即出生后第22天(PND 22)每日皮下注射EB[100.0μg/(kg·d)],共14d,对照组仅注射玉米油(溶媒)。于性成熟后(PND 64)处死大鼠,采用Affymetrix大鼠基因组230 2.0芯片研究大鼠睾丸基因表达谱变化,选择部分基因采用定量RT-PCR验证芯片实验结果。结果与对照组相比,AEb组有2 740个基因表达变化,其中下调基因1 043个,上调基因1 697个。聚类分析发现差异基因主要包括类固醇激素合成、结合和代谢相关基因,精子发生和精子细胞发育相关基因,DNA复制和修复相关基因,蛋白质合成和修饰相关基因,以及免疫反应、细胞粘附、细胞骨架、信号转导、转录因子、氧化应激和凋亡相关基因等。实时定量RT-PCR结果与基因芯片结果基本一致。结论青春期前EB暴露对SD大鼠睾丸基因表达谱有影响,基因组学的改变可能进一步影响睾丸组织的发育与功能。     

肾脏基因表达数据库的建立与肾脏衰老相关基因表达谱研究

目的：运用基因芯片技术及公共数据库,首次建立大鼠肾脏基因表达谱数据库,比较成年及老年大鼠肾脏基因表达变化,筛选肾衰老相关基因,方法：将代表8192条基因的PCR产物中CartesianPixsys7500点样仪按微矩阵排列点样于Dako玻璃片,将等量的成年大鼠肾脏组织和衰老大鼠肾组织mRNA分别用cy-3,cy-5逆转录荧光标记,制作cDNA探针,混合后与上述表达谱芯片进行杂文,Scan Array3000扫描仪扫描杂交信号荧光强度,ImaGENE3.0软件分析扫描结果,与公共数据库比较,建立大鼠肾脏表达谱数据库,结果：在进入研究的8192条基因中,1245条基因（1．5％）在衰霉素 大鼠肾脏组织中有表达差异（1．7倍以上）,在老年大鼠肾组织中表达增加的基因有71条,其中16条（22．5％为应激反应相关或炎症相关基因,17条（23．9％）为细胞外基质代谢／细胞骨架／肿瘤相关基因,在衰老大鼠肾组织表达下降的基因有53条,其中9条（16．9％）为能量代谢相关基因,12条（22．6％）为蛋白质合成／代谢相关基因,6条（11．3％）为细胞周期／有丝分裂相关基因,4条（7．5％）为DNA／RNA损伤修复基因,3条（5．6％）为离子转运相关基因,结论：肾脏衰老的基因表达特征表现为应激与炎症反应讥进,细胞外基质代谢失调及肿瘤相关基因表达活跃,另一方面,有丝分裂调节下降,DNA／RNA修复能力,蛋白合成及肾脏离子转运能力下降,上述转录水平的变化与衰老肾脏的病理生理特征相符合。     

可控性Speedy A基因表达转基因小鼠模型的建立鉴定和表型分析

目的建立基于Tet-On系统诱导表达的Speedy A基因RNA干扰转基因小鼠模型,探讨Tet-On系统在研究精子发生相关基因中的应用,研究Speedy A基因下调对精子发生的影响。方法体外实验筛选下调Speedy A基因表达的有效干扰片段,Gateway技术构建包含有效干扰片段和四环素反应元件(TRE)的质粒(pRP.EX2d-TREshSpdya),受精卵显微注射该质粒建立转基因小鼠并筛选到纯合子,然后与四环素调控的反式激活子(rtTA)转基因小鼠杂交,筛选TRE和rtTA双阳性的小鼠为四环素诱导的Speedy A-RNA干扰转基因小鼠模型,喂食强力霉素(Dox)诱导RNA干扰片段的表达下调Speedy A基因的表达;实时荧光定量PCR法检测模型组小鼠与喂食强力霉素的正常小鼠(对照组)Speedy A的表达差异;HE染色观察睾丸组织形态学变化,TUNEL法检测小鼠睾丸组织的细胞凋亡情况。结果模型组小鼠Speedy A基因的表达量与对照组小鼠的表达量相比下降26%;模型组小鼠睾丸组织发生异常的生精细胞凋亡。结论成功建立了基于Tet-On系统诱导表达的可控性Speedy A-RNA干扰转基因小鼠模型,说明可以基于Tet-On系统在体研究精子发生相关基因的功能;Speedy A基因表达下调可使生精细胞发生异常凋亡。     

LM23，Speedy／Ringo家族的新成员，处于生与死的十字路口

LM23是本实验窒发现的一种大鼠睾丸特异表达基因。本研究的目的在于进一步研究LM23的生物学功能。本研究使用了PROSITE~I]BLAST等生物信息学工具。为了给LM23进行亚细胞定位,通过免疫兔子,获得LM23特异的多克隆抗体。从大鼠睾丸组织克隆出LM23基因,并在大肠杆菌中表达LM23融合蛋白。使用LM23基因降调大鼠动物模型,通过基因芯片和免疫组织化学方法,分析LM23的生物学功能。结果显示,LM23属TSpeedy／Ringo家族。LM23可能调控精子发生过程中细胞周期G1／S期和G2／期转换。精子发生过程中,LM23降调可能同时激活了Fas—FasL通路和线粒体通路。这些新发现说明,LM23具有多种功能,这些功能对生精细胞的生与死的过程都具有重要作用。     

补肾活血方对实验性精索静脉曲张大鼠睾丸Bcl-2、Fas、FasL表达的影响

目的观察精索静脉曲张模型大鼠睾丸组织凋亡相关基因Bcl-2、Fas与FasL的表达情况，以及补肾活血方对这些基因表达的影响。方法将50只3月龄雄性SD大鼠先随机抽出10只为假手术组，其余40只大鼠采用肾静脉缩窄法建立精索静脉曲张病理模型，造模完成后再随机均分为模型组、补肾活血方低剂量组、中剂量组、高剂量组。造模完成后48d开始给药，连续给药60d，用免疫组织化学法检测各组大鼠睾丸组织凋亡相关基因Bcl-2、Fas、FasL的表达。结果模型组大鼠睾丸组织Bcl-2蛋白表达下降，Fas、FasL蛋白表达上升：补肾活血方低、中、高剂量组睾丸组织Bcl-2蛋白表达显著上升，Fas、FasL蛋白表达显著下降。结论补肾活血方可上调抑凋亡基因Bcl-2的表达，下调促凋亡基因Fas、FasL的表达，这可能是补肾活血方抑制生精细胞凋亡，改善精索静脉曲张性不育患者生精功能的机制。     

Survivin基因在胰腺癌组织中的表达及与bcl-2和p53蛋白表达的关系

目的探讨Survivin基因在胰腺癌中的表达及与bcl 2、p5 3蛋白表达的相互关系。方法用RT PCR法检测 4 9例胰腺癌、5例慢性胰腺炎和 12例正常胰腺组织中SurvivinmRNA的表达 ,免疫组织化学法检测胰腺癌中bcl 2、p5 3蛋白表达。结果SurvivinmRNA在胰腺癌中表达率为76 % ,在慢性胰腺炎及正常胰腺组织中不表达 (P <0 0 5 )。Survivin基因表达与胰腺癌的分化程度、临床分期及淋巴结转移无相关性 (P >0 0 5 )。Survivin基因表达与bcl 2蛋白表达不相关 ,与p5 3蛋白表达显著相关。结论Survivin基因在胰腺癌中过度表达 ,提示该基因对胰腺癌发生和发展起重要作用 ;抑癌基因p5 3的失活与Survivin基因的表达可能在胰腺癌的发生中起协同作用。     

弱精子症患者精核蛋白表达的检测及意义

目的研究不育症患者精核蛋白mRNA表达量的变化及意义。方法提取6例不育症患者及5例健康男性精子的总RNA,应用RT-PCR法扩增得到精核蛋白cDNA片段;提取精子总碱性核蛋白并进行SDS-聚丙酰胺凝胶电泳,检测其中精核蛋白及组蛋白的含量。结果精子中存在精核蛋白基因的mRNA;不育症患者精核蛋白的含量及精核蛋白mRNA相对含量均下降。结论精核蛋白mRNA相对含量的变化与其蛋白含量的变化一致,可能反映了精子发生过程中某些基因的表达情况。     

应用基因芯片技术研究成年男性精子的基因表达

目的:初步研究健康成人精子中基因的表达情况。方法:收集成年男性活力正常的精子,提取总RNA,以健康成人淋巴细胞总RNA作对照。两组RNA逆转录为cDNA之后,cDNA经酶切、加接头后进行RD扩增,在扩增同时分别掺入Cy3(精子)和Cy5(淋巴细胞)荧光染料标记,标记样品与自制的精子基因表达谱芯片杂交。结果:检测发现在560个基因片段中,有72个基因表达上调,321个基因表达下调,另外167个基因表达无差异。其中与基因复制、转录、翻译及调控等相关的基因表达基本属于无差异表达类型或低表达类型,而与精子发生相关的基因、精子本身的特异性抗原等基因显著高表达,精子中糖酵解相关基因表达上调,而与氧化磷酸化相关的基因则表达下调。结论:在健康成人精子中有丰富的基因表达,而且基因的表达与精子自身的功能和特点相一致。     

小鼠精子发生过程中差异表达基因LTBP-3的克隆

目的 :筛选与精子发生相关的基因。　方法 :应用改良的mRNA差异显示技术 ,对不同发育期小鼠 (1周龄至 4周龄 )睾丸精曲小管进行差异表达的研究 ,对其中一个在 1周龄小鼠中高表达的cDNA片段进行了克隆和测序分析 ,并与基因文库中的己知序列进行比较。　结果 :发现该片段与小鼠潜在转化生长因子 β结合蛋白 (LTBP 3)基因的部分序列 95 .4%同源。　结论 :LTBP 3基因在小鼠精子发生过程中可能起着重要的调控作用     

利用高通量基因芯片建立与分析单侧隐睾症睾丸基因表达谱

目的:利用高通量基因芯片技术分析单侧隐睾症睾丸组织中差异表达的基因。方法:抽提6例单侧隐睾症患者和3例正常生育男性患者睾丸组织中mRNA,反转录后,探针标记cDNA。使用高通量cDNA微阵列人类全基因表达谱基因芯片(45 034个基因)检测睾丸组织基因表达谱。差异表达基因在MAS系统中进行Path-way和GO分析。结果:Ratio>3.0或<0.33的数据项为差异表达的基因,单侧隐睾症患者睾丸生精组织中共检测到346个差异表达基因。其中上调基因60个,主要分布在1、15、5和19号染色体,集中在细胞周期、纤毛或鞭毛运动、DNA复制等聚类。下调基因286个,主要分布在1、19、16和11号染色体等,集中在精子发生和抗凋亡相关的基因聚类中。结论:单侧隐睾症涉及多功能基因表达的变化;单侧隐睾症睾丸基因表达谱的建立可为分析单侧隐睾症的遗传因素和探讨其生精功能异常的病因提供新的理论基础。     

成年大鼠睾丸Smad1和Smad5的免疫组织化学研究

目的 :探讨骨形态形成蛋白的细胞内信号传导分子Smad1和Smad5蛋白在成年大鼠睾丸内的表达。　方法 :应用免疫组织化学ABC法结合葡萄糖氧化酶 DAB 硫酸镍铵增强技术 ,检测成年大鼠睾丸Smad1和Smad5蛋白的表达和定位。　结果 :Smad1蛋白表达于大鼠睾丸精曲小管的各级生精细胞的胞质内 ,呈淡染的紫蓝色颗粒 ,胞核为阴性 ,免疫染色阳性细胞主要包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞 ;而Smad5蛋白阳性染色不明显 ,只有睾丸间质细胞呈弱阳性反应 ,免疫反应阳性物质主要定位于细胞质。　结论 :Smad1蛋白主要表达于睾丸精曲小管各级生精细胞 ,Smad5蛋白表达于间质细胞 ,为揭示TGF β超家族在精子发生中的分子机理提供了直接证据。     

Bcl-2基因与大肠癌

Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的关键调节因子,其表达的改变不仅影响DNA损伤细胞或周期异常细胞的正常凋亡,还影响肿瘤细胞自身的凋亡,还常与肿瘤的形成及细胞对化疗药物耐药性的形成有关,Bcl-2在肿瘤细胞中有不同程度的表达。1 Bcl-2基因及蛋白的特性Bcl-2基因位于18q21,由230kb组成,含3个外显子,3′端与5′分别有5.3kb和1.4kb的非翻译片段。在特异性的染色体易位中,18号染色体上Bcl-2基因易位至14号染色体q32的免疫球蛋白     

雷公藤多甙抑制大鼠精子发生的研究

目的探讨雷公藤多甙对大鼠精子发生的抑制作用及其可能的信号通路。方法成年雄性大鼠给予雷公藤多甙(16 mg/kg)灌胃,每日1次,在2及6周检测血清睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和可的松水平;光镜观察睾丸组织的形态学变化;原位末端标记法(TUNEL)观察睾丸生精细胞凋亡;免疫组织化学法观察凋亡通路相关蛋白Bax/Bcl-2的表达。结果给药组与对照组相比,性激素、肾上腺皮质激素均无显著变化(P均>0.05);给药2周后精子数下降和畸形率上升(P<0.05),给药4和6周精子数下降和畸形率升高更显著(P<0.001);组织学检查给药组大鼠生精小管内各级精母细胞和精子细胞数明显减少,生精细胞排列紊乱,原始精原细胞和支持细胞(Sertoli细胞)未见明显改变。与正常对照组相比,生精小管内生精细胞凋亡显著增加(2周P<0.05,4和6周P<0.001)。凋亡相关蛋白Bax表达明显上调,Bcl-2表达无显著差异。结论雷公藤对大鼠精子发生的抑制作用表现为增加生精细胞凋亡,导致精子计数下降,精子的畸形率升高。雷公藤多甙使睾丸Bax表达增加,与诱导生精细胞凋亡相关,可能是相关的信号通路之一。进一步研究雷公藤多甙作用的分子信号机制有助于今后降低剂量、减少毒副作用,探讨其作为一种安全的男性避孕药可能性。     

少、弱、畸精子症相关遗传基因研究进展

目前研究发现与精子发生相关的基因约2 300个,其表达在调控精子的发生过程中起着重要的作用。近年来,少、弱、畸精症的相关遗传基因成为研究的热点,相关研究试图从分子水平上探讨少、弱、畸精症发生的机制,并取得了一些成果,一些基因如GSTM1、DNMT3L和CYP1A1可能与少精症的发生有关;一些基因如CATSPER1、CRISP2、SEPT4、TCTE3、TEKT4和DNAH1可能与弱精症的发生有关;一些基因如DPY19L2、AURKC,可能与畸精症的发生有关。这些相关的基因研究为少、弱、畸精症的发病机制提供了可能的分子基础,同时也为探索新的诊治技术提供了新的思路。本文就少、弱、畸精症的部分相关遗传基因的最新研究进展作一综述。