p38 MAPK通路在佛波酯诱导人绒癌JAR细胞体外侵袭中的作用

目的研究细胞内p38 MAPK信号传导通路在人绒癌JAR细胞体外侵袭中的作用。方法用ELISA法测定JAR细胞中p38 MAPK的活性变化;用Transwell细胞侵入系统检测细胞的侵袭作用;用MTT法评价细胞生长状况。结果佛波酯(PMA)呈浓度依赖性地激活JAR细胞中p38 MAPK。PMA能促进人绒癌JAR细胞的体外侵袭作用,而p38特异性抑制剂SB203580抑制了JAR细胞的侵袭能力。结论p38 MAPK通路在人滋养细胞的侵袭行为以及人绒癌的形成中具有重要作用。p38 MAPK抑制剂可能会为人绒癌的防治提供新的途径。     

佛波酯对人肝癌细胞胞液和膜性组分中3类蛋白激酶的早期效应

研究佛波酯（ＰＭＡ）对人肝癌细胞７７２１胞液和膜性组３类蛋白激酶（ＴＰＫ、ＰＫＡ、ＰＫＣ）的早期（５－６０ｍｉｎ）效应。采用体外细胞培养和蛋白激酶的同位素标记底物测定法。结果ＰＭＡ在３０ｍｉｎ内中促进ＰＫＡ由膜向胞液的转位和ＰＫＣ由胞液向膜的围位，并能迅速促进胞液ＰＫＣ的下降，但膜性ＰＫＣ的下降发生在３０ｍｉｎ的活性高峰以后，６０ｍｉｎ时膜性ＰＫＡ和ＰＫＣ都恢复到正常水平。ＰＭＡ还使胞液ＴＰＫ持续     

丝裂原活化蛋白激酶对佛波酯诱导滋养细胞MMP-9基因表达的影响

目的 探讨佛波酯(PMA)诱导细胞滋养层细胞(CTB)MMP-9基因表达的调控机制。方法 用细胞ELISA法测定CTB细胞的蛋白激酶活性变化；用反转录聚合酶链反应检测CTB中MMP-9的基因表达。结果 100nmol／L PMA能迅速激活CTB中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)以及p38 MAPK激酶的活性。100nmol／L PMA刺激CTB引起MMP-9 mRNA表达显著增加，能被ERK或p38 MAPK的特异性抑制剂所抑制。结论 ERK和p38 MAPK可能是PMA诱导CTB中MMP-9基因表达增加的重要调节物质。     

佛波酯对促进人绒毛膜癌AJR细胞侵入机制的研究

目的探讨佛波酯(PMA)是否通过改变细胞因子的生成而影响滋养细胞的侵袭性。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测人绒毛膜癌JAR细胞与侵袭力调节有关的多种细胞因子基因表达的变化。结果JAR细胞表达肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)、转化生长因子β(TGF-β)、白细胞介素1β(IL-1β)和血管内皮生长因子(VEGF),且VEGF的表达以VEGF121和VEGF165为主,而不表达IGF-Ⅰ。100 nmol/L PMA处理细胞24 h可显著上调IL-1β、HGF、IGF-II mRNA的表达,同时抑制TGF-β2、TGF-β3 mRNA的表达,而对TGF-β1、VEGF mRNA的表达未见有明显变化。结论HGF、IL-1β、IGF-Ⅱ对滋养细胞的侵入起促进作用,而TGF-β2、TGF-β3具有抑制效应。说明丝裂原PMA可能通过调节这几种细胞因子的自分泌机制,从而增强JAR细胞的侵袭能力。     

佛波酯慢性处理对大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C表达的影响

目的观察佛波酯（PMA）慢性处理大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C（PKCs）表达的影响。方法原代培养大鼠m管平滑肌细胞,①按照PMA处理浓度将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMAI、5、10μmol／L组,各组细胞均处理4h;②按照PMA处理时间将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMA1、4和24h组,PMA组的药物浓度均为10μmol／L。采用Western blotting技术榆测各亚型PKCs蛋白的表达。结果PMA浓度〈10μmol／L处理细胞时间〈4h不影响PKC—α的表达（P〉0．05）,10pmlol／LPMA处理24h能抑制PKC—α的表达（P〈0．05）;PMA浓度〉5μmol／L处理细胞时间〉4h可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）,PMA浓度〈5μmlol／L处理细胞时间〈4h对PKC-δ的表达无显著影响（P〉0．05）,10μmol／LPMA处理细胞1h即可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）;PMA浓度〉5pμmol／L处理细胞时间〉4h可以明显抑制PKC-θ的表达（P〈0．01）;10μmol／L的PMA处理细胞24h对PKC．∈的表达无明显影响（P〉0．05）。结论PMA慢性处理大鼠血管平滑肌细胞可抑制传统型PKC—α和新型PKC-δ、ε、θ的表达,对非典型PKC-ζ的表达没有影响。     

佛波酯对人肝癌细胞胞液和膜性组分中3类蛋白激酶的早期效应

研究佛波酯（PMA）对人肝癌细胞7721胞液和膜性组分中3类蛋白激酶（TPK、PKA、PKC）的早期（5～60min）效应。采用体外细胞培养和蛋白激酶的同位素标记底物测定法。结果：PMA在30min内可促进PKA由膜向胞液的转位和PKC由胞液向膜的转位，并能迅速促进胞液PKC的下降，但膜性PKC的下降发生在30min的活力高峰以后。60min时膜性PKA和PKC都恢复到正常水平。PMA还使胞液TPK持续升高，高峰在5min，而使膜性TPK先降低，40min后才明显升高。结论：PMA对蛋白激酶的早期作用相当多样化，不单是通过受体PKC起作用。     

佛波酯对促进人绒毛膜癌AJR细胞侵入机制的研究

目的：探讨佛波酯（PMA）是否通过改变细胞因子的生成而影响滋养细胞的侵袭性。方法：用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测人绒毛膜癌JAR细胞与侵袭力调节有关的多种细胞因子基因表达的变化。结果：JAR细胞表达肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF－Ⅱ）、转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素1β（IL－1β）和血管内皮生长因子（VEGF），且VEGF的表达以VEGF121和VEGF165为主，而不表达IGF－I。100nmol/L PMA处理细胞24h可显著上调IL－1β、HGF、IGFⅡ mRNA的表达，同时抑制TGF－β2、TGF－β3 mRNA的表达，而对TGF－β1、VEGF mRNA的表达未见有明显变化。结论：HGF、IL－1β、IGF－Ⅱ对滋养细胞的侵入起促进作用，而TGF－β2、TGF－β3具有抑制效应。说明丝裂原PMA可能通过调节这几种细胞因子的自分泌机制，从而增强JAR细胞的侵袭能力。     

ERK1/2 及p38通路调节P2Y受体介导的前列腺癌细胞体外侵袭

目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK1／2)及p38激酶在P2Y嘌呤受体活化介导的前列腺癌细胞体外侵袭中的作用。方法 以脂质体法将负显性MAPK激酶1(KA-MEKl)及野生型p38磷酸酶(MKP-5)转染人前列腺癌细胞PC-3亚系1E8(高转移)和284(不转移)细胞,以Western印迹法检测细胞经P2Y嘌呤受体激动剂ATP刺激后ERK1／2及p38活化情况,并用体外侵袭实验检测在P2Y受体介导的前列腺癌细胞体外侵袭效应中ERK1／2及p38通路所起的作用。结果ATP可以激活ERK1／2及p38通路并促进前列腺癌细胞体外侵袭,这种侵袭促进效应可以分别被MEK1抑制剂PD98059及p38抑制剂SB203580所抑制。转染KA-MEK1及MKP-5使侵袭细胞数分别降低约40％及60％。如果加入抑制剂同时抑制ERKl／2及p38通路,细胞的侵袭能力被抑制约76％。结论 ERK1／2及p38通路在P2Y嘌呤受体活化所介导的前列腺癌细胞侵袭中起重要作用。     

佛波酯对体外培养大鼠前庭上皮PKC表达的影响

目的 观察体外培养条件下蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)在佛波酯（phogrbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导下大鼠前庭上皮的表达和分布特点。方法 取新生大鼠椭圆囊，建立体外前庭器官培养模型，采用免疫组织细胞化学的方法，以PKCβ，γ抗体为标记物，检测PMA诱导后前庭上皮PKCβ，γ的表达变化和分布特点。结果 PKCβ，γ在正常培养新生大鼠前庭上皮细胞的细胞膜及细胞质中有弱表达。PMA作用后，其表达逐渐增多，PKCβ1主要位于细胞膜，在30min时表达最强，其后逐渐减少，45min仍高于正常（P＜0．01）。PKCβ2不但位于细胞膜，而且在纤毛亦明显表达；PKCγ在PMA诱导后胞质表达增加。在毛细胞层和支持细胞层均有，主要位于毛细胞层。结论 体外前庭器官培养在PMA诱导后，PKC各亚型激活的形式及程度不同。     

p38MAPK在细胞凋亡中的作用

丝裂素活化的蛋白激酶(mitogen-activated pro-tein kinase,MAPK)级联是细胞内重要的信号转导系统,参与细胞的生长、发育、分化和凋亡等一系列生理病理过程。在哺乳动物中,细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)亚族最先被发现和克隆,并已进行了比较详细的研究。近年来又鉴定了c—Jun氨基末端激酶(c—Jun N—ter-minal kinase,JNK),ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶 l     

5-氟尿嘧啶对人绒毛膜癌细胞株JAR作用的观察

目的:观察5-氟尿嘧啶(5-Fu)对人绒癌细胞株JAR的体外作用。方法:采用MTT比色分析法,观察20、50、100μg/L 3种剂量的5-Fu对人绒癌细胞株JAR细胞的生长抑制情况;通过免疫组化法检测3种浓度5-Fu作用于JAR细胞后增殖细胞核抗原Ki67的表达情况。结果:15-Fu能抑制JAR细胞的生长,并在一定时间及浓度范围内,表现出剂量依赖性,72h内5-Fu浓度在25~100μg/L时抑制作用比较明显;2100μg/L的5-Fu作用于JAR细胞72h后细胞抑制率达73.19%,作用后增殖细胞核抗原Ki67明显下降。结论:15-Fu对人绒癌细胞株JAR细胞的生长具有抑制作用,72h内呈剂量依赖性;25-Fu抑制了人绒癌细胞株JAR细胞的增殖,细胞可能被阻滞于G0及G1期。     

4’-甲醚-黄芩素对绒毛膜癌JAR细胞内Ca2+浓度的影响

目的:探讨4'-甲醚-黄芩素对人绒毛膜癌JAR细胞的增殖抑制作用及细胞内Ca2 浓度的影响.方法:应用MTT法、流式细胞术和激光共聚焦扫描显微镜技术,体外观察该化合物对JAR细胞的影响.结果:4'-甲醚-黄芩素对JAR细胞的生长具有抑制作用.随着药物浓度与作用时间的增加,Annexin V-FITC /PI-细胞、细胞内Ca2 浓度逐渐增加,与对照组相比差异有显著性.结论:4'-甲醚-黄芩素能抑制人绒毛膜癌JAR细胞的增殖,诱导凋亡,其机制与提高细胞内Ca2 浓度有关.     

乌苯美司对JAR,SKOV3和3AO细胞体外生长的抑制作用

目的：观察乌苯美司对人绒毛膜癌和卵巢癌细胞体外生长的抑制作用。方法：应用MTT比色法观察不同浓度的乌苯美司(0．5g／L、1g／L、5g／L、10g／L、15g／L、20g／L)对人绒毛膜癌JAR细胞、卵巢癌3AO细胞和SKOV3细胞的生长抑制作用,溴乙啶和丫啶橙荧光染色荧光显微镜观察凋亡细胞DNA结构改变。结果：乌苯美司能抑制JAR细胞、3AO细胞和SKOV3细胞的生长,且对JAR和SKOV3细胞的抑制作用呈时效(r=0．412,r=0．339．P均=0.000)和量效(r=0.704,r=0．753,P均=0．000)关系、5g／L乌苯美司作用48h后荧光显微镜下见细胞染色质边聚,细胞核碎裂等凋亡改变。结论：乌苯美司通过细胞凋亡途径可抑制绒毛膜癌和卵巢癌细胞的生长。     

4＇-甲醚-黄芩素诱导绒毛膜癌JAR细胞凋亡的实验研究

目的探讨4′-甲醚-黄芩素(4-MS)对人绒毛膜癌JAR细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡的相关机制。方法应用MTT法、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞术和实时定量PCR法,体外观察4-MS对JAR细胞的影响。结果不同质量浓度(10、20、40mg/L)的4-MS对JAR细胞均有增殖抑制作用,呈剂量依赖,作用72h后其增殖抑制率分别为(14.14±0.75)%、(34.34±2.99)%、(61.11±2.99)%(P<0.01);4-MS作用72h后细胞内Ca2 浓度分别为81.3±6.7、103.3±5.9、120.7±11.0,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。40mg/L4-MS作用12、24、36h后其早期凋亡率分别为(2.36±0.19)%、(4.22±2.44)%、(7.34±0.56)%,明显高于对照组(P<0.01)。20、40mg/L4-MS作用48h后hTERT mRNA的表达量为0.05±0.01和0.02±0.01,明显低于对照组(P<0.01)。结论4-MS能抑制人绒毛膜癌JAR细胞的增殖,诱导凋亡,其机制与提高细胞内Ca2 浓度、降低hTERT mRNA的表达有关。     

雷公藤内酯醇对人绒毛膜癌细胞株JAR增殖凋亡及凋亡调控蛋白BCL-2/BAX表达的影响

目的:探讨雷公藤内酯醇(triptolide,TP)对人绒癌细胞株JAR增殖、凋亡及凋亡调控蛋白BCL-2/BAX表达的影响。方法:以体外培养的人绒癌细胞株JAR为研究对象,MTT法检测TP对细胞增殖的抑制情况;TUNEL法观察TP作用于细胞后引起细胞凋亡情况,PCR和Western blot检测TP对凋亡调控蛋白BCL-2/BAX mRNA和蛋白表达的影响。结果:随着作用浓度的增加及时间延长,TP能明显抑制JAR细胞增殖并诱导其凋亡(P<0.05);并能下调凋亡抑制蛋白BCL-2的mRNA和蛋白的表达,上调凋亡促进蛋白BAX的mRNA和蛋白表达(P均<0.05)。结论:雷公藤内酯醇在体外能抑制人绒癌细胞株JAR增殖,诱导其凋亡;凋亡调控蛋白BCL-2/BAX表达水平的变化可能是TP诱导JAR细胞凋亡的重要机制。     

p38/MAPK信号通路在高渗透压破坏角膜上皮屏障功能中的作用

目的 探讨高渗透压对角膜上皮屏障功能的影响及p38/MAPK信号通路在此过程中潜在的作用.方法 体外培养人永生化角膜上皮细胞(human corneal epithelial cells,HCEC),用不同浓度渗透压[302(正常渗透压)、350、500 mOsm/L]作用于HCEC细胞24 h,CCK-8法检测细胞增殖活性;免疫荧光检测细胞紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的表达和分布;p38/MAPK阻断剂预处理HCEC细胞前后,Western blot分别检测紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1和p38/MAPK信号通路表达及其磷酸化水平;跨膜电阻仪检测上皮细胞跨膜电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)的变化.结果 高渗透压对HCEC细胞增殖活性没有影响;免疫荧光染色可见正常渗透压组ZO-1、Claudin-1沿着细胞膜呈线性分布,而350、500 mOsm/L高渗透压组ZO-1、Claudin-1荧光信号均减弱,且细胞间紧密连接结构破坏(P＜0.05);在高渗透压下,HCEC细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1表达量明显下降(P＜0.05),p38/MAPK磷酸化水平增加(P＜0.05),上皮细胞跨膜电阻(TEER)降低(P＜0.05),而p38/MAPK阻断剂SB203580可抑制高渗透压引起的上述反应(P＜0.05).结论 高渗透压可以使人角膜上皮细胞屏障功能破坏,其机制为通过激活p38/MAPK信号通路导致紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1表达下降.     

马鞭草有效成分对人绒毛膜癌耐药细胞株JAR／VP16的逆转作用研究

目的:研究马鞭草有效成分4'-甲醚-黄芩素(4'-methylether-scutellarein,4'-M-S)对人绒毛膜癌多药耐药细胞株JAR/VP16的耐药逆转作用.方法:MTT法检测4'-M-S对JAR/VP16细胞的增殖抑制作用,确定药物逆转浓度及其对耐药细胞的逆转倍数和逆转效率;单克隆抗体酶免定量法测定耐药细胞中绒毛膜促性腺激素(hCG)分泌变化;流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡率;光镜和透射电镜观察耐药细胞形态学改变.结果:4'-M-S对JAR/VP16细胞具有明显增殖抑制作用,20 μg/ml 4'-M-S可显著逆转JAR/VP16细胞对鬼臼乙叉甙(VP16)、氨甲喋呤(MTX)及放线菌素D(ACTD)的耐受性,逆转倍数为:5.02、3.67、2.48;逆转效率为:81.19%、76.89%、64.08%;4'-M-S联合作用后,耐药细胞hCG分泌量明显下降;细胞周期阻滞于G0～G1期和G2～M期,细胞凋亡率达19.71%;透射电镜观察发现细胞质空泡化、内质网扩张、核物质浓缩边聚等早期凋亡现象.结论:4'-M-S对JAR/VP16细胞具有耐药逆转作用,可能的机制是抑制耐药细胞生长及诱导细胞凋亡.     

阻断Wnt信号通路对人绒毛膜癌细胞株JEG-3迁移及侵袭能力的影响

目的 观察阻断Wnt信号通路后,人绒毛膜癌细胞株JEG-3细胞迁移及侵袭能力的影响.方法 将人绒毛膜癌细胞株JEG-3细胞传代后,按完全随机法分为实验组和对照组,每组6孔.实验组在常规细胞培养基础上,给予外源性Wnt 信号通路阻断剂DKK-1(100 ng/mL),对照组加入同体积细胞培养基.运用蛋白印迹法(Western blot法)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测两组细胞中β-catenin、Wnt、E-cadherin、Vimentin 等蛋白及mRNA的表达;采用划痕实验、Transwell实验观测两组细胞迁移及侵袭能力的变化.结果 与对照组相比,实验组β-catenin、Wnt、Vimentin蛋白及mRNA的表达均降低,E-cadherin蛋白及mRNA的表达增高,差异均有统计学意义(P<0.05);实验组肿瘤细胞迁移及穿膜细胞数较对照组均降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 阻断Wnt信号通路可抑制肿瘤细胞上皮-间充质转化过程,进而降低人绒毛膜癌细胞株JEG-3细胞的迁移及侵袭能力.