基于性状鉴别和DNA条形码联用的小海马生药学研究

目的:采用性状鉴别和DNA条形码联用的方法对小海马药材进行生药学研究,为小海马的鉴别技术开发和遗传多样性研究提供数据支撑。方法:利用外观性状鉴别法对小海马典型性状进行研究;扩增测序小海马样品的COⅠ和16S rRNA序列,比较两个序列的碱基组成、GC含量、变异位点、信息位点等;基于MEGA 7.0中的K2P模型计算小海马的种内和种间遗传距离,NJ法构建小海马与市场常见海马品种的系统聚类树。结果:小海马最典型的性状鉴别特征为体型小,身体横向扁平,龙骨突出。14条小海马样品COⅠ、16S rRNA序列长度分别为649和573 bp,其中16S rRNA序列中的变异位点和信息位点均少于COⅠ序列。COⅠ和16S rRNA序列的最大种内遗传距离均远小于最小种间遗传距离,存在显著的条形码间隔区。NJ树结果显示COⅠ和16S rRNA序列均能将小海马与其他海马明显区分;小海马与三斑海马的亲缘关系最近。结论:COⅠ和16S rRNA序列均能将小海马与其他常见海马药材进行区分。COⅠ序列更适合作为鉴定小海马的标准条形码,16S rRNA可作为补充序列。基于性状和条形码联用的生药学研究方法能够准确提供小海马的性状和分子鉴别特征,为小海马的快速鉴定提供了新的方法,对控制和提高海马药材质量具有重要意义。     

《中国药典》收载动物药材DNA条形码鉴定研究策略与方法

动物药材应用历史悠久,是中药资源的重要组成部分。近年来动物药材混伪品、替代品不断出现,严重影响了动物药材临床应用效果和用药安全。DNA条形码技术作为一种新兴的生物鉴定方法,可对《中华人民共和国药典》收载动物药材进行快速、准确的鉴定。本文就以COI为主体、ITS2为补充的动物药材DNA条形码鉴定体系的建立、动物药材DNA条形码鉴定中的关键技术和动物药材DNA条形码鉴定数据库进行介绍,为《中华人民共和国药典》收载动物药材DNA条形码鉴定研究提供参考。     

《中国药典》中蕲蛇饮片分子鉴定方法的研究和探讨

目的：运用多种分子鉴定方法,从技术要求和标准编写方面对蕲蛇饮片现行质量标准提出建议。方法：本研究选取蕲蛇所在蝰科Viperidae蝮亚科Crotalinae的7个近缘物种和9种常见的蕲蛇伪品物种作为研究对象,采用DNA 条形码技术扩增16S rRNA序列,运用电泳检视法,根据扩增条带的有无评价模板DNA的质量;16S rRNA序列扩增产物通过双向测序,运用BioEdit软件拼接,双端对齐后剪切比对,利用MEGA 5.1软件构建邻接（NJ）系统发育树;采用蕲蛇饮片现行标准方法进行同步鉴别。结果：16S rRNA序列的电泳检视结果可有效评价蕲蛇样品的模板DNA质量,避免由于模板DNA质量不佳导致的假阴性结果的可能性;基于16S rRNA条形码序列建立的NJ树可以鉴别蕲蛇饮片及其混淆品;蕲蛇饮片现行标准方法专属性良好。结论：DNA条形码方法、现行标准方法以及NJ树三者相互结合,从不同角度对蕲蛇饮片进行真伪鉴别,有效弥补蕲蛇饮片现行标准方法的不足,为其他中药品种的分子鉴定技术的质量标准制定提供了参考。     

基于COI和16SrRNA基因的地龙药材及其混淆品的DNA条形码鉴定

目的 利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基1（COI）和16S核糖体RNA（16SrRNA）对地龙药材及常见混伪品进行分子鉴定,探讨快速、准确鉴定地龙药材及其混伪品基原物种的方法。方法 收集地龙药材的药典收载品种及其易混品种10种,提取DNA,得到其COI和16SrRNA序列。所得序列经DNAStar校正后,用MEGA6.0自带的Clustal W多重比对,除去冗余位点,比对结果经MEGA6.0分析,构建地龙药材及其混淆品的邻接（N-J）树。结果 地龙药材的正品来源参环毛蚓（Pheretima aspergillum）、通俗环毛蚓（P. vulgaris）、威廉环毛蚓（P. guillelmi）及栉盲环毛蚓（P. pectinifera）与其混淆品种间COI和16SrRNA基因序列均存在较多变异位点。由所构建的N-J系统聚类树图显示所测物种的单系性,即16SrRNA、COI可以很好的将地龙药材区别于其他混伪品。结论 所获得的COI和16SrRNA序列可作为不同状态的地龙类药材物种鉴定的分子依据,并为进一步建立地龙等动物类中药物种真实性鉴定体系奠定了重要的实验基础。     

三斑海马及其混伪品的DNA条形码分子鉴定研究

目的 建立三斑海马Hippocampus trimaculatus的COI、16 S rRNA和ATP6的条形码序列数据库,应用DNA条形码技术从分子水平快速准确鉴定三斑海马和其他正伪品海马,探讨海马属药材鉴定的新方法。方法 提取三斑海马药材的基因组DNA,PCR扩增COI、16 S rRNA和ATP6的序列并进行双向测序,所得序列采用软件Codon Code Aligner V4.2对测序峰图进行校对拼接,应用ClustalX软件进行序列比对,MAGA5.0软件计算三斑海马的种内种间遗传距离(Kimura2-Parameter,K2P),构建邻接树(Neighbor-joingtree,NJTree)聚类分析不同品种海马药材的鉴定结果。结果 获得的三斑海马线粒体COI、16 S rRNA、ATP6序列长度分别649、572、603～605 bp,其中3个条形码序列的种内变异位点碱基数分别为8、4和15,种内的变异率较小,COI、16 S r RNA、ATP6序列的平均种内K2P遗传距离0.002、0.001和0.006,均远小于三斑海马的种间K2P距离;NJ树结果显示三斑海马与其他海马均可明显区分,具有良好的单系性。结论 COI、16 S r RNA、ATP6序列作为条形码均可以鉴定三斑海马及其他混伪品海马药材,为动物类药材及其混伪品和近源物种的分子鉴定提供依据,为对保障海马临床用药安全提供了新的技术手段。     

中国动物药材DNA条形码数据库

课题组联合相关研究者开展动物药材DNA条形码分子鉴定研究,并结合分析GenBank序列,采用BLAST分析防错、系统树分析防错和Barcoding Gap检验防错等方法核验序列的可靠性,构建了中国动物药材DNA条形码数据库。该库由样品数据库、序列数据库和文献数据库组成,包含800余种动物药材和大量动物药材混伪品及密切相关物种。中国动物药材DNA条形码数据库可以通过中药材DNA条形码鉴定系统（www.tcmbarcode.cn）进行网络访问并实现未知动物样本的DNA条形码鉴定。该研究首次构建统一的中国动物药材DNA条形码数据库,对动物药材鉴定、资源可持续利用和濒危物种保护均有重要意义。     

基于COI条形码的市售蝉蜕及其混淆品DNA分子鉴定研究

目的 利用COI序列对中药材蝉蜕Cicadae Periostracum及其混淆品进行DNA条形码鉴定研究,为蝉蜕药材的快速准确鉴定提供新的技术手段。方法 收集全国市售蝉蜕药材、基地自采蝉蜕及其混淆品总45份样本,同时采集江苏徐州黑蚱养殖基地不同树种中蝉卵样品5份作为对照。提取DNA,进行PCR扩增及双向测序,测序结果采用DNAMAN和SnapGene进行拼接校对,运用MEGA11.0进行比对分析,计算种内及种间Kimura 2-Parameter(K2P)遗传距离并构建邻接法（neighbor-joining,NJ）系统发育树。结果 黑蚱种内遗传距离远小于种间最小遗传距离,NJ树结果显示,黑蚱蝉蜕样品全部聚集为独立的一支,支持率为99%。混淆品样品分别聚集为单独的一支,支持率均大于90%,表明基于COI序列的DNA条形码技术可以有效鉴别蝉蜕药材真伪。结论 应用COI序列作为DNA条形码能够准确有效地鉴别蝉蜕及其混淆品。     

动物类中药DNA条形码鉴定研究进展

DNA基因鉴定是近年来应用在中药鉴定中较为重要的分子生物技术,该技术能够很好地从基因层面上鉴别药材,具有较高的准确性。DNA基因鉴定包括DNA分子遗传标记,核酸探针杂交,DNA条形码分子鉴定法等,其中发展最快的为DNA条形码分子鉴定法。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)4种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。Hebert等在2003年提出了通过测定线粒体细胞色素C氧化亚基I(COI)基因序列来鉴定动物的种类。陈士林等则在大量实验的基础上提出了鉴别动物的基因以COI基因为主,ITS2基因为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。大量的实验表明,通过DNA条形码来鉴别动物具有准确性、可行性、简便性、通用性,为鉴别动物物种及发现新物种提供了新的方法,为鉴别动物药材的真伪提供了科学的依据。但由于该技术是通过基因进行鉴定,对实验材料及提取方法有较高要求,对一些年代较久的动物药材,其DNA降解较为严重,为DNA提取技术提出了较高的要求;该技术只能鉴别其来源是否准确却不能鉴别其药用部位是否准确,这就需要结合其他鉴别方法来准确鉴别其药用部位。本文通过综合国内外对DNA条形码的研究,为日后的研究和应用提供理论依据。     

炮山甲及其混伪品的DNA微型条形码鉴定研究

目的:建立基于DNA微型条形码的炮山甲及其混伪品的分子鉴定技术。方法:采用改良的DNA提取方法提取中华穿山甲与其易混物种炮制甲片的DNA,利用线粒体COⅠ、16S rRNA和12S rRNA基因的标准及微型条形码引物进行PCR。双向测序后进行BLAST和序列位点分析,再计算种内和种间K2P遗传距离,并构建NJ系统树。结果:16S rRNA(L2513/H2714)和12S rRNA(L1085/H1259)引物对在所有甲片DNA中均能扩增成功,所获序列与Genbank序列的BLAST比对相似度大于98%。中华穿山甲与其易混物种的种间遗传距离远大于其种内遗传距离,而且各物种在NJ树中表现出单系性,其中16S rRNA微型条形码能将穿山甲属聚在一起。结论:基于16S rRNA的微型条形码技术可有效鉴别炮山甲及其混伪品。     

基于COI条形码序列的《中国药典》动物药材鉴定研究

药用动物是我国中药资源的重要组成部分,线粒体COI 基因被公认为动物界中标准的DNA 条形码基因,但利用此技术系统研究药用动物或动物药材鉴定的报道不多。本研究选取药典中45 个动物药材,涉及基原物种51 种,分析样品COI 序列的种内种间变异情况,barcoding gap,鉴定效率等,考察COI 序列鉴定动物药材的有效性和准确性。结果表明,种间变异最小值远大于种内变异最大值,barcoding gap 图显示种间变异和种内变异重合较少,鉴定效率较高,除节肢动物门外,在物种水平和属水平上,鉴定效率均为100%,所构建的动物药材及其混伪品的NJ 树能很好地区分正品来源与其混伪品。因此COI 序列作为DNA 条形码适用于药典中动物药材的鉴定。本研究为COI 条形码准确鉴定药典中动物药材提供了分子依据,扩充了DNA 条形码数据库中药用动物序列,并建立了利用此技术鉴定动物药材的具体技术流程。     

基于ITS2序列的市售木通药材及其混伪品的分子鉴定

目的 建立基于核糖体内部转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列的木通药材DNA条形码鉴定方法,对市售木通药材进行物种分析。方法 收集河北、安徽、贵州等地的样品总计45份,其中木通药材及其混伪品的原植物样品18份,市售木通药材样品27份。通过提取DNA、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增、双向测序获得ITS2序列,基于邻接（neighbor joining,NJ）系统发育树和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）位点进行物种鉴定分析。结果 基于木通药材及其混伪品原植物ITS2序列构建的NJ树分析结果表明,木通药材正品及其混伪品在NJ树上聚为独立的分支,木通药材正品及其混伪品在NJ树上可明确区分;基于NJ树对27份市售木通药材的物种分析表明,市售样品中仅有4份为正品木通,2份为小木通,21份为粗齿铁线莲,正品率为14.8%。结论 基于ITS2序列的DNA条形码技术可以准确区分中药材木通及其混伪品,市售木通药材物种较混乱。     

应用种子形态及DNA条形码技术鉴定黄芪及混伪品种子

目的 采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术对黄芪及混伪品种子进行鉴定。方法 收集黄芪及混伪品种子、市售黄芪种子样品共58份,利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重;提取单粒种子的基因组DNA,PCR扩增、双向测序获得ITS2及psbA-trnH序列。使用邻接法（neighbor joining,NJ）构建系统发育树,kimura二参数（kimura two-parameter,K2P）模型计算遗传距离,进行物种鉴定分析。结果 黄芪及混伪品种子在颜色、形状、长、宽、厚度及千粒重等方面存在细微差别;ITS2的测序成功率为100%,黄芪种间最小遗传距离均大于种内最大遗传距离;ITS2序列构建的NJ系统进化树将蒙古黄芪A.mongholicus var. mongholicus聚为独立一支,并将蒙古黄芪Astragalus membranaceus、紫花苜蓿Medicago sativa、锦鸡儿Caragana sinica、蜀葵Althaea rosea及黄芪属其他物种分开,可进行黄芪及其混伪品种子的鉴定。基于外观形态和ITS2条形码序列鉴定发现12份市售黄芪种子中有1份为斜茎黄芪。结论 基于种子形态鉴定和ITS2条形码相结合的方法可以准确鉴定黄芪及混伪品种子,为规范黄芪种源及种植生产,进而保障黄芪药材质量提供科学依据。     

地龙的多重位点特异性PCR鉴别

目的:近年来,中药材地龙的商品价格不断上涨,市场的混伪品随之增加。其主要鉴别特征在药材中大部分丢失,难以区分。因此,急需建立一种准确、稳定的中药材地龙基原鉴别方法。方法:根据地龙及其混伪品的COI基因序列差异找到变异位点,从而设计参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,优化反应体系并进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上将特异性引物组合,构建多重聚合酶链式反应(PCR)体系,从而建立了一种高效准确、操作简便、专属性强、重复性好的中药材地龙及其常见混伪品的多重位点PCR鉴别方法。结果:在该方法下广地龙基原参环毛蚓可得到366 bp片段,沪地龙基原通俗环毛蚓和威廉环毛蚓可得到487 bp片段,栉盲环毛蚓可得到475 bp片段,其他混伪品均无条带。将之组合形成的多重PCR可在一次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别沪地龙和广地龙。结论:该文所建立的多重位点特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中药材地龙真伪。     

3种DNA分子标记法联合鉴别草珊瑚及其混伪品

目的采用18 S rRNA基因、ITS2序列、SCAR标记等3种DNA分子标记法鉴别草珊瑚,为其分子鉴定提供依据。方法通过PCR扩增、克隆测序后获得草珊瑚18 S rRNA基因序列,并进行Blast比对;通过PCR扩增、测序并注释后获得草珊瑚ITS2序列,从GenBank上收集混伪品和其他植物的ITS2序列,使用MEGA5.5软件,计算种内种间遗传距离,构建系统聚类树;通过RAPD法获得草珊瑚SCAR分子标记,克隆测序后,设计特异性引物扩增草珊瑚及其混伪品。结果获得的草珊瑚18 S rRNA基因长度为1 820 bp,Blast比对显示草珊瑚与金粟兰科同源性最高,同源性为99%,证明其为草珊瑚的18 S rRNA基因。获得的草珊瑚ITS2序列长度为500 bp,草珊瑚与其混伪品之间的遗传距离为0.190～0.219,混伪品之间的遗传距离为0～0.074,聚类分析显示草珊瑚聚为一支,混伪品聚为一支,与其他植物距离较远。获得草珊瑚的SCAR分子标记,用特异性引物扩增出现草珊瑚特异性产物,混伪品未出现特异性产物。结论 3种分子标记法联合可更有效地鉴别草珊瑚及其混伪品,从而建立一套新的鉴别草珊瑚与混伪品的方法,为其鉴别提供新的思路。     

特异性PCR鉴别蜈蚣及其混伪品

目的:蜈蚣是我国传统的中药材,具有良好的药用价值。目前市场上蜈蚣的混伪品日益增多,临床用药的安全性和有效性难以保证。该研究建立了一种蜈蚣基原物种的特异性聚合酶链式反应(PCR)方法,以准确、简便的鉴别蜈蚣及其常见混伪品。方法:通过比较蜈蚣及其混伪品基原物种的COI基因序列差异,根据变异位点设计蜈蚣正品少棘巨蜈蚣的特异性鉴别引物WG-500.F和WG-500.R,采集蜈蚣原动物样本及药材样本,优化反应体系并对此方法进行耐受性和适用性的考察和验证。结果:少棘巨蜈蚣原动物样本及蜈蚣正品药材使用设计的蜈蚣鉴别引物经PCR扩增和凝胶电泳后出约500 bp的单一明亮条带,其他混伪品如多棘蜈蚣、模棘蜈蚣、哈氏蜈蚣、海南蜈蚣等均无条带出现。结论:PCR鉴别方法可准确鉴别蜈蚣原动物和药材的真伪,具有高度特异性,为中药材蜈蚣的真伪鉴别提供了良好的科学依据。该方法具有简单、直观等特点,有利于广泛的普及与应用,在中药材鉴定方面有着广阔的应用前景。     

鸡血藤及其混伪品的DNA条形码分子鉴定研究

目的采用分子生物学鉴定技术,筛选合适的DNA条形码序列,建立快速、准确鉴定鸡血藤的方法。方法采集72份鸡血藤及其混伪品的样本,分别提取样品DNA,对ITS2、matK、psbA-trnH、ITS和rbcL序列扩增、测序;计算各序列扩增成功率和测序成功率,利用MEGA7.0分析比对序列特征;基于Kimura-2-Parameter(K2P)双参数模型计算种内、种间的遗传距离评估Barcoding gap;利用Phylosuite软件构建ITS2、matK和psbA-trnH和多基因(I-M-P)联合系统发育树。结果 ITS2的扩增成功率和测序成功率最高,均为100%,matK和psbA-trnH的测序成功率亦有94.4%、91.7%,而rbcL和ITS仅为69.4%和61.1%;ITS2较其他条形码序列具有明显的Barcoding gap,且种内、种间重叠少;系统发育树显示,ITS2和psbA-trnH可将鸡血藤及其混伪品明显聚为不同分支,matK不能把滇鸡血藤和南五味子分开;I-M-P系统发育树同ITS2和psbA-trnH结果相同。结论以ITS2为主、psbA-trnH序列为辅的鉴定方法能够对鸡血藤及其混伪品进行快速、准确的鉴定,为鸡血藤临床用药的安全性和合理使用的准确性提供依据。     

宽体金线蛭的特异性PCR分子鉴定

[目的] 实验旨在通过寻找宽体金线蛭单核苷酸多态性（SNP）位点,设计宽体金线蛭的特异性鉴别引物,建立宽体金线蛭特异性聚合酶链式反应（PCR）检测方法,实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别。[方法] 通过比对宽体金线蛭与其常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）序列,寻找宽体金线蛭COI基因序列内SNP位点,设计特异性鉴别引物。[结果] 进行PCR后仅宽体金线蛭能够扩增得到149 bp的条带,混伪品不能扩增出明显目的条带。向扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料染色,宽体金线蛭样品在紫外灯下显黄绿色荧光,混伪品不显荧光。[结论] 该方法能够准确快速鉴别宽体金线蛭与其常见混伪品,为中药材市场上宽体金线蛭的快速鉴别提供技术支持。