内质网应激可介导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗

目的观察内质网应激(ERs)抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)对ERs诱导剂衣霉素(TM)介导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的干预效果,探讨脂肪细胞IR与ERs的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并将其诱导分化为成熟的脂肪细胞。以MTT比色法检测不同干预条件下脂肪细胞存活情况、以葡萄糖氧化酶法(GOD)法检测不同干预条件下脂肪细胞葡萄糖消耗情况,利用Western blot检测不同干预条件下ERs关键信号蛋白(P-IRE、IRE)的表达差异。结果 (1)5μg/mL TM作用5h后可使胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量降低19.7%(P<0.05),而1mmol/L TUDCA预处理24h后均可缓解TM的抑制作用。(2)Westernblot显示,5μg/mL TM作用5h明显增加P-IRE的表达,而经1mmol/L TUDCA预处理24h后可减少P-IRE的表达。不同处理因素对总IRE的表达无明显影响。结论 ERs可诱导3T3-L1脂肪细胞发生IR,缓解ERs可减轻IR。     

豁痰解毒通络方干预颈动脉粥样硬化兔的内质网应激-自噬信号通路机制研究

目的研究豁痰解毒通络方对颈动脉粥样硬化兔的内质网应激-自噬信号通路的作用。方法 10周龄雄性日本大耳兔,随机分为4组:假手术组、模型组、豁痰解毒通络方组、阿托伐他汀组。以蛋氨酸饲料喂养合球囊拉伤颈总动脉内膜法建立兔颈动脉粥样硬化模型。取损伤侧颈总动脉进行HE染色观察病理组织结构;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组血清中同型半胱氨酸(Hcy)的含量;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测颈总动脉组织中的内质网应激标志分子蛋白质激酶样内质网激酶(PERK)、真核起始因子2ɑ(eIF-2ɑ)、自噬标志分子Atg5的mRNA水平;蛋白免疫印记法(Western blot)检测eIF-2ɑ、Atg5在颈总动脉组织中的蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组损伤侧颈总动脉有明显的内膜增生,血管腔变窄;血清中Hcy含量升高(P0.01);与模型组比较,豁痰解毒通络方组损伤侧颈总动脉内膜增生明显减轻,血清中的Hcy含量减少(P0.01)。与假手术组比较,模型组PERK、eIF-2ɑ、Atg5 mRNA水平以及eIF-2ɑ、Atg5蛋白表达水平升高(P0.01);豁痰解毒通络方和阿托伐他汀能够降低颈动脉粥样硬化兔模型PERK、eIF-2ɑ、Atg5 mRNA水平(P0.01)以及eIF-2ɑ、Atg5的蛋白表达水平(P0.01)。结论豁痰解毒通络方可以明显改善模型兔颈动脉粥样硬化情况,降低血清Hcy的含量,其机制可能是通过抑制内质网应激-自噬信号通路的过度激活实现的。     

长链脂肪酸通过GPR120对脂肪细胞炎症、内质网应激及胰岛素信号分子的影响

目的 观察长链脂肪酸对脂肪细胞GPR120的作用及对脂肪细胞炎症、内质网应激及胰岛素信号分子的影响。 方法 体外培养3T3-L1前脂肪细胞,采用1μM地塞米松、1μg/ml胰岛素和10%加强型小牛血清的DMEM培养基诱导为分化3T3-L1脂肪细胞,采用100Μm PA刺激2 h后,采用Western blot方法检测GPR120、XBP1S、PERK、P-PERK、IRE-1α、P-IRE-1α、IKKβ、p-IKKβ、JNK1、P-JNK1、JNK2和P-JNK2蛋白表达水平。加入含有100ng/ml胰岛素的DMEM培养基,孵育15 min,采用Western blot方法检测IR、P-IR、IRS-1、p-IRS、Akt和P-Akt蛋白表达水平。 结果 在PA的刺激下,GPR120、XBP1S、PERK、P-PERK、IRE-1α、P-IRE-1α、IKKβ、p-IKKβ、JNK1、PJNK1、JNK2和P-JNK2表达显著提高(P<0.05),IR、P-IR、IRS-1、p-IRS-1、Akt和P-Akt蛋白表达水平显著下降(P<0.05),而使用GPR120阻滞剂LGW9508可以抑制该过程。 结论 长链饱和脂肪酸PA可通过上调GPR120蛋白的表达,诱导脂肪内质网应激反应、炎症反应和胰岛素抵抗。      

TNF-α致脂肪细胞胰岛素抵抗相关基因的克隆和鉴定

目的分离和克隆肿瘤坏死因子α(TNF-α)致3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的相关基因.方法分化成熟的3T3-L1脂肪细胞用TNF-α处理48 h后抽提总RNA,采用mRNA差异显示技术分离和克隆TNF-α引起脂肪细胞IR的基因,再通过半定量RT-PCR证实.结果经mRNA差异显示技术分离和克隆到10个已知基因的cDNA,3个已知表达序列标签(ESTs)片段和1个新的EST片段.半定量RT-PCR证实TNF-α上调3T3-L1脂肪细胞Synip基因和血浆淀粉样蛋白A3(SAA3)基因的表达.结论Synip基因和SAA3基因的表达升高可能与TNF-α致3T3-L1脂肪细胞IR和相关的心血管并发症有关.     

血清淀粉样蛋白A在3T3-L1脂肪细胞的表达及其与胰岛素抵抗的关系

目的 了解血清淀粉样蛋白A(SAA)在3T3-L1脂肪细胞的表达情况及其与胰岛素抵抗的关系.方法 用3种不同浓度的地塞米松(10、100、1000nmol/L)建立3种不同程度的脂肪细胞胰岛素抵抗模型(分别称为模型组1、模型组2、模型组3),同时设立空白对照组.采用2-脱氧-3H-D-葡萄糖摄入法检测葡萄糖的摄入情况.以葡萄糖摄入减少的百分比反映胰岛素抵抗程度;RT-PCR技术检测各组SAAmRNA的表达,ELISA检测SAA蛋白的表达.结果 各组基础状态下葡萄糖的摄取率无明显差异(P>0.05);胰岛素刺激后模型组1、模型组2、模型组3的葡萄糖摄取率分别比对照组减少了15%(P<0.05)、40%(P<0.01)、55%(P<0.01);SAAmRNA的表达量分别是对照组的2.5(P<0.01)、3.33(p<0.01)、4.08倍(P<0.01);SAA蛋白表达量分别是对照组的2.05(P<0.05)、3.13(P<0.01)、4.23倍(P<0.01);相关分析显示3T3-L1脂肪细胞SAA mRNA的表达量(r=0.773,P<0.01)和蛋白表达量(r=0.832,P<0.01)与胰岛素抵抗程度均呈正相关.结论 采用地塞米松干预3T3-L1脂肪细胞可成功建立胰岛素抵抗模型;脂源性炎症因子SAA与胰岛素抵抗密切相关,它可能是胰岛素抵抗的一个标记物.     

辛伐他汀对3T3-L1脂肪细胞Apelin mRNA表达的影响

目的:观察辛伐他汀对3T3-L1脂肪细胞中Apelin mRNA表达影响,为探讨Apelin在心力衰竭发病中的作用以及他汀类药物抗炎作用提供依据.方法:用辛伐他汀溶液刺激诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,辛伐他汀浓度分别为0、1、10 μ mol/L,作用时间设为24h和48h.提取脂肪细胞总RNA,运用实时荧光定量聚合酶链反应技术测定Apelin mRNA表达量的变化.结果:经辛伐他汀干预后3T3-L1脂肪细胞Apelin mRNA表达降低,高浓度的辛伐他汀对Apelin mRNA的表达有显著的抑制作用(P<0.05).在相同药物浓度下,不同作用时间各组之间差异无显著性(P>0.05). 结论:辛伐他汀可使3T3-L1脂肪细胞中Apelin mRNA表达减少,并具有药物浓度依赖性.这可能部分解释了辛伐他汀的抗炎作用.     

黄连解毒汤对胰岛素抵抗大鼠氧化应激和内质网应激的影响

目的:研究黄连解毒汤对胰岛素抵抗大鼠氧化应激和内质网应激的影响。方法:将40只Wistar雄性分为正常对照组(10只)和模型组(30只)。将制作成功的30只胰岛素抵抗模型组大鼠再随机分为黄连解毒汤组、模型对照组以及硫辛酸组,每组各10只。模型组大鼠分别给予相应的药物干预。正常对照组大鼠不采用药物干预,然后分别测定模型组大鼠空腹血糖、胰岛素以及胰岛素敏感性等;观察各组大鼠血清和肝脏中包括丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶等相应的指标;观察不同药物干预对胰岛素抵抗大鼠氧化应激和内质网应激的影响。结果:模型组大鼠与正常对照组相比较,其空腹血糖、空腹胰岛素均表现出上升,胰岛素敏感性下降;其中,黄连解毒汤组大鼠与模型对照组相比较,空腹血糖和空腹胰岛素表现出下降,而胰岛素敏感性表现出上升;在肝组织内质网标志物方面,模型组大鼠比正常对照组表现出上升,而黄连解毒汤组大鼠与模型对照组相比较,则表现出下降,所有差异比较明显(P<0.05),具有统计学意义。结论:黄连解毒汤可有效地提高胰岛素抵抗大鼠氧化应激能力,并改善内质网应激状态。     

代综方对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型瘦素、抵抗素及肿瘤坏死因子α的影响

目的 观察中药代综方对棕榈酸(Palmitic acid, PA)诱导胰岛素抵抗(Insulin resistance, IR)的3T3-L1脂肪细胞中细胞因子瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的影响。方法 采用传统“鸡尾酒式”诱导3T3-L1前脂肪细胞分化成熟,用0.5 mmol/L PA建立IR模型。分为空白对照组、模型组、代综方低浓度组(含代综方生药量0.5 mg/ml)、代综方高浓度组(含代综方生药量2.0 mg/ml),干预48 h。葡萄糖氧化酶法检测培养上清中的葡萄糖浓度,计算葡萄糖基础消耗量(G_Basic)和胰岛素刺激下消耗量(G_Ins),评价胰岛素敏感性指数(ISI)。ELISA检测上清中瘦素、抵抗素、TNF-α的含量,Real-Time PCR检测瘦素、抵抗素、TNF-α的mRNA表达。结果 与空白对照组比较,模型组GIns、ISI均明显降低(P<0.01);与模型组比较,代综方高、低浓度组G_Basic、G_Ins、ISI...     

重组人促红细胞生成素对3T3-L1脂肪细胞促红细胞生成素受体表达及下游信号通路的影响

目的 探讨重组人促红细胞生成素( rHuEPO)对正常和胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞促红细胞生成素受体(EPOR)表达及其下游信号通路的调控作用.方法 以1μmoL/L地塞米松诱导建立3T3-L1脂肪细胞胰岛索抵抗模型(模型组),以分化成熟的正常3T3-L1脂肪细胞作为对照组.采用细胞免疫荧光法和Western blotting法检测细胞EPOR的蛋白表达,采用Real-TimePCR技术检测细胞EPOR mRNA的表达.分别以rHuEPO、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂(LY294002)及信号转导和转录激活因子5( STAT5)抑制剂对模型组和对照组细胞进行干预,采用Western blotting法检测不同药物干预对EPOR蛋白的表达及其下游分子丝(苏)氨酸蛋白激酶( Akt)和STAT5磷酸化水平(p-Akt和p-STAT5蛋白的表达)的影响.结果 与对照组比较,模型组EPOR蛋白和mRNA的表达均显著下调(P＜0.05).干预实验结果显示:与相应对照组或模型组比较,rHuEPO+对照组或模型组EPOR、p-Akt和p-STAT5蛋白的相对表达量均显著上调(P＜0.05);与相应rHuEPO+对照组或模型组比较,rHuEPO+LY29400或STAT5阻断剂+对照组或模型组的p-Akt和p-STAT5蛋白的相对表达量显著下调(P＜0.05).结论 正常3T3 -L1脂肪细胞上存在EPOR,胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞EPOR蛋白和mRNA的表达下调,rHuEPO可通过EPOR介导激活PDK-Akt和JAK2 -STAT5信号通路.     

3T3-L1脂肪细胞与胰岛素抵抗脂肪细胞miRNAs表达谱的差异性分析

目的探讨正常3T3-L1脂肪细胞和胰岛素抵抗(IR)脂肪细胞微小RNA(miRNAs)的差异性表达,并进行初步分析。方法采用高糖(25 mmol/L葡萄糖)/高胰岛素液(1μmol/L)处理3T3-L1脂肪细胞24h,通过葡萄糖摄取实验判断IR脂肪细胞模型的建立;接着通过miRNA芯片技术,检测脂肪细胞和IR脂肪细胞中miRNAs的表达,并对其分析;随后借助生物信息学方法,对显著变化的2个miRNAs(miR-320和miR-21)寻找并筛检其可能调控的靶基因。结果共获得79个IR相关miRNAs(29个低表达,50个高表达,其中miR-320显著上调,miR-21显著下调),且筛选出与IR或糖尿病相关的靶基因共13个。结论获得了3T3-L1脂肪细胞和IR脂肪细胞miRNAs的差异性表达谱,为进一步研究这些miRNAs在IR和糖尿病的发病机制中的作用奠定了基础。     

3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型建立的3种方法对葡萄糖转运时效关系的影响

目的:对比3种不同方法(地塞米松、游离脂肪酸、高糖高胰岛素)诱导的胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖转运时效关系及对葡萄糖转运子4(Glut4)蛋白表达的影响.方法:采用3种不同方法诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗,分别检测各组细胞12,24,36,48及60h时的葡萄糖转运率及各组细胞60 h后Glut4蛋白的表达.结果:在24 h内,造模组细胞的葡萄糖转运率与正常对照组相比均明显降低(P＜0.01);在24 h以后,游离脂肪酸组葡萄糖转运率与正常对照组相比无明显统计学差异(P＞0.05),地塞米松组葡萄糖转运率相比正常对照组明显降低(P＜0.05),而高糖高胰岛素组葡萄糖转运率较地塞米松组明显降低(P＜0.01);地塞米松组及游离脂肪酸组的Glut4蛋白表达水平较正常对照组明显降低(P＜0.01);相对于地塞米松组及游离脂肪酸组,高糖高胰岛素组的Glut4蛋白表达水平明显降低(P＜0.01).结论:高糖高胰岛素能够诱导3T3-L1脂肪细胞产生更强的胰岛素抵抗,这种抗性的产生可能是因为抑制了Glut4蛋白的表达获得的.     

长链脂肪酸通过GPR120对脂肪细胞炎症、内质网应激及胰岛素信号分子的影响

目的：初步探讨饱和和不饱和长链脂肪酸通过G蛋白受体120（GPR120）对脂肪细胞炎症、内质网应激及胰岛素信号分子的影响及其机制.方法：选取5例择期行胆结石胆囊手术的患者的大网膜脂肪组织,分离成熟脂肪细胞并进行培养.分别进行长链多不饱和脂肪酸DHA研究和长链饱和脂肪酸PA研究.应用实时定量PCR法和western blot法检测GPR 120、FABP4、肿瘤坏死因子α（TNFα）、内质网应激蛋白p-eIF2α及胰岛素信号通路蛋白IRS-1的基因和蛋白表达水平.结果：（1）DHA刺激下,GPR120和FABP4的表达均显著增加（均P＜0.01）,同时,TNFα （P＜0.01）和p-eIF2α （P＜0.05）表达下调,IRS1 （P＜0.05）表达上调.加入GPR120特异性抑制剂GW9508后,GPR120和FABP4的表达均显著减少（均P＜0.01）,TNFα（P＜0.01）和p-eIF2α （P＜0.01）表达较不加GW9508时上调,IRS1 （P＜0.05）表达下调.（2）在PA刺激下,除TNFα （P＜0.05）和p-eIF2α （P＜0.01）表达上调、IRS1 （P＜0.05）表达下调外,其余结果同（1）.结论：GPR 120介导了脂肪酸诱导的胰岛素信号通路的调控,并在饱和长链脂肪酸和不饱和长链脂肪酸的作用中起到平衡调控作用.     

缺氧对3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响

目的 研究缺氧状态下,脂肪细胞脂代谢的变化.方法 缺氧[1％氧(O2)、94％氮(N2)、5％二氧化碳(CO2)]处理分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,Western-blotting观察不同时间点激素敏感型脂肪酶(HSL)、磷酸化HSL、磷酸化AMPK、脂肪酸合成酶(FASN)蛋白表达水平变化;收集培养液上清酶法测定甘油,分光光度法测定三酰甘油、游离脂肪酸、ATP脂肪细胞代谢产物.结果缺氧降低分化成熟的3T3-L1脂肪细胞ATP的产生;增加甘油及游离脂肪酸含量;激活AMPK,抑制FASN的蛋白表达,但缺氧对HSL蛋白表达无明显影响.结论 缺氧使脂肪细胞脂解增加,FFA水平升高.提示缺氧可能在肥胖炎症发生过程中起着重要作用.     

维拉帕米对前体脂肪细胞3T3-L1分化及脂质积聚的影响

目的:观察钙离子通道阻滞剂盐酸维拉帕米对3T3鄄L1前体脂肪细胞分化及脂质积聚的影响。方法:体外培养3T3鄄L1前体脂肪细胞,在常规诱导分化方案基础上加用维拉帕米(终浓度30μmol/L),采用油红O染色各分化时段脂肪细胞,计数含脂滴脂肪细胞数。结果:维拉帕米干预后,脂肪细胞分化速度低于正常对照,虽未影响脂滴出现的时间(第4天),但含脂滴脂肪细胞数均显著低于同期正常对照(P<0.001)。结论:维拉帕米具有抑制脂肪细胞分化及脂质积聚的作用。     

肝宁方对衣霉素诱导肝细胞内质网应激生存信号分子的影响

目的 研究肝宁方对衣霉素诱导的人肝细胞内质网应激条件下的生存信号分子的影响。方法 将肝细胞分正常组、模型组、治疗组：正常组给予正常大鼠血清培养基培养48h,模型组在正常组基础上给予衣霉素诱导48h,治疗组在模型组基础上给予肝宁方继续培养24h。Western blot法检测各组蛋白ATF6、IRE1α、PERK、GRP78的表达量,分析蛋白表达差异。结果 肝宁方治疗组与衣霉素诱导模型组比较,治疗组内质网应激信号分子的蛋白ATF6、IRE1α、PERK的表达明显减少（P<0.05）;模型组与对照组比较,模型组GRP78、内质网应激信号分子的蛋白ATF6、IRE1α、PERK的表达明显增多（P<0.05）。结论 衣霉素诱导正常肝细胞后可激活ATF6、IRE1α、PERK及GRP78蛋白的表达,肝宁方对衣霉素诱导内质网应激生存信号分子蛋白ATF6、IRE1α、PERK的表达及内质网应激标记蛋白均有抑制作用,从而达到阻止未折叠蛋白的错误激活、抑制肝细胞凋亡,对肝细胞具有保护作用。     

甘精、地特、人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响

目的探讨甘精、地特、人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响。方法体外培养3T3-L1脂肪细胞,诱导分化成熟后加入含有1nmol／L、10nmol／L、100nmol／L、1000nmol／L甘精、地特、人胰岛素的基础培养基培养24h,并设立基础培养基组为空白对照组,培养24h,RT-PCR方法检测脂肪细胞脂联素mRNA水平。结果100nmol／L、1000nmol／L甘精、地特、人胰岛素均抑制脂联素mRNA的表达中,1000nmol／L胰岛素的抑制作用强于100nmol／L胰岛素。地特胰岛素的抑制作用弱于人胰岛素及甘精胰岛素。甘精胰岛素的抑制作用弱于人胰岛素。结论高浓度甘精、地特、人胰岛素均不同程度抑制3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA的表达。     

调肝益气通络方促进骨髓间充质干细胞体外增殖研究

目的：探索调肝益气通络方对大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）增殖能力的影响。方法：腹腔注射＂CCl4-橄榄油＂混悬液制备WISTAR大鼠（35只）肝纤维化模型;其中30只灌胃给予调肝益气通络方（低、中、高剂量）1个月,制备含药血清;另外5只用于MSC细胞的分离与培养;用含药血清诱导MSC向肝细胞的分化连续14d;在各检测点进行形态学观察通过MTT对细胞增殖情况进行评价,通过WesternBlot检测诱导第7天、第14天甲胎蛋白的表达程度。结果：各浓度含药血清在加入1~14d后,其细胞数量均比常规培养组增多,并同用药剂量、时间呈正比;诱导14d后高剂量组甲胎蛋白呈强阳性表达。结论：调肝益气通络方对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力具有显著的促进作用,并可促进甲胎蛋白的分泌。     

IL-6干预对3T3-L1脂肪细胞SAA表达的影响

目的观察IL-6干预对3T3-L1脂肪细胞血清淀粉样蛋白A（SAA）表达的影响。方法用不同浓度IL-6（0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml）处理3T3-L1脂肪细胞24h、10ng/mlIL-6处理不同时间（6h、12h、24h）,用ELISA技术检测各组SAA的表达。结果TNF-a能显著促进3T3-L1脂肪细胞SAA的表达,并呈剂量和时间依赖方式。结论IL-6可以通过促进3T3-L1脂肪细胞SAA的表达和分泌,参与胰岛素抵抗及血管并发症的形成。     

IR-3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞的建立

目的探讨3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞（insulin resistant 3T3-L1 adipocytes cell, IR-3T3-L1）最佳的建立条件。方法采用
地塞米松（Dexamethason,DEX）、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（3-isobutyl-methylxanthine, IBMX）和不同浓度的胰岛素（10-8、10-7、
10-6 mol·L-1）诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,Oil red O染色确定最佳胰岛素诱导浓度,继而用1 μmol·L-1 DEX
诱导建立IR-3T3-L1 脂肪胰岛素抵抗细胞。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（Glucose oxidase-peroxidase, GOD-POD）法对
IR-3T3-L1细胞的最佳诱导时间（24~120 h）及其稳定时间（24~48 h）进行了考察。结果Oil red O染色发现3T3-L1前脂肪细胞
用DEX、IBMX和10-6 mol·L-1胰岛素诱导9 d,>90% 的前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞;用1 μmol·L-1 DEX培养96 h后,脂肪
细胞葡萄糖消耗率达到最大（P=0.0003）;稳定时间考察发现,在36 h内葡萄糖消耗与对照组比较有统计学意义（P<0.001）。结
论3T3-L1前脂肪细胞在1 μmol·L-1 DEX、0.5 mmol·L-1 IBMX 和10-6 mol·L-1最佳胰岛素浓度作用下诱导分化为成熟的脂肪细
胞后,用1 μmol·L-1 DEX培养96 h即可成功诱导成IR-3T3-L1-IR脂肪胰岛素抵抗细胞,且在36 h内稳定。