急性淋巴细胞白血病患儿Bim及c-Myc表达水平与糖皮质激素敏感性的关系

目的 探讨ALL患儿Bim及c-Myc蛋白表达水平与糖皮质激素(GC)敏感性的关系,研究Bim 表达水平是否可作为判断早期GC敏感性的客观指标,从而指导临床治疗和判断预后.方法 采用Western blot方法检测1 μmol·L-1地塞米松作用于人T-ALL GC敏感细胞株(CEM-C7)和GC耐药细胞珠(CEM-C1) 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h及72 h后Bim和c-Myc蛋白表达的变化;以30例初诊ALL患儿为研究对象,采用Western blot分析ALL患儿GC诱导前、GC诱导后24 h、48 h、72 h以及第8天Bim蛋白表达情况,探讨Bim表达水平与ALL患儿GC敏感性的关系.结果 地塞米松作用CEM-C7 后12 h Bim表达量开始增加,直到72 h仍维持在较高水平,c-Myc表达水平在地塞米松作用后24 h明显下降,到72 h降至最低,而在GC耐药细胞CEM-C1中 Bim和c-Myc表达水平均无变化.30例初诊ALL患儿,25例GC敏感,5例GC不敏感,Bim表达水平在GC敏感组GC诱导前及诱导后24 h均高于GC不敏感组,差异均有统计学意义(Pa<0.05),但在GC诱导后48 h、72 h及第8天,2组Bim表达水平比较差异均无统计学意义.GC敏感组诱导后不同时间点未发现Bim表达呈增高趋势.结论 GC通过上调Bim表达及抑制c-Myc的表达,而诱导ALL细胞凋亡;Bim有可能作为判断ALL患儿早期GC敏感与否的客观指标,从而指导临床治疗及判断预后.     

miR-100及miR-99a影响儿童急性淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的研究

目的探讨miR-100及miR-99a在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的作用及其作用机制,为寻求新的靶向治疗方法提供依据。方法用实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR)技术检测2007年3月至2012年9月中山大学附属第一医院71例初发急性髓细胞白血病(AML)患儿、111例初发ALL患儿及10例原发性免疫性血小板减少症(ITP)患儿的骨髓标本中miR-100及miR-99a的表达;用在线miRNA数据库预测miR-100及miR-99a的可能靶基因,并通过双荧光报告及蛋白印迹技术(Western Blot)对可能的靶基因进行验证;用瞬时转染方法使ALL细胞系过表达miR-100及miR-99a,用Western Blot检测此时靶蛋白的表达;用细胞计数试剂-8(CCK-8)和流式细胞技术研究过表达miR-100/miR-99a及沉默其靶基因后对ALL细胞增殖、凋亡的作用。结果与初发AML及ITP患儿比较,miR-100及miR-99a在初发ALL患儿中呈低表达;双荧光报告验证了FKBP51基因是miR-100及miR-99a的靶基因之一,在细胞系中过表达miR-100或miR-99a能抑制FKBP51靶蛋白的表达;过表达miR-100/miR-99a或小干扰RNA(si RNA)沉默其靶基因后可以抑制细胞增殖,促进氟美松诱导的细胞凋亡。结论 miR-100及miR-99a通过对靶基因FKBP51的调控影响ALL细胞增殖、凋亡,靶向增强miR-100及miR-99a的表达有可能成为一种治疗儿童ALL的新方法。     

雷帕霉素逆转T-ALL Jurkat细胞对糖皮质激素耐药(英文)

目的探讨雷帕霉素能否有效逆转T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)Jurkat细胞对糖皮质激素(GC)的耐药。方法用10 nmol/L雷帕霉素(Rap组)、1μmol/L地塞米松(Dex组)、10 nmol/L雷帕霉素联合1μmol/L地塞米松(Rap+Dex组)和0.05%DMSO和0.01%乙醇(对照组)分别处理Jurkat细胞。MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;Western blot法分析mTOR及细胞周期、凋亡相关蛋白表达情况。结果10 nmol/L雷帕霉素能有效抑制mTOR信号通路,逆转Jurkat细胞对GC耐药。雷帕霉素和地塞米松协同作用可有效上调细胞周期抑制蛋白p21和p27的表达,并协同下调细胞周期素D1的表达,从而阻抑细胞在G1期。雷帕霉素协同地塞米松,通过上调Bim表达,活化caspase-3,促进Jurkat细胞凋亡。结论雷帕霉素可有效逆转T-ALL Jurkat细胞对GC耐药。包含雷帕霉素和地塞米松的化疗方案有望成为治疗耐药T-ALL的有效方案。     

大剂量 MTX治疗急性淋巴细胞白血病时不同辅助用药骨髓毒性分析

目的 了解急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿在使用大剂量甲氨蝶呤期间,不同辅助药物6-巯基嘌呤或长春新碱＋泼尼松对患儿骨髓的抑制毒性。方法 用SAS统计软件分析了30例患儿中两组不同辅助用药后的骨髓抑制情况。结果 ALL患儿应用大剂量甲氨蝶呤同时使用这两种不同的辅助用药,其骨髓抑制毒性相似。结论 因6-巯基嘌呤比长春新碱加泼尼松在作为大剂量甲氨蝶呤的辅助用药时杀白血病细胞的作用为强,故在临床上用6-巯基嘌呤较长春新碱加泼尼松作为大剂量甲氨蝶呤的辅助用药是更为合理而有效的方案。     

BIM基因与儿童急性淋巴细胞白血病对糖皮质激素耐药的相关性

急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童时期最常见的恶性血液系统疾病。糖皮质激素作为ALL化疗方案中的主要用药,可通过多种途径诱导白血病细胞的凋亡,但仍有约10%的儿童ALL对糖皮质激素不敏感。研究发现糖皮质激素通过上调BIM基因表达介导ALL细胞的凋亡,BIM基因与儿童ALL对糖皮质激素耐药有关。本综述概括了近年关于儿童急性淋巴细胞白血病对糖皮质激素耐药相关研究,主要包括BIM基因及其表达产物在该过程中的作用。     

Pax2、增殖细胞核抗原、细胞凋亡在肾病综合征激素耐药中的作用

目的观察原发性肾病综合征（PNS）激素敏感与激素耐药组患儿Pax2、增殖细胞核抗原（PCNA）表达及细胞有效凋亡率，探讨Pax2在肾脏檐皮质激素（GC）耐药中的作用。方法采用免疫组织化学法观察PNS患儿40例肾活检组织Pax2、PCNA表达，采用荧光显微镜检测细胞凋亡。结果激素敏感组Pax2适量表达，与PCNA阳性表达呈正相关,激素耐药组，Pax2呈过度表达，与PCNA阳性表达无明显相关性。Pax2始终与细胞凋亡旱负相关。结论Pax2适量表达，通过促进细胞增殖及抑制凋亡，修复受损的小管-间质。Pax2过度表达，细胞增殖与凋亡进一步减少，导致肾小管病理改变加重，使其对激素不敏感共至耐药。     

Serabelisib抗人肝母细胞瘤HepG2细胞的作用及其机制探讨

目的探讨小分子抑制剂Serabelisib抑制PI3K-Akt信号通路活性及对人肝母细胞瘤细胞系增殖、凋亡的效应作用及其相关机制。方法采用不同浓度的小分子抑制剂Serabelisib(0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L)处理人肝母细胞瘤细胞Hep G2细胞,通过四氮唑盐比色法检测Serabelisib对细胞增殖的抑制作用,采用流式细胞仪检测细胞凋亡变化情况,采用蛋白质免疫印迹检测Serabelisib处理后Hep G2细胞中PI3K信号通路活性及凋亡相关蛋白表达变化情况。结果当Serabelisib浓度≥4μmol/L时,对人肝母细胞瘤细胞系Hep G2细胞增殖具有显著抑制作用,随着Serabelisib浓度增加,其对Hep G2细胞增殖的抑制率逐渐增大,具有剂量和时间依赖性。随着Serabelisib浓度增加,Hep G2细胞凋亡率明显升高,同样具有剂量依赖性。蛋白质免疫印迹检测发现Serabelisib处理后的Hep G2细胞中PI3K信号通路中关键激酶Akt磷酸化水平降低,促凋亡蛋白PARP 89KD裂解片段表达增加。结论Serabelisib通过抑制PI3K/Akt信号转导通路,抑制人肝母细胞瘤Hep G2细胞增殖,并诱导凋亡。     

儿童急性淋巴细胞白血病E-cadherin表达及与临床指标相关性分析

目的检测儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)骨髓单个核细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA、蛋白及骨髓血浆E-cadherin蛋白表达水平,分析初发儿童ALL E-cadherin基因、蛋白表达水平与临床指标的相关性。方法 33例ALL患儿根据诱导治疗前后分为初发组和缓解组(完全缓解)。RT-PCR法检测骨髓单个核细胞E-cadherin mRNA的表达,Western Blot法检测骨髓单个核细胞E-cadherin蛋白的表达,ELISA法检测骨髓血浆E-cadherin蛋白浓度,统计乳酸脱氢酶(LDH)、血清铁蛋白(SF)、外周血白细胞(WBC)计数、骨髓及外周血原始幼稚细胞比例等临床指标。结果初发组骨髓单个核细胞E-cadherin mRNA、蛋白及骨髓血浆E-cadherin蛋白表达量均低于缓解组,差异有显著性(P0.05)。初发组血清LDH及SF的表达水平均高于缓解组(P0.05),差异有显著性。初发组E-cadherinmRNA、蛋白表达水平与LDH、SF水平均呈负相关(P0.05),与外周血白细胞计数、骨髓及外周血原幼稚细胞比例均无相关(P0.05)。结论E-cadherin基因表达缺失可能参与了儿童ALL的发病,E-cadherin基因表达水平对儿童ALL治疗效果判断有一定意义。     

表没食子儿茶素没食子酸酯抑制ALL及Jurkat细胞株迁移侵袭的研究

目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对Jurkat细胞和ALL患儿骨髓单个核细胞(BMMNC)迁移侵袭的抑制作用。方法以Jurkat细胞和ALL患儿BMMNC作为研究对象,给予不同浓度的EGCG处理,通过MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,通过Transwell法检测Jurkat细胞和BMMNC的迁移和侵袭力。结果 (1)经不同浓度EGCG处理不同时间后,Jurkat细胞、ALL患儿BMMNC的增殖均受到不同程度的抑制。各EGCG处理组的抑制率均明显高于对照组(P 0.05),且10、25、50、80、100μmol/L EGCG作用随着其浓度的增加和作用时间的延长,细胞抑制率逐渐增高,呈剂量和时间依赖关系。(2)经不同浓度EGCG处理不同时间后,不同程度地诱导了Jurkat细胞和BMMNC的凋亡。各EGCG处理组的凋亡率均明显高于对照组(P 0.05),且10、25、50、80、100μmol/L EGCG作用随着其浓度的增加和作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐增高,呈剂量和时间依赖关系。(3)细胞迁移和侵袭实验中,Jurkat细胞和BMMNC经不同浓度EGCG预处理12、24、48h后,细胞的迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数均明显减少,与对照组比较,有显著的差异(P 0.05),且呈现剂量和时间依赖性。结论 EGCG能有效地抑制ALL肿瘤细胞的增殖、诱导其凋亡,并降低其迁移和侵袭能力。     

骨髓基质细胞及VLA-4抗体对儿童白血病细胞凋亡影响的研究

目的：研究骨髓基质细胞（BMSCs）对儿童白血病细胞的保护作用及细胞粘附分子缓慢抗原-4（VLA-4）抗体对原代白血病细胞凋亡的影响。方法：分离儿童白血病骨髓单个核细胞,培养BMSCs及白血病细胞。实验分4个组：①白血病细胞单独培养组（对照组）;②BMSCs＋白血病细胞组（BMSCs组）;③BMSCs上清+白血病细胞组（上清组）;④BMSCs＋白血病细胞＋VLA-4抗体组（抗体组）。流式细胞仪检测各组白血病细胞的凋亡率,RT-PCR方法检测各组白血病细胞survivin和bcl-2基因的表达。结果：BMSCs组和上清组的白血病细胞凋亡率均低于对照组,P<0.05。与BMSCs组和上清组比较,抗体组的凋亡率显著增高,P<0.05。抗体组12 h的凋亡率与24 h的凋亡率比较,差异有统计学意义,P<0.01。与BMSCs组和上清组比较,抗体组survivin、bcl-2基因的表达均有降低,P<0.05。结论：BMSCs对白血病细胞有保护作用,VLA-4抗体能够抑制白血病BMSCs与白血病细胞间的粘附,促进白血病细胞的凋亡。［中国当代儿科杂志,2010,12（11）：897-901］     

糖皮质激素对急性淋巴细胞白血病Puma表达的影响

目的：糖皮质激素可通过调节某些基因的表达而诱导细胞凋亡,但在治疗白血病过程中对促凋亡蛋白Pum a表达的影响尚不清楚,该实验试探讨糖皮质激素在诱导体外培养的急性淋巴细胞白血病细胞凋亡过程中对Pum a表达的影响。方法：利用人急性淋巴细胞白血病细胞移植到免疫缺陷小鼠体内建立的细胞系,地塞米松处理后MTT比色法进行药物敏感性实验、W estern印迹及实时荧光定量PCR检测Pum a蛋白及mRNA的表达。结果：来源于临床疗效好的病例样本,其体外培养的白血病细胞对地塞米松敏感,来源于临床疗效差的病例样本,其体外培养的白血病细胞对地塞米松耐药,耐药组与敏感组白血病细胞间对地塞米松的体外敏感性有显著差异(P<0.05)。地塞米松处理后耐药组及敏感组均未见Pum a蛋白及mRNA的表达上调。结论：糖皮质激素在诱导体外培养的白血病细胞凋亡过程中,不能引起Pum a表达的上调。     

反义Survivin对血管瘤内皮细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨脂质体转染Survivin反义寡核苷酸(ASODN)对体外培养的增生期血管瘤内皮细胞增殖、凋亡的影响.方法 人工合成Survivin ASODN,通过脂质体转染到体外培养的增生期血管瘤内皮细胞,光镜和倒置相差显微镜观察转染后细胞形态变化;用四氮唑盐(MTT)法观察转染后48 h不同浓度Survivin ASODN对细胞生长抑制的影响;RT-PCR、Western-blot及免疫组化法检测转染后内皮细胞Survivin mRNA水平、蛋白水平表达及Caspase-3蛋白表达.结果 不同浓度的Survivin ASODN作用后内皮细胞多数变圆、变小、脱落,胞膜皱褶、卷曲,细胞核固缩、碎裂,核被染成深蓝色或蓝黑色,以600 nmol/L作用72 h改变最明显.细胞生长受到明显抑制,600 nmol/LSurvivin ASODN时细胞生长抑制率最高,可达70.5%.与对照组相比,实验组Survivin mRNA、蛋白水平表达均明显下调,Caspase-3蛋白表达明显上调.结论 在体外RNA干扰靶向抑制Survivin基因可以显著抑制增生期血管瘤内皮细胞增殖,促进细胞凋亡;Survivin可能是控制血管瘤内皮细胞增殖或凋亡的关键基因之一.

Abstract：

Objective To evaluate the effects of survivin on cell proliferation and apoptosis in proliferative hemangioma endothelial cells. Methods Hemangioma endothelial cells were cultured in vitro and transfected with Survivin antisense oligonucleotides. The morphological changes were assessed with light microscopy and inverted phase contrast microscopy and electron microscopy. MTT assay was carried out to determine cell proliferation in proliferative hemangioma endothelial cells treated with antisense compounds. By using RT-PCR and Western blot, the expression levels of survivin mRNA and proteins were quantified. Active caspase-3 was evaluated by immunohistochemistry. Results Some morphological changes (e. g. round endothelial cells, reduced cell volume, folded cell membrane and condensed nuclei ) were revealed after transfection with increasing concentration of survivin ASODN, and these changes were most significant at the dose of 600nM at 72 hours. Endothelial cell growth was suppressed at the concentration of 600nmol/L Survivin ASODN. Survivin mRNA, protein were down-regulated significantly and Caspase-3 was up-regulated significantly in the experimental groups. Conclusions Down-regulation of survivin expression induced by the antisense compounds reduces cell growth potential, promotes apoptosis in proliferative hemangioma endothelial cells. Survivin protein is a key molecule associated with proliferation and apoptosis,and antisense oligonucleotides targeting survivin could be used as a potential therapy of proliferative hemangioma.     

儿童急性淋巴细胞白血病及阿霉素所致Jurkat细胞凋亡时WAVE1表达研究

目的：初步探讨WASP家族Verprolin同源蛋白1（WAVE1）在急性淋巴细胞白血病（ALL）发病中可能的作用及意义。方法：运用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）半定量法和蛋白质印迹（Western blotting）分别检测40例ALL初治患儿、15例化疗完全缓解半年、4例复发、10例非白血病患儿BMMCs中WAVE1 mRNA和蛋白的表达水平。以不同浓度阿霉素处理Jurkat细胞：①采用MTT法测细胞增殖;②采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;③采用RT-PCR和Western blotting检测WAVE1表达。结果：ALL初治和复发患儿BMMCs均有WAVE1 mRNA和蛋白的表达,对照和缓解组BMMCs中mRNA和蛋白低表达或无表达,初治和复发组的WAVE1 mRNA和蛋白的表达表达水平显著高于化疗后缓解组和对照组（P<0.01）。阿霉素明显抑制Jurkat细胞增殖,抑制作用呈剂量时间依赖效应（P<0.05）;阿霉素作用24 h后,细胞凋亡随药物浓度增增高而增加,与对照组相比,差异有显著性(P<0.05);细胞WAVE1 mRNA和蛋白表达水平随阿霉素处理浓度的增高而降低,与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。结论：WAVE1在ALL患儿BMMCs中高表达;WAVE1可能与儿童ALL病程相关,它可能成为动态检测儿童ALL病情的一个新指标。     

人参皂甙对人白血病-60细胞凋亡的影响

目的：探讨人参皂甙对白血病细胞的致凋亡作用及其相关作用机制。方法：采用MTT细胞毒实验检测不同浓度（100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 μmol/L）人参皂甙对人白血病-60（HL-60）细胞的生长抑制活性;流式细胞术Annexin V/PI双染法检测不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）人参皂甙诱导HL-60细胞凋亡情况;提取各种浓度人参皂甙处理的细胞总蛋白,Western blot检测caspase-8、caspase-9和caspase-3裂解情况;Western blot检测10 μmol/L人参皂甙处理HL-60细胞后caspase-8和caspase-9 抑制剂对caspase-3 裂解情况的影响。结果：人参皂甙对白血病HL-60细胞具有高效的细胞毒作用,IC50值为7.3±1.2 μmol/L;0、5、10、20 μmol/L 人参皂甙处理HL-60细胞48 h后,流式细胞仪检测细胞的凋亡率呈剂量依赖性,各处理组之间差异有统计学意义（F=12.67,P<0.01）;Western blot检测细胞中caspase-9和caspase-3出现裂解带,而caspase-8未出现裂解带;10 μmol/L人参皂甙诱导caspase-3裂解可以被caspase-9的特异性抑制剂Z-LEHD-FMK所抑制,而caspase-8的特异性抑制剂Z-IETD-FMK却没有这一作用。结论：人参皂甙对人白血病HL-60细胞具有高效的致凋亡作用,激活线粒体凋亡途径可能是其致凋亡的主要作用机制。     

Caspase-3,-8,-9在铜诱导大鼠原代皮层神经元凋亡中的作用研究

目的通过建立体外铜诱导神经元模型,观察醋酸铜对大鼠原代皮层神经元凋亡及活化caspase-3,caspase-8和caspase-9蛋白表达的影响,探索高浓度铜导致大鼠神经元损伤的作用机制。方法采用不同浓度(20,40,80μM)醋酸铜诱导体外培养72h的大鼠原代皮层神经元;MTT法检测神经元活力,Hoechst33258染色和流式Annexin-V/PI法检测神经元凋亡,Western blot法检测不同浓度和时间点活化的caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白表达。结果体外培养的原代皮层神经元经醋酸铜诱导48h后,凋亡率上升,细胞活力呈浓度梯度下降,活化的caspase-8和caspase-9在铜诱导4h20μM组开始升高,48h各浓度组表达最高,呈时间与浓度梯度依赖;活化caspase-3在铜诱导24h20μM组才开始升高,激活的时间晚于caspase-8和caspase-9,48h各浓度组表达最高。结论过量铜可导致体外培养大鼠原代皮层神经元发生凋亡,caspase-3、caspase-8和caspase-9级联反应在铜诱导皮层神经元凋亡过程中发挥重要调控作用。     

Caspase-3,-8,-9在铜诱导大鼠原代皮层神经元凋亡中的作用研究

目的:通过建立体外铜诱导神经元模型,观察醋酸铜对大鼠原代皮层神经元凋亡及活化caspase-3,caspase-8和caspase-9蛋白表达的影响,探索高浓度铜导致大鼠神经元损伤的作用机制。方法:采用不同浓度（20,40,80 μM）醋酸铜诱导体外培养72 h的大鼠原代皮层神经元;MTT法检测神经元活力,Hoechst33258染色和流式Annexin-V/PI法检测神经元凋亡,Western blot法检测不同浓度和时间点活化的caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白表达。结果:体外培养的原代皮层神经元经醋酸铜诱导48 h后,凋亡率上升,细胞活力呈浓度梯度下降,活化的caspase-8和caspase-9在铜诱导4 h 20 μM组开始升高,48 h各浓度组表达最高,呈时间与浓度梯度依赖;活化caspase-3在铜诱导24 h 20 μM组才开始升高,激活的时间晚于caspase-8和caspase-9,48 h各浓度组表达最高。结论:过量铜可导致体外培养大鼠原代皮层神经元发生凋亡,caspase-3、caspase-8和caspase-9级联反应在铜诱导皮层神经元凋亡过程中发挥重要调控作用。［中国当代儿科杂志,2009,11（11）：917-922］     

Interferon-gamma sensitizes osteosarcoma cells to Fas-induced apoptosis by up-regulating Fas receptors and caspase-8

BACKGROUND: Osteosarcoma is the third most frequent neoplasm in adolescents. Although chemotherapy, frequently used in pre- and post-operative settings, has resulted in significant improvement in disease-free survival, some patients show little sensitivity to chemotherapy and alternative therapeutic strategies are needed. Because the Fas ligand/Fas receptor (CD95, APO-1) apoptosis pathway is a potential therapeutic target in osteosarcomas, we examined the effect of IFN-gamma on Fas-induced apoptosis in four osteosarcoma cell lines. PROCEDURE AND RESULTS: As measured by flow cytometry, all cell lines expressed cell surface IFN-gamma receptors, and when cultured for 2 days in the presence of IFN-gamma, all cell lines exhibited a significant increase in expression of Fas receptors. By flow cytometric detection of intracellular fragmented DNA as a marker of apoptosis, all cell lines cultured with either IFN-gamma or anti-Fas antibody (clone CH-11) alone showed only moderate apoptosis, whereas significantly high levels of apoptosis occurred in cells cultured with both IFN-gamma and CH-11. Western blotting analysis also revealed that IFN-gamma caused up-regulation of caspase-8 in all cell lines, but no change in Fas-associated death domain protein (FADD/MORT1) or caspase-3. Both caspase-8 and caspase-3 were activated when apoptosis was induced with both IFN-gamma and CH-11. Addition to cultures of z-IETD-fmk, an inhibitor of caspase-8, significantly blocked this apoptosis. CONCLUSIONS: IFN-gamma sensitizes osteosarcoma cells to Fas-induced apoptosis through up-regulation of Fas receptor and caspase-8. Combined immunotherapy with IFN-gamma and either anti-Fas monoclonal antibody or cytotoxic T cells that bear Fas ligand might be a useful adjunctive therapy for patients with osteosarcoma.