LHRH-PE40识别结肠癌细胞膜表面蛋白的研究

目的探讨人结肠癌细胞系Lovo及人白血病细胞系Jurket细胞膜表面蛋白能否识别LHRH-PE40及是否存在竞争性抑制。方法将结肠癌细胞系Lovo及白血病细胞系Jurket制备成细胞膜,利用125I标记的LHRH-PE40与两种细胞膜进行放射性配基分析,与LHRH进行竞争结合分析。结果人结肠癌细胞系Lovo的结合竞争符合特异性配基-受体结合、竞争;而白血病细胞系Jurket未见配基-受体特异性结合。其中LHRH-PE40与Lovo细胞的亲和力:Kd=10·6±2·33nmol/L,容量Bmax=345±7·59pmol/mg。结论LHRH是结肠癌免疫治疗的有效靶点,LHRH-PE40对过度表达LHRH受体的结肠癌具有特异性杀伤作用,而对无LHRH表达的肿瘤无杀伤作用,对于药物的临床应用有着指导意义。     

LHRH-PE40诱导分化胃癌细胞凋亡的研究

目的研究NF-κB mRNA和Caspase-3mRNA及其蛋白在诱导分化BGC-823细胞中的表达,探讨LHRH-PE40与胃癌细胞凋亡的关系。方法应用RT-PCR、Western blot法检测BGC-823细胞中NF-κB P65mR-NA、Caspase-3mRNA表达及其蛋白的表达情况。结果 LHRH-PE40诱导BGC-823细胞凋亡时,NF-κB mRNA和Caspase-3mRNA表达水平有所增加,NF-κB P65和Caspase-3P20活性片段也增加。结论 LHRH-PE40可以诱导胃癌细胞内NF-κB的活化;引起Caspase-3级联反应,促进细胞凋亡。     

人胃癌微环境来源间充质干细胞促进胃癌细胞BGC-823的体外增殖、迁移和促血管生成能力

目的探讨人胃癌微环境来源间充质干细胞(GC-MSCs)能否促进胃癌细胞增殖、迁移及其体外促血管生成能力。方法采用MTT增殖试验和细胞克隆形成试验观察GC-MSCs细胞对胃癌细胞系BGC-823生长的影响;Transwell迁移试验检测GC-MSCs细胞对BGC-823细胞迁移能力的影响;利用管形成试验观察并分析GC-MSCs细胞对BGC-823细胞促血管生成能力的影响;RT-PCR检测GC-MSCs细胞作用BGC-823细胞后其促血管生成相关基因(VEGF、MIP-2和TGF-β1基因)的表达情况。结果 MTT增殖试验和克隆形成试验结果表明,GC-MSCs来源的细胞培养上清可以明显促进胃癌细胞BGC-823的体外生长(P0.05);Transwell迁移试验结果表明,GC-MSCs来源细胞培养上清对BGC-823的迁移能力具有显著促进作用(P0.01);RT-PCR检测结果显示,GC-MSCs来源的细胞培养上清可明显上调促血管生成相关因子(VEGF、MIP-2和TGF-β1基因)在BGC-823细胞中的表达水平;管形成试验结果显示,BGC-823和GC-MSCs细胞共培养上清与BGC-823、GC-MSCs单独培养组相比具有更强的促血管生成能力。结论 GC-MSCs可通过旁分泌的方式促进胃癌细胞增殖、迁移及其促血管生成能力,进而诱导胃癌的恶性转化。     

脂蟾毒配基对人胃癌BGC-823细胞系细胞生长的干预效应

目的:观察中药蟾酥主要成分之一——脂蟾毒配基对体外培养人胃癌BGC-823细胞系细胞生长的干预及其与细胞色素C和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化的关系。方法:实验于2004-09/2005-12在北京大学医学部细胞生物学系实验室完成。体外培养人胃癌BGC-823细胞系,脂蟾毒配基各组加入不同浓度的脂蟾毒配基(先用二甲基亚砜溶解,再经RPMI-1640培养液稀释至终浓度。细胞增殖及增殖抑制实验、细胞核形态观察及核DNA含量测定实验中脂蟾毒配基浓度分别为0.1,1,10μmol/L;细胞周期分布实验、细胞凋亡率实验、线粒体膜电位实验中脂蟾毒配基浓度分别为0,1,2.5,5μmol/L)。空白对照组加入RPMI-1640培养液。盐酸阿克拉霉素组加入5μmol/L盐酸阿克拉霉素。采用酸性磷酸酶法检测细胞增殖抑制作用;细胞荧光分光光度仪观察细胞核形态及核DNA含量测定;流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率及其线粒体膜电位变化;Westernblot检测与细胞凋亡相关基因蛋白表达的变化。结果:①经0.1,1,10μmol/L脂蟾毒配基分别作用24,48,72h后,细胞生长显著抑制,脂蟾毒配基对癌细胞的生长抑制百分率与剂量、时间呈正相关,其IC50分别为3.9,2.0,1.5μmol/L。②随脂蟾毒配基作用浓度和时间的延长,癌细胞核荧光强度减弱,细胞核DNA含量明显降低。③0.1,1μmol/L脂蟾毒配基作用24～48h后癌细胞阻滞在S期,5μmol/L脂蟾毒配基作用72h时,细胞阻滞在G2 M期;盐酸阿克拉霉素与癌细胞作用24～48h,细胞阻滞在S期,作用72h时细胞阻滞在G2 M期。④脂蟾毒配基作用后,细胞凋亡率明显高于对照组。⑤脂蟾毒配基引起细胞线粒体膜电位下降,释放入胞质中的细胞色素C增多,促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白活化,抑制Bcl-2蛋白表达,诱导细胞凋亡。结论:体外实验条件下,脂蟾毒配基抑制人胃癌BGC-823细胞生长并诱导细胞发生凋亡,其诱导凋亡作用机制与线粒体通路有关。     

三氧化二砷对人胃癌细胞BGC-823凋亡及耐药基因表达影响的研究

目的:研究三氧化二砷(As2O3)对人胃癌细胞系BGC-823的凋亡诱导作用及对LRP、C-myc基因表达的影响.方法:进行体外细胞培养,MTT法,流式细胞术检测As2O3对人胃癌细胞系BGC-823的凋亡诱导作用;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测LRP、C-myc mRNA的表达.结果:As2O3对人胃癌BGC-823细胞具有抑制作用,其抑制率呈时间-剂量依赖关系.不同浓度的As2O3均可诱导凋亡.1.0 μmol/L、2.0 μmol/L的As2O3可下调LRP、C-myc的表达.结论:As2O3具有抗胃癌作用,主要通过诱导细胞凋亡实现,其机制可能与下调LRP、C-myc表达有密切关系.     

养胃抗瘤冲剂及其拆方对人胃癌细胞系MGC-803及BGC-823侵袭重组基底膜的作用及作用途径

目的:观察人胃癌细胞系MGC-803,BGC-823对重组基底膜的侵袭作用,分析养胃抗瘤冲剂对其侵袭作用的影响及可能作用途径。方法:实验于2001-05/2001-10在中国中医研究院广安门医院肿瘤细胞生物学实验室完成。选取日本健康雌性大耳白兔21只,按随机数字表法分为7组,即养胃抗瘤冲剂组及拆方(益气方、活血方、解毒方、益气活血方、益气解毒方)组、空白血清组,制备含药血清。采用Transwell细胞培养小室建立人肿瘤细胞系体外侵袭模型,动态观察人胃癌细胞系MGC-803,BGC-823对重组基底膜的侵袭作用以及中药复方养胃抗瘤冲剂(由生黄芪、人参、白花蛇舌草、草河车、三七、苏木等组成,每克含生药3.22g,由中国中医研究院广安门医院制剂室提供)及拆方的含药血清、化疗药顺氯氨铂对胃癌细胞系侵袭作用的影响,侵袭抑制率(%)=(对照组侵袭细胞数-给药组侵袭细胞数)/对照组侵袭细胞数×100%,凡抑制率达30%以上,认为有抗侵袭作用。同时采用流式细胞仪通过单克隆抗体标记的方法检测侵袭转移相关黏附蛋白CD9,CD31,CD36,CD42a,CD44,CD49d,CD62p,CD41、凝血酶敏感蛋白及CD63的表达。结果:①各组人胃癌细胞系MGC-803,BGC-823对重组基底膜侵袭作用的抑制率比较:养胃抗瘤冲剂组、益气组、解毒组对人胃癌细胞MGC-803的抑制率均显著高于空白血清组(55.14%,32.43%,36.59%,0,P<0.05)。益气解毒、益气活血组作用优于单纯解毒、益气、活血组,但两组比较差异无显著性意义(44.86%,41.23%,P>0.05)。人胃癌细胞MGC-803与BGC-823比较,侵袭作用MGC-803强于BGC-823(空白血清组侵袭细胞数分别为60.75±4.57,56.35±3.25),养胃抗瘤冲剂及拆方对MGC-803的抑制作用强于BGC-823,但比较差异无显著性意义(P>0.05)。②各组人胃癌细胞系MGC-803,BGC-823侵袭转移相关黏附蛋白的表达水平比较:养胃抗瘤冲剂组肿瘤转移黏附蛋白CD63、凝血酶敏感蛋白的表达水平低于空白血清组(药物作用24h:3.30%,3.10%;24.97%,11.50%;48h:0.93%,3.56%;5.78%,10.41%),抑制肿瘤转移的黏附蛋白如CD9的表达水平高于空白血清组(药物作用24h:90.49%,86.23%;48h:94.81%,77.69%)。单纯的活血药在给药早期(24h)则可以促进CD63的表达(33.12%),随着给药时间的延长(48h)则降低CD9表达(30.22%);益气活血组则可纠正活血药的这种作用(24hCD63:3.55%;48hCD9:82.92%)。结论:人胃癌细胞系MGC-803,BGC-823对重组基底膜均具有侵袭作用,MGC-803的侵袭作用强于BGC-823。养胃抗瘤冲剂及拆方对MGC-803的抗侵袭作用优于BGC-823。养胃抗瘤冲剂抗人胃癌细胞侵袭作用的可能作用途径在于可降低部分促进肿瘤转移的黏附蛋白如CD63、凝血酶敏感蛋白的表达,对抑制肿瘤转移的黏附蛋白如CD9表达有促进作用。     

脂蟾毒配基对人胃癌BGC-823细胞系细胞生长的干预效应

目的：观察中药蟾酥主要成分之一——脂蟾毒配基对体外培养人胃癌BGC-823细胞系细胞生长的干预及其与细胞色素C和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化的关系。 方法：实验于2004—09／2005—12在北京大学医学部细胞生物学系实验室完成。体外培养人胃癌BGC-823细胞系，脂蟾毒配基各组加入不同浓度的脂蟾毒配基（先用二甲基亚砜溶解，再经RPMI-1640培养液稀释至终浓度。细胞增殖及增殖抑制实验、细胞核形态观察及核DNA含量测定实验中脂蟾毒配基浓度分别为0．1，1，10μmol／L；细胞周期分布实验、细胞凋亡率实验、线粒体膜电位实验中脂蟾毒配基浓度分别为0，1,2．5，5μmol／L）。空白对照组加入RPMI-1640培养液。盐酸阿克拉霉素组加入5μmoL／L盐酸阿克拉霉素。采用酸性磷酸酶法检测细胞增殖抑制作用；细胞荧光分光光度仪观察细胞核形态及核DNA含量测定；流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率及其线粒体膜电位变化；Western blot检测与细胞凋亡相关基因蛋白表达的变化。 结果：①经0．1，1，10μmol／L脂蟾毒配基分别作用24，48，72h后，细胞生长显著抑制，脂蟾毒配基对癌细胞的生长抑制百分率与剂量、时间呈正相关，其IC50分别为3．9，2．0，1．5μmol／L。②随脂蟾毒配基作用浓度和时间的延长，癌细胞核荧光强度减弱，细胞核DNA含量明显降低。③0．1，1μmol／L脂螗毒配基作用24～48h后癌细胞阻滞在S期，5μmol／L脂蟾毒配基作用72h时，细胞阻滞在G2＋M期；盐酸阿克拉霉素与癌细胞作用24～48h，细胞阻滞在S期，作用72h时细胞阻滞在G2＋M期。④脂蟾毒配基作用后，细胞凋亡率明显高于对照组。⑤脂蟾毒配基引起细胞线粒体膜电位下降，释放人胞质中的细胞色素C增多，促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白活化，抑制Bel-2蚤白表达，诱导细胞凋亡。 结论：体外实验条件下，脂蟾毒配基抑制人胃癌BGC-823细胞生长并诱导细胞发生凋亡，其诱导凋亡作用机制与线粒体通路有关。     

肝癌细胞单克隆抗体磁珠对人肝癌、胃癌细胞株特异性富集的实验研究

目的探讨肝癌细胞单克隆抗体(4-E9)免疫磁珠与上皮黏附分子(Epcam)磁珠的联合应用能否提高免疫磁珠对人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人胃癌细胞(BGC-823)的富集效率。方法通过生物素、链霉亲和素将制备的单克隆抗体与磁珠连接,制备成免疫磁珠。通过制备的两种免疫磁珠及两种免疫磁珠的联合应用分别对MCF-7,BEL-7402和BGC-823细胞进行富集率检测。结果4-E9免疫磁珠的包被率为57.8%,Epcam免疫磁珠的包被率为65.8%。4-E9免疫磁珠对MCF-7,BGC-823和BEL-7402细胞富集率分别为(44±5.33)%,(71±11.33)%和(78.3±8.46)%,Epcam免疫磁珠对BGC-823,BEL-7402和MCF-7细胞富集率分别为(55.5±8.67)%,(78.88±13.11)%和(84.31±6.83)%,两种免疫磁珠联合对BGC-823,BEL-7402和MCF-7细胞富集率分别为(80.4±8.33)%,(85.125±6.77)%和(93.23±4.33)%,联合磁珠组较4-E9免疫磁珠对BGC-823,BEL-7402,MCF-7细胞富集率差异均有统计学意义(P值分别为0.03,0.03,0.04)。联合磁珠组较Epcam免疫磁珠对BGC-823,BEL-7402,MCF-7细胞富集率差异均有统计学意义(P分别为0.04,0.03,0.04)。结论两种免疫磁珠联合使用能显著提高Epcam免疫磁珠对BEL-7402,BGC-823及MCF-7细胞富集率,4-E9抗体对循环肿瘤细胞的富集可能具有一定的临床应用价值。     

miRNA-29c表达水平与胃癌生物学特征的关系

目的：探讨微小RNA-29c（miRNA-29c）表达水平与胃癌生物学特征的关系。方法采取实时定量聚合酶链反应检测胃癌组织、正常胃上皮组织、正常胃上皮细胞系GES-1、胃癌细胞系 SGC-7901与BGC-823中miRNA-29c的表达水平。结果 miRNA-29c在胃癌组织、正常胃上皮组织相对表达量分别为（0．71±0．32）、（1．21±0．34）,比较差异有统计学意义（P＜0．05）;miRNA-29c在GES-1、SGC-7901、BGC-823细胞系的相对表达量分别为（1．03±0．07）、（0．62±0．11）、（0．32±0．12）。miRNA-29c表达水平与肿瘤直径、Ming分型、TNM 分期、淋巴结转移密切相关（P＜0．05）,与患者性别、年龄和肿瘤组织分化程度、侵润程度无关（P＞0．05）。转染miRNA-29c模拟物可抑制BGC-823细胞的增殖,增加细胞凋亡率;减少G0/G1期细胞,增加S期细胞。结论 miRNA-29c表达水平与胃癌生物学特征具有密切的联系,可能参与了胃癌的侵润与转移。miRNA检测在胃癌患者预后判断方面具有一定的应用价值。     

塞来昔布对胃癌细胞株BGC-823的增殖的影响

目的研究塞来昔布在体外对人胃癌细胞BGC-823生长增殖的影响及其抗肿瘤的相关分子机制。方法体外培养人胃癌BGC-823,MTT法检测塞来昔布在相同浓度下,不同时间对于胃癌细胞增殖的影响,并计算半数抑制浓度(IC50)值;RT-PCR法检测对COX-2、MMP-9的mRNA的表达影响。结果 MTT结果显示:相同干预浓度塞来昔布抑制人胃癌细胞增殖,其24h、48h、72h的IC50分别为:158.98μmol/L、75.45μmol/L、45.08μmol/L;RT-PCR结果显示:人胃癌细胞BxPC-3正常对照组及塞来昔布干预组COX-2 mRNA灰度值分别为:0.873±0.026,0.115±0.008,P<0.05;MMP-9 mRNA灰度值分别为:0.890±0.011,0.209±0.012,P<0.05。结论塞来昔布抑制胃癌细胞增殖,塞来昔布抗肿瘤机制可能通过抑制COX-2及MMP-9的mRNA的表达来实现的。