应用激光显微分离技术在骨肉瘤组织原位筛选噬菌体肽库

目的将激光显微分离(laser capture microdissection, LCM) 技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选过程,建立一种可以直接在天然组织中筛选肽库的方法。方法将新鲜人骨肉瘤组织块在噬菌体肽库溶液振荡孵育后制成组织冰冻切片,免疫组化染色检测噬菌体在组织中的浸润扩散。改进常规LCM切片处理方法,以冻干法替代酒精/二甲苯法脱水,以期在LCM操作过程中提高切片上噬菌体的存活率。LCM法分离摄取骨肉瘤切片上的肿瘤靶细胞,转染回收这些细胞上特异结合的噬菌体。滴定法检测所筛选的噬菌体对特异性细胞的亲和力。结果利用LCM技术,可以由肿瘤冰冻切片上收集到足够的与特异性噬菌体短肽,应用于噬菌体表面呈现肽库筛选。经过3轮筛选后所获得的噬菌体与人骨肉瘤组织的特异性亲和力提高16倍。结论本研究首次将LCM技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选,可以使我们直接在新鲜人肿瘤组织中筛选与特定细胞群甚至单个细胞亲合的短肽;同时又避免了天然组织中其他杂质细胞的污染,为研制细胞特异性导向载体提供了一个新的途径。     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的：获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽，作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法：以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞，成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选，用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：经三轮筛选，从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个特异性与骨肉瘤细胞os-732结合，而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论：得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆，提示骨肉瘤细胞表面结构复杂，具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性，为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

靶向肿瘤干细胞标记CD133特异性结合肽的筛选和初步鉴定

摘要：目的筛选可与人肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合的短肽并进行初步鉴定。方法首先合成人肿瘤干细胞
表面标记物CD133 细胞外片段的生物素化蛋白,以此为靶,利用噬菌体肽库技术,高通量液相淘选CD133 的特异性短
肽。应用夹心EL ISA选择出结合较强的克隆。提取DNA测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性,根据噬菌体基因序
列推导出多肽序列。通过免疫荧光技术初步验证合成多肽和人大肠癌细胞的结合情况。结果4 轮液相筛选后,与
CD133特异性结合的噬菌体得到有效富集,第4轮与第1轮相比,富集了388倍。经ELISA 鉴定的20个噬菌体单克隆中,
有13个与CD133有较高亲和力,具有阳性意义。经比对得到11条完全一致的氨基酸序列TISWPPR,2条完全一致的氨
基酸序列STTKLAL,竞争性阻断ELISA实验表明第一条特异性较强。结论成功利用噬菌体肽库技术,淘选出1条可和
人CD133特异性结合的高亲和力短肽,为后续CD133的研究奠定了基础,表明从噬菌体肽库中液相淘选生物素化小分子
的高亲和力多肽的方法切实可行。     

人骨肉瘤细胞特异性结合肽的筛选及验证

目的获得人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽,为骨肉瘤靶向治疗奠定基础。方法应用噬菌体展示技术,以人骨肉瘤细胞作为靶细胞,293T细胞为差减细胞,筛选获得MG-63细胞特异性结合肽。酶联免疫法进行靶向性验证。应用荧光染色技术初步探讨短肽细胞受体位置。制作人骨肉瘤模型,尾静脉注射目标噬菌体,免疫组化检测其靶向性。结果经过四轮一步有机相离心分离方法,获得了与骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,并测序获得其中出现次数最多的序列SLTNLSK,靶向验证结果显示该短肽有较强的特异性。结论应用噬菌体展示技术,获得了与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,序列为SLTNLSK,并验证了其靶向性。可以作为骨肉瘤靶向治疗的导向性化合物。     

肿瘤干细胞表面标记物CD133高亲和结合肽的筛选

目曲:应用噬菌体肽库技术筛选肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合短肽,为干细胞研究、肿瘤治疗及抗肿瘤转移研究提供新的技术和工具.方法:利用链霉亲和素与生物素的高度亲和力,以生物素标记的鼠CD133细胞外段(bio-CD133)为靶,对噬菌体七肽库进行液相筛选,应用夹心ELISA选择出结合较强的克隆,提取DNA并测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性.结果:通过三轮体外液相筛选,得到结合能力较强的高亲和结合肽,5条完全一致的重复序列为APSPMIW和3条完全一致的重复序列为LQNAPRS,竞争性阻断实验证实其特异性较强.结论:利用噬菌体肽库技术成功地筛选出具有较高亲和力和特异性的CD133结合肽,表明以生物素标记的小分子多肽为靶筛选结合肽的技术具有可行性.     

人骨肉瘤细胞特异性结合肽的筛选及验证

摘要：目的获得人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽,为骨肉瘤靶向治疗奠定基础。方法应用噬菌体展示技术,以人骨肉瘤细
胞作为靶细胞,293T细胞为差减细胞,筛选获得MG-63细胞特异性结合肽。酶联免疫法进行靶向性验证。应用荧光染色技术
初步探讨短肽细胞受体位置。制作人骨肉瘤模型,尾静脉注射目标噬菌体,免疫组化检测其靶向性。结果经过四轮一步有机
相离心分离方法,获得了与骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,并测序获得其中出现次数最多的序列SLTNLSK,靶向验证结果显示
该短肽有较强的特异性。结论应用噬菌体展示技术,获得了与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,序列为SLTNLSK,并验证了
其靶向性。可以作为骨肉瘤靶向治疗的导向性化合物。
     

津白Ⅱ小鼠体内筛选乳腺癌特异性结合噬菌体融合肽

目的：利用噬菌体随机肽库，筛选特异性靶向乳腺癌的肽段，为乳腺癌的定位诊断和靶向治疗提供理论依据。方法：建立津白Ⅱ（TAⅡ）小鼠自发乳腺癌模型，并在小鼠体内对噬菌体十二随机肽库进行4轮筛选，回收肿瘤和对照组织（肝）的噬菌体并计数，同时用免疫组织化学染色法，鉴定噬菌体展示肽的特异性。结果：筛选出自发乳腺癌特异性结合的噬菌体．其结合乳腺癌细胞的能力为对照组织的14倍，随机挑选克隆测序鉴定，结果表明十二肽ASANPFPTKALL出现次数最多．免疫组化染色进一步证明该噬菌体能特异结合于乳腺癌细胞。结论：4次小鼠体内筛选得到的短肽ASANPFPTKALL能够特异结合于乳腺癌组织。为下一步的定位诊断和靶向治疗研究奠定了基础。     

CD20抗原模拟表位的筛选

目的：筛选CD20分子的模拟表位肽,构建针对CD20分子的治疗性疫苗,以期为淋巴瘤以及其它B细胞相关性疾病的治疗提供新的方向.方法：利用噬菌体随机呈现肽库筛选技术,以人淋巴细胞分化抗原CD20 mAb Rituximab为靶点,筛选CD20分子的模拟表位肽.通过ELISA方法检测筛选出的阳性噬菌体与Rituximab的特异性结合,并以竞争性结合实验检测筛选出的阳性噬菌体与Raji细胞表面的CD20分子竞争结合Rituximab的能力.最后以Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列,推断其氨基酸序列.结果：成功筛选出针对CD20 mAb Rituximab的阳性噬菌体,获得了CD20分子的模拟表位肽QDKLTQWPKWLE.获得的阳性噬菌体能够与Rituximab特异性结合,并且表达该表位的噬菌体可以竞争性抑制Rituximab与天然CD20分子的结合.结论：CD20分子的抗原表位肽QDKLTQWPKWLE能够与mAb Rituximab特异性结合,与天然CD20分子竞争性结合mAb Rituximab,并具有潜在的应用价值.     

卵巢癌细胞表面特异性结合肽的筛选及鉴定

目的利用噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞HO-8910表面特异性结合肽。方法利用噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞株HO-8910,经过3轮生物淘洗,随机挑选21个噬菌体单克隆进行ELISA试验,挑选亲和力高的17个噬菌体进行DNA序列测定,随后利用噬菌体结合实验、免疫细胞染色、免疫荧光染色、竞争抑制等实验鉴定阳性噬菌体的特异性。结果展示短肽MRMTIIN的噬菌体克隆对HO-8910细胞株有较高的亲和力和特异性。结论噬菌体展示技术筛选的短肽MRMTIIN可为上皮性卵巢癌的早期诊断提供新的思路。     

人结肠癌血管特异结合短肽的噬菌体肽库筛选及鉴定

目的：通过建立小鼠肾包膜下荷人结肠癌模型、利用噬菌体肽库体内筛选技术,筛选并鉴定能够与人结肠癌血管内皮细胞特异结合的噬菌体呈现短肽.方法：制备免疫抑制小鼠肾包膜下人结肠癌移植瘤动物模型.将随机环七肽库通过尾静脉注入荷瘤鼠体内,回收归巢于肿瘤组织的噬菌体,进行4轮体内筛选,随机挑取20个克隆进行测序.细胞ELISA实验初步鉴定阳性噬菌体的内皮细胞结合能力.免疫细胞化学染色鉴定阳性噬菌体克隆与共培养内皮细胞的结合能力.免疫荧光技术检测短肽与共培养内皮细胞的特异性结合能力.结果：18个克隆测序正确,它们呈现2种氨基酸序列,命名为CV1及CV2,其呈现噬菌体称为pCV1及pCV2,其中CV2/pCV2重复次数多.细胞ELISA结果显示pCV2与Co-HUVECs（与结肠癌细胞共培养的人脐静脉内皮细胞）的结合明显高于HUVECs（人脐静脉内皮细胞）,有显著的差异性结合,而pCV1在Co-HUVECs,HUVECs上结合均较少,无差异性结合.免疫荧光染色结果显示,FITC-CV2特异性结合于Co-HUVECs的胞膜与核周胞质.结论：得到两个能特异性结合于结肠癌移植瘤的噬菌体单克隆pCV1及pCV2.pCV2具有特异结合结肠癌血管的能力,有可能用于结肠癌血管靶向治疗.     

从噬菌体肽库中筛选并鉴定CD13特异性结合肽

目的 筛选并鉴定可和单核细胞表面CD13分子特异性结合的特异性短肽.方法 以CD13为靶分子,用噬菌体展示十二肽库进行筛选,通过亲和富集法筛选表达有特异性结合肽的噬菌体,ELISA鉴定所挑选噬菌体和CD13的亲和力,根据噬菌体基因序列推导出多肽序列.对筛选到的并经比对分析认为有生物学特性的多肽进行人工合成,通过免疫荧光技术检测多肽和THP-1细胞的结合情况、位置及WM15对多肽和细胞结合的阻断作用.结果 经过四轮筛选,与CD13特异性结合的噬菌体得到有效富集并最终接近饱和状态.第4轮筛选后回收率与第1轮相比,富集了30倍.挑取的20个噬菌体单克隆中,经ELISA鉴定有10个和CD13的亲和力较高,有阳性意义.经比对得到2个有生物学功能的多肽序列P9、P7,它们分别和人巨细胞病毒(HCMV)UL38、UL105基因编码的相应氨基酸序列有83%、100%相似性.免疫荧光检测可见多肽P9、P7和THP-1细胞的结合位于细胞膜表面.WM15可以不同程度的阻断多肽和细胞的结合.结论 成功筛选出了2条可和CD13特异性结合的短肽P9、P7,而且P9、P7可以和THP-1细胞膜表面的CD13分子特异性结合.     

噬菌体肽库技术筛选肿瘤靶向短肽的研究进展

噬菌体展示技术是一项特殊的基因重组表达技术,亦是一种强大的筛选工具。1985年,Smith等成功地创立了噬菌体展示技术;1990年,Scott等在噬菌体展示技术的基础上发展并构建了噬菌体展示随机肽库。噬菌体肽库技术是一种新兴的药物发现工具［1］,通过噬菌体随机肽库筛选获得的肽可以作为分子载体运载药物,起到生物导弹的功能。筛选的肽也可以直接与药物靶点分子特异性结合,起到生物治疗的作用。近年来,噬菌体肽库技术已广泛应用于肿瘤研究,如癌症的检测和诊断、肿瘤相关抗原的筛选、肿瘤药物的研制、肿瘤细胞信号转导及肿瘤的基因治疗研究等。现就近年来噬菌体展示肽库技术在筛选肿瘤靶向短肽研究中的应用综述如下。     

人转铁蛋白受体结合肽的噬菌体肽库筛选与鉴定

目的：从噬菌体呈现12肽库中筛选与人转铁蛋白受体结合的肽．方法：以人转铁蛋白受体为靶蛋白，生物淘洗法从噬菌体呈现12肽库中筛选与之结合的阳性噬菌体，用噬菌体ELISA，FCM及免疫组化等方法检测阳性噬菌体与人转铁蛋白受体的结合活性．结果：从噬菌体肽库中筛选到-呈现SPRPRHTLRLSL肽的噬菌体，噬菌体ELISA，FCM及免疫组化等方法均证明呈现该肽的噬菌体可与人转铁蛋白受体或高表达人转铁蛋白受体的细胞结合．结论：SPRPRHTLRLSL具有与人转铁蛋白受体结合的活性，它为以转铁蛋白受体为靶点的导向性药物的开发提供了一个可能的线索．     

基于肺癌细胞特异性结合肽检测肺癌的免疫酶法

以肺腺癌A549细胞为筛选靶标,人胚肺二倍体helf细胞作反相吸附细胞,从噬菌体随机十二肽库中筛选出与肺癌细胞特异性结合的噬菌体多肽,用其替代一抗,酶标抗噬菌体抗体作二抗,建立检测肺癌细胞的免疫酶染色法。对噬菌体随机十二肽库进行4轮筛选和ELISA鉴定后,用亲和力和特异性最好的5号噬菌体克隆建立了检测肺癌细胞的免疫酶法。     

CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选

目的筛选获得高表达人CD59中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表面与人CD59特异性结合的短肽序列,为下一步研究与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供实验依据。方法以离子层析柱纯化的CHO细胞的裂解蛋白纯蛋白为靶分子分别进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,双夹心ELISA方法鉴定噬菌体阳性克隆。提取阳性单克隆单链DNA测序,并推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对CHO细胞纯蛋白有特异性结合力,经测序得到两条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对CHO细胞进行纯蛋白筛选得到了能与人CD59特异性结合的短肽序列。     

噬菌体随机肽库中B型钠尿肽结合肽的筛选及鉴定

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体随机肽库筛选肝癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的 通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定.方法 建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力.结果 成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPACl受体结合.结论 通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽.     

人离体骨肉瘤组织血管噬菌体肽库筛选模型的建立及其意义

目的 建立人离体骨肉瘤血管亲和筛选模型。方法 （1）建立模型。术前对患肢局部行数字减影造影检查，标记肿瘤固有动脉大致走行，术后小心修剪，并连接类似于Langendorff的灌流装置，监控模型血管内的pH值、温度、氧分压等；（2）对噬菌体十二肽库进行筛选。结果 28例骨肉瘤离体标本均建模成功，可直接用于灌流实验，并筛选出具有较高特异性的亲和短肽（基序为RLTR），各项指标显示离体骨肉瘤较好模拟了人体内的环境。结论 建立人离体骨肉瘤血管亲和筛选模型是可行的，可直接用于对噬菌体随机肽库的亲和筛选，为骨肉瘤的靶向化疗提供参考。