逆转录病毒载体介导的标志基因转移研究

目的：为建立高效、安全的逆转录病毒介导的基因标记系统。方法：用脂质体方法将含有标志基因 Ｎｅｏ Ｒ的逆转录病毒载体 Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 导入包装细胞 Ｐ Ａ３１７ ;通过与单向型包装细胞 Ｇ Ｐ Ｅ８６ 相互转导,获得高滴度的双嗜型产病毒细胞,并以其对人类白血病细胞进行基因标记。结果：脂质体转染法获得的病毒滴度约为２ ．０ ×１０５ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍｌ,而与 Ｇ Ｐ＋ Ｅ８６ 细胞转导后可提高至２ ．８ ×１０６ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍｌ;重组病毒转导白血病细胞（ Ｈ Ｌ－ ６０ , Ｋ５６２ , Ｋ Ｇ－ １） 后,聚合酶链反应（ Ｐ Ｃ Ｒ） 证实 Ｎｅｏ Ｒ 基因整合到靶细胞基因组,巢式 Ｐ Ｃ Ｒ 与补救分析均未能检测到辅助病毒。结论：“乒乓效应”可显著提高逆转录病毒滴度,而逆转录病毒介导的基因标记系统是安全的。     

原发性肝癌基因治疗研究——含人TNF基因重组逆转录病毒转移系…

将人ＴＮＦα基因克隆到重组逆转录病毒载体ｐＲＵＦｎｅｏ，构建了含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒载本ＲＵＦ－ＴＮＦ。将ＲＵＦ－ＴＮＦ转染包装细胞Ｆｌｙ Ａ１３，经药物筛选获得稳定分泌含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒的细胞株ＦｌｙＲＵＦＮ１４。ＦｌｙＲＵＦＮ１４产生的病毒上清液能直接转染靶细胞Ｓａｏｓ－２。本研究建立的逆转录病毒介导的ＴＮＦ基因转移系统为肝癌及其他恶性肿瘤的基因治疗提供了条件。     

逆转录病毒上清液瘤内注射介导体内mdrl基因转移

目的 探讨逆转录病毒上清液瘤内及瘤周注射介导体内ｍｄｒｌ基因转移。方法 应用逆转录病毒上清液裸鼠皮下移植瘤内及瘤周注射法转移ｍｄｒｌ基因,腹腔注射化疗药物观察肿瘤模型的耐药性,免疫组化检测肿瘤细胞Ｐ－ＧＰ的表达,ＲＴ－ＰＣＲ检测肿瘤内ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ的表达量。结果 携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒上清液注射后肿瘤模型表现出多药耐药性,高滴度病毒上清液可达到６０％细胞表达Ｐ－ＧＰ,是病毒原液基因转移率     

逆转录病毒介导的造血干细胞基因治疗

造血干细胞 (ＨＳＣ)作为基因治疗的靶细胞具有较大的疾病治疗潜能 ,基因治疗临床方案近 1 3涉及到ＨＳＣ[1 ] 。替换性基因转移可用于治疗造血系统遗传性疾病 ,包括血红蛋白病、免疫缺陷综合征、溶酶体贮积病和糖原贮积病等 ,也适应于造血系统的一些获得性疾病 ,包括抗癌化疗所诱导的骨髓抑制[2 ] ,由于癌基因活化所致的白血病[3 ] 和病毒诱导性疾病 ,如获得性免疫缺陷综合征[4] 。造血干细胞及其子代细胞直接与血液相接触 ,或存在于血液循环之中 ,极利于转染细胞的表达产物释放入血液。因此 ,除造血系统的遗传性和获得性疾病外 ,造血干细…     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。     

逆转录病毒介导的HyTK基因转移及杀伤恶性黑色素瘤细胞的…

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因导入恶性肿瘤细胞，随后应用药物丙氧鸟苷可选择性杀死肿瘤细胞。本研究中我们将ＨｙＴＫ基因克隆到逆转录病毒载体ＬＸＳＮ中，并初除其中的ＳＶ４０早期启动子，构建成重组逆转录病毒载体ＬＨｙＴＫ／Ｎ，并用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞，经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入了肿瘤细胞中，且不含可复制的辅助病毒。     

原发性肝癌基因治疗研究—含人TNF基因重组逆转录病毒转移系统的构建与表达

将人ＴＮＦα基因克隆到重组逆转录病毒载体ｐＲＵＦｎｅｏ，构建了含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒载体ＲＵＦ－ＴＮＦ。将ＲＵＦ－ＴＮＦ转染包装细胞ＦｌｙＡ１３，经药物筛选获得稳定分泌含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒的细胞株ＦｌｙＲＵＦＮ１４。ＦｌｙＲＵＦＮ１４产生的病毒上清液能直接转染靶细胞Ｓａｏｓ－２。本研究建立的逆转录病毒介导的ＴＮＦ基因转移系统为肝癌及其他恶性肿瘤的基因治疗提供了条件。     

重组逆转录病毒介导的人载脂蛋白AI基因在肌源细胞中的表达

目的 探索一种安全有效的载脂蛋白ＡＩ基因表达系统。方法 构建含人载脂蛋白ＡＩ ｃＤＮＡ的双顺反子逆转录病毒载体ｐＬＡＥＮ,用其转化小鼠原代肌母细胞及肌源性细胞Ｃ２Ｃ１２,ＥＬＩＳＡ法检测细胞液中人载脂蛋白ＡＩ的含量。结果 转化后的小鼠原代肌母细胞及Ｃ２Ｃ１２细胞在分化为肌管细胞后均获得异源表达人载脂蛋白ＡＩ的能力;而且经Ｇ４１８筛选也获得稳定转化的Ｃ２Ｃ１２细胞株,３０天后仍保持有效表达人载脂蛋白     

PRS-CTGF-SiRNA逆转录病毒载体及包装细胞株的构建

目的 用PRS逆转录病毒载体构建介导人结缔组织生长因子（CTGF）小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）表达的PRS—CTGF—SiR．NA逆转录病毒载体，并建立高效、稳定表达CTGF—SiRNA的包装细胞株。方法 根据siRNA靶序列设计要求及PRS逆转录病毒载体特点分别设计含64bp DNA序列的4对寡核苷酸，并在体外合成。PRS载体用Bg1Ⅱ、HindⅢ双酶切完全后，分别与退火的4对寡核苷酸进行连接，构建成表达CTGF小分子干扰RNA的PRS—CTGF—SiRNA逆转录病毒载体。用脂质体2000介导转染PT67包装细胞，经抗性筛选，挑单克隆，扩大培养，用NIH3T3细胞测定病毒滴度，筛选出高效产毒细胞株。结果经酶切、连接后构建成的质粒称之为PRS—CTG—siRNA1—4，经酶切与测序证实构建成功，无任何碱基突变。经脂质体介导转染包装细胞、抗性筛选和NⅠH3T3测定病毒滴度，筛选出具有高病毒滴度的细胞集落，扩大培养后建立CTGF—SiRNA高效表达的包装细胞株。结论 成功构建了能表达CTGFsiRNA的PRS—CTGF—SiRNA逆转录病毒载体，并建立了稳定、高效生产有活性的的CTGF-SiRNA产毒包装细胞株。     

病毒介导的基因转染在组织工程中的应用

目的构建重组病毒载体,将较多细胞因子通过病毒载体转入种子细胞,提高细胞增殖及分泌基质能力,维持表型,延缓老化.方法应用基因工程技术,构建缺陷型逆转录病毒重组载体和缺陷性腺病毒重组载体.分别通过PT67包装细胞筛选克隆及293细胞扩增,获得假病毒上清液,经浓缩纯化后转染靶细胞.结果成功构建胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、Fas 配体(Fas-Ligand)、绿色荧光蛋白(GFP)等逆转录病毒载体以及TGFβ1、人骨形成蛋白因子-7(hBMP7)、端粒酶、Smad3、Smad7等腺病毒载体,其中GFP-逆转录病毒重组载体在软骨细胞表达至2月.结论通过有效的含目的基因重组载体转染种子细胞,延缓体外培养细胞的老化及促进细胞的增殖与基质分泌,获得组织工程所需要的大量种子细胞,为组织工程构建奠定了基础.     

病毒介导的基因转染在组织工程中的应用

目的 构建重组病毒载体，将较多细胞因子通过病毒载体转入种子细胞，提高细胞增殖及分泌基质能力，维持表型，延缓老化。方法 应用基因工程技术，构建缺陷型逆转录病毒重组载体和缺陷性腺病毒重组载体。分别通过PT67包装细胞筛选克隆及293细胞扩增，获得假病毒上清液，经浓缩纯化后转染靶细胞结果成功构建胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、Fas配体(Fas-Ligand)、绿色荧光蛋白(GFP)等逆转录病毒载体以及TGFβ1、人骨形成蛋白因子-7(hBMP7)、端粒酶、Smad3、Smad7等腺病毒载体，其中GFP-逆转录病毒重组载体在软骨细胞表达至2月。结论 通过有效的含目的基因重组载体转染种子细胞，延缓体外培养细胞的老化及促进细胞的增殖与基质分泌，获得组织工程所需要的大量种子细胞，为组织工程构建奠定了基础。     

逆转录病毒载体介导的基因治疗中可复制逆病毒的检测

目的：探讨逆转录病毒载体导的基因治疗中,可复制逆转录病毒（ＲＣＲ）的检测方法,为其在应用中的安全性奠定基础。方法：构建含抗ＨＩＶ－、整合酶单链抗体基因的逆转录病毒表达载体（pＳＬＸＣＭＶ／ＩＮ－sＦv）,应用３Ｔ３放大实验继Ｓ＋／Ｌ－试验对其包装细胞（ＰＡ３１７／ＩＮ－sＦv）上清中ＲＣＲ进行了检测,并以野生型４０７０Ａ病毒为阳性对照。结果：含ＩＮsＦv的包装细胞上清中ＲＣＲ呈阴性,不同稀释度的阳性对照     

结核病流行现况及遗传易感性研究进展

结核病（tuberculosis,TB）是全球主要传染病死因之一,其传播广泛,并可侵犯全身各器官,对人类健康造成了巨大的威胁。TB发生发展受多因素影响,除传统的环境因素外,遗传多态性逐渐被人们重视,IFNG、P2X7、VDR等基因多态性已被发现与结核病易感性显著相关,相关研究势必为结核病预防和治疗带来新的思路。本文系统总结了结核病遗传易感性相关基因,为今后结核病预防提供参考。     

双基因导入人脐血CD34^＋细胞共表达的调控

目的 观察携带双基因的逆转录病毒载体转导人脐血ＣＤ３４＾＋细胞后,猴病毒４０（ＳＶ４０）早启动子和内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）对载体上,下游双基因共表达的影响。方法 分别构建含ＳＶ４０早启动子和ＩＲＥＳ的双基因逆转录病毒载体ｐＬＥＳＮ和ｐＬＥＩＮ,两者均携带增强型绿色荧光蛋白和新霉素抗性ｎｅｏ基因。重组载体经包装以其病毒上清感染经磁性细胞分离仪富集的人脐血ＣＤ３４＾＋细胞,而后进行集落形成细胞测     

逆转录病毒载体介导的RNAi技术稳定抑制前列腺癌细胞株β-catenin的表达

目的:建立稳定抑制β-catenin基因表达的前列腺癌细胞株,为探讨Wnt/β-catenin信号在前列腺癌发生中的作用提供合适的细胞模型。方法:在β-catenin基因编码区选择3个RNAi作用的靶位点,体外合成前体DNA链,复性后连入逆转录病毒载体pSUPER-retro,转染包装细胞PA317,收集含病毒颗粒的培养上清感染DU145细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到克隆,继续培养2个月形成稳定克隆。免疫印迹检测癌细胞内β-catenin及受其调控的靶基因c-myc和cyclinD1的表达；四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测β-catenin基因表达抑制的细胞和对照组细胞的增殖。结果:免疫印迹和RT-PCR结果显示，筛选得到的2个克隆中细胞内β-catenin表达水平下降；且克隆内c-myc，cyclinD1基因的表达下调；MTT检测显示，β-catenin表达抑制的细胞克隆吸光度值下降，这表明克隆内细胞数量减少,细胞增殖受到了抑制。结论:成功建立稳定抑制β-catenin基因表达的前列腺癌细胞株。     

逆转录病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染标记间充质干细胞

目的:为使间充质干细胞(MSCs)被绿色荧光蛋白(GFP)稳定标记,探讨通过逆转录病毒载体介导的GFP基因高效转染MSCs的方法,以便为研究在体干细胞分化奠定基础。方法:全骨髓法分离培养纯化大鼠MSCs,利用携带GFP基因的复制缺陷性逆转录病毒(R t-GFP)转染MSCs,荧光显微镜观察GFP阳性的MSCs。结果:R t-GFP转染后,80%~90%MSCs可激发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。结论:R t-GFP可以使MSCs获得长效稳定标记。     

医院临床科研的哲学思考

为了探讨医院临床科研的哲学思维方法,本文从医学假说的运用、主要矛盾和矛盾的主要方面、"大项目"攻关与"小项目"的开发以及坚持实践第一等四个方面,进行临床科研的哲学思考,并运用哲学思维指导临床科研,达到了创新科研选题思维、明确主攻方向、理清研究思路的目的。可见辨证唯物主义的哲学思维,对临床科研的实施有较好的指导作用。