人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

TLR-2和TLR-4在不同疾病胸腔积液中的水平及临床意义

目的探讨不同疾病胸腔积液中Toll样受体2（TLR-2）及Toll样受体4（TLR4）的水平及其临床意义。方法收集81例胸腔积液及其同源外周血,其中结核性胸腔积液组32例,肿瘤性胸腔积液组28例,细菌性胸腔积液组21例。应用酶联免疫吸附（ELISA）法测定胸水上清液和血清中TLR-2和TLR-4的浓度,并对结果及意义进行分析。结果（1）胸腔积液间：结核组TLR-2浓度（22．19±2．12）ng／L分别与肿瘤性组（14．50±1．93）ng／L、细菌组（13．99±2．36）ng／L相比差异均有统计学意义（P〈0．05）;肿瘤性组、细菌组间相比差异均无统计学意义（P〉0．05）。而TLR4在三组间比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。（2）血清中：细菌组TLR-4浓度（5．34±2．13）ng／L,分别与结核组（1．54±1．09）ng/L、肿瘤性组（0．10±0．06）ng／L相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。（3）胸腔积液与血清中：TLR-2和TLR-4比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。（4）结核性胸腔积液中：TLR-2和TLR-4具有相关性（P〈0．05）。结论TLR-2可有助于结核性与非结核性胸腔积液的鉴别。TLR-2和TLR-4在结核性胸膜炎发病中可能具有共同作用。     

人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达

目的 构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpG DNA的能力.方法 PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性.结果 成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpG DNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpG DNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性.     

甘露聚糖肽对溃疡性结肠炎病人TLR-2和TLR-4表达影响

目的 了解甘露聚糖肽对溃疡性结肠炎(UC)病人Toll样受体2(TLR-2)、Toll样受体4(TLR-4)表达的影响。方法 UC病人200例,随机分为两组,各100例。对照组病人给予美沙拉嗪颗粒2g冲服每天2次,9g/L氯化钠注射液100mL静脉滴注每天1次;观察组给予美沙拉嗪颗粒2g冲服每天2次,甘露聚糖肽10mg溶于9g/L氯化钠注射液100mL静脉滴注每天1次,15d为1个疗程,共治疗2个疗程。分别于治疗前和治疗后,取病变最显著肠黏膜组织3块,应用免疫组化方法检测TLR-2和TLR-4表达。结果 治疗前,两组TLR-2、TLR-4表达比较,差异无显著性(P>0.05);治疗后观察组TLR-2、TLR-4表达阳性率低于对照组,差异有显著性(χ2=5.49、6,12,P<0.05)。结论 甘露聚糖肽能抑制UC病人TLR-2、TLR-4的表达。     

Toll样受体4在早产中的表达及意义

早产占分娩总数的5％～15％。尽管围生期保健在不断发展,但早产仍是导致围生儿发病及死亡的主要原因。目前对早产的病因尚未明确。近年来随着生殖免疫学的发展,Toll样受体尤其是Toll样受体4在早产中的研究越来越受到重视。本文将对此进行综述。     

2型大麻受体的克隆及真核表达体系的构建

目的 克隆人2型大麻受体(hCB2)基因,并构建相应的稳定表达细胞株.方法 利用人T淋巴细胞株HPB-ALL的总RNA,以RT-PCR及酶切、连接等分子生物学方法克隆hCB2基因于质粒载体pFlag-CMV-3内,以HEK293细胞构建稳定表达细胞株,以Western blot方法利用蛋白标记Flag的单克隆抗体(Anti-Flag)和CB2多克隆抗体(Anti-CB2)同时检测质粒的表达.结果 酶切及测序结果表明hCB2基因克隆成功,Western blot检测结果表明Anti-Flag和Anti-CB2都能检测Flag-hCB2蛋白.结论 成功克隆hCB2基因,并获得稳定表达细胞株,同时证实Anti-CB2多克隆抗体有效.     

结核病患者中性粒细胞表面Toll样受体2和Toll样受体4的表达及意义

目的:检测结核病患者外周血中性粒细胞(PMN)体外感染结核分枝杆菌(M.tb)前后表面Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)的表达,并探讨其意义。方法:采用流式细胞仪检测结核病患者PMN表面TLR2和TLR4的表达,同时检测正常人PMN表面TLR2和TLR4的表达率;再用M.tb感染结核病患者和正常人外周血,检测PMN表面TLR2和TLR4表达情况。结果:结核病患者外周血感染M.tb前PMN表面TLR2和TLR4表达率明显高于正常人(P0.01);结核病患者和正常人外周血在感染M.tb后PMN表面TLR2和TLR4表达率均较感染前明显降低(P0.01)。结论:结核病患者PMN表面TLR2和TLR4的表达和活化有助于机体抵御结核感染,TLR2和TLR4共同参与了宿主对M.tb的免疫应答。     

重症社区获得性肺炎患者外周血单核细胞Toll样受体4的表达及临床意义

目的探讨重症社区获得性肺炎（SCAP）患者外周血单核细胞Toll样受体4（TLR4）的表达情况及临床意义。方法选择入住呼吸科及ICU的SCAP患者50例为SCAP组,另择同期健康体检者50例作为对照（对照组）。分离两组外周静脉血单核细胞,提取单核细胞的mRNA,采用实时定量PCR检测TLR4mRNA表达量。采用ELISA法检测两组血清TNF-α和IL等相关炎症因子水平。在两组外周静脉血中加入脂多糖（LPS）后,再次测定TLR4mRNA表达量及相关炎症因子水平。分析SCAP患者TLR4mRNA表达量与肺炎严重程度（PSI）评分的相关性。结果SCAP组外周血单核细胞TLR4mRNA相对表达量及血清TNF-α、IL-6、IL-8、C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）水平均明显高于对照组（均P＜0.05）;加入LPS后,两组TLR4mRNA的表达量及血清TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平均较加入LPS前升高（均P＜0.05）,但SCAP组升高的幅度小于对照组。SCAP组TLR4mRNA表达量与PSI评分呈正相关（r=0.641,P＜0.05）。结论TLR4信号通路在SCAP发展中起重要作用,外周静脉血单核细胞TLR4受体过表达诱导NF-资B活化及其下游炎症因子释放,是SCAP造成机体损伤的主要病理机制。阻断TLR4受体可以抑制炎症因子的释放,减轻肺组织病理损害,可以为临床治疗SCAP提供新的靶点。     

TLR-2与TLR-4在胎膜早破患者胎盘组织中的表达及意义

目的探讨Toll样受体2(TLR-2)与TLR-4在胎膜早破患者胎盘组织中的表达及意义。方法选取2014年6月至2015年5月淮安市妇幼保健院产科分娩的100例足月胎膜早破患者列入足月胎膜早破组,100例早产胎膜早破患者(<37周)列入早产胎膜早破组,上述两组共同纳入胎膜早破组,100例足月正常分娩孕妇列入对照组。取受试患者分娩后的胎膜破口处组织为化验样本苏木精-伊红染色和免疫组织化学试验,观察绒毛膜羊膜炎发生率和胎膜组织TLR-2、TLR-4蛋白表达情况。结果胎膜早破组患者绒毛膜羊膜炎发生率显著高于对照组[48.0%(96/200)比8.0%(8/100),P<0.01],但足月胎膜早破组、早产胎膜早破组比较差异无统计学意义(P>0.05)。胎膜早破组患者TR-2与TLR-4表达数显著高于对照组[(11.01±2.13)阳性细胞数/mm2比(8.01±1.78)阳性细胞数/mm2,(12.29±3.22)阳性细胞数/mm2比(6.17±1.36)阳性细胞数/mm2](P<0.01),但足月胎膜早破组和早产胎膜早破组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TLR-2与TLR-4可通过免疫介导作用参与胎膜早破的发展过程,对两种因子的深入了解将有利于对胎膜早破的早期预防研究,两者有望成为胎膜早破免疫治疗的新靶位。     

前列腺特异膜抗原基因的克隆和真核表达

[目的]克隆前列腺特异膜抗原(PSMA)基因的编码区序列,并进行真核表达.[方法]用RT-PCR方法扩增前列腺癌组织标本中的PSMA cDNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0.用脂质体转染法,把pcDNA3.0-PSMA转染哺乳动物细胞,鉴定PSMA蛋白的表达.[结果]序列测定结果表明,两条引物之间的片段长度为2 279 bp,与预期长度一致.将克隆的编码区序列与GenBank的PSMA序列进行Blast对比分析,同源性为99.7%;间接免疫荧光法显示表达的蛋白质为膜蛋白,免疫印迹表明表达蛋白质的相对分子质量为100 ku.[结论]成功扩增了PSMA编码区序列,构建了PSMA真核表达载体,建立了PSMA稳定表达的细胞株.经免疫分析,证实了真核细胞内表达的PSMA为分子质量正确的膜蛋白,且具有良好的抗原性.所获得的PSMA真核表达系统为进一步研究PSMA基因修饰的DCs疫苗对前列腺癌的治疗提供了物质基础.     

先天性长QT综合征KCNQ1基因真核表达载体的构建及表达

目的　在原核表达载体pSP6 4 KCNQ1的基础上 ,构建KCNQ1的真核表达载体。方法　先将pSP6 4 KC NQ1通过限制性酶切得到KCNQ1cDNA ,将后者克隆入 pEGFP N1中 ,构建中间过渡载体 pEGFP KCNQ1;将pEGFP KCNQ1和 pIRES EGFP分别用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切 ,把KCNQ1cDNA克隆到 pIRES EGFP ,即构建了pIRES EGFP KCNQ1。然后利用Effectene转染试剂介导将pIRES EGFP KCNQ1转染HEK2 93细胞。 结果　在原核表达载体 pSP6 4 KCNQ1的基础上 ,获得了KCNQ1的真核表达载体 pIRES EGFP KCNQ1,并使其在HEK 2 93细胞中成功表达。结论　该法可成功构建、表达KCNQ1的真核表达载体 ,为进一步的功能研究奠定了基础。     

人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达

目的 构建STAT4基因的真核表达载体,在人胚肾细胞系HEK293中表达.方法 设计引物、采用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中获得STAT4的cDNA全长序列,在PCR产物两端加上SalI和BamHI限制性内切酶识别序列,将pEGFP-C1载体和PCR产物用SalI和BamHI进行双酶切,将STAT4 cD-NA定向克隆到pEGFP-C1中,从而构建了重组质粒pEGFP-STAT4;经酶切和测序鉴定正确后,将pEGFP-STAT4体外转染HEK293细胞,瞬时表达带有GFP标签的STAT4融合蛋白;采用荧光显微镜技术和免疫印迹技术检测融合蛋白的表达.结果 RT-PCR扩增了2 247 bp的STAT4 cDNA全长,经测序分析与GenBank中已知序列一致;重组质粒pEGFP-STAT4转染HEK293细胞中,可检测到瞬时表达的GFP-STAT4融合蛋白.结论 成功构建重组质粒pEGFP-STAT4,在真核细胞HEK293中能被表达.     

水通道蛋白4基因克隆及其载体的构建

目的:克隆大鼠水通道蛋白4(AQP4)基因并构建其载体为进一步研究提供理论基础和研究工具。方法:提取正常健康SD大鼠小脑皮质总RNA，采用随机引物法进行逆转录构建大鼠小脑cDNA文库，应用自行设计的AQP4特异性引物，进行AQP4特异性扩增。利用设计的酶切位点进行相应的内切酶酶切后插入pcDNA3．1Zeo( )质粒中。结果:引物扩增出长度为993bp的片段，为AQP4序列的全段，并正确插入到pcDNA3．1Zeo( )质粒中。上海生工生物工程技术公司片段测序结果与U14007报道的序列相同。结论:正确克隆了大鼠AQP4基因并成功构建了其载体，该基因及其载体可以作为进一步研究的工具。     

真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达术

目的构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1，并验证其在HEK293T细胞中的表达。方法从人的全血标本中提取DNA模板，经PCR获得Hath1-cDNA，将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoI、EcoRI双酶切，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化，前者回收1065bp片断，后者回收大片断，再将回收的2个片断用T4DNA连接酶连接，转化感受态DH5q细胞，挑选单克隆，提取质粒，将所提取的质粒双酶切鉴定并测序。再将构建成功的pIRES2-DsRed2-Hath1质粒通过脂质体Lipofectarnine^TM2000转染HEK293T细胞，观测其转染情况和目的基因的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1，该质粒能有效地转染HEK293T细胞，目的基因能有效表达。结论pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠的耳蜗的实验奠定了基础。     

蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表达及活性鉴定

【目的】获取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2（PTP4A2）基因并高效表达纯化,对于产物的体外活性进行测定。【方法】用RT-PCR技术,从肝癌细胞系HepG2的总RNA中,获得编码PTP4A2基因功能片段的DNA。测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达载体,并导入大肠杆菌E.coliBL21中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白。对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化,western印记进行鉴定,质谱检测蛋白分子量。通过其对底物磷酸多肽的去磷酸化反应,鉴定其活性。【结果】获得编码肝癌细胞PTP4A2（全长氨基酸）的基因序列,测序结果与已发表的基因序列相一致。重组GST融合蛋白经western分析,在相对分子质量Mr=45000处,有特异的蛋白条带。重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,质谱检测其分子量为45470.6。底物多肽去磷酸化反应表明纯化产物具有较强活性。【结论】成功克隆人PTP4A2基因,并在E.coliBL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白,质谱检测分子量与预期结果一致,纯化产物具有蛋白磷酸酯酶活性。     

蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表达及活性鉴定

 【目的】获取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2（PTP4A2）基因并高效表达纯化,对于产物的体外活性进行测定。【方法】用RT-PCR技术,从肝癌细胞系HepG2的总RNA中,获得编码PTP4A2基因功能片段的DNA。测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达载体,并导入大肠杆菌E.coliBL21中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白。对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化,western印记进行鉴定,质谱检测蛋白分子量。通过其对底物磷酸多肽的去磷酸化反应,鉴定其活性。【结果】获得编码肝癌细胞PTP4A2（全长氨基酸）的基因序列,测序结果与已发表的基因序列相一致。重组GST融合蛋白经western分析,在相对分子质量Mr=45000处,有特异的蛋白条带。重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,质谱检测其分子量为45470.6。底物多肽去磷酸化反应表明纯化产物具有较强活性。【结论】成功克隆人PTP4A2基因,并在E.coliBL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白,质谱检测分子量与预期结果一致,纯化产物具有蛋白磷酸酯酶活性。     

钠通道SCN1A基因短发夹RNA表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的沉默效果

目的采用人SCN1A基因非保守区DNA构建短发夹RNA（shRNA）稳定表达的重组质粒,在HEK293细胞中抑制SCN1A基因表达。方法PCR分别正反向扩增SCN1A基因特异序列,构建成一个绿色光蛋白（GFP）与发夹结构RNA（shRNA）融合表达的重组质粒pEGFP-SCN1A-shRNA;该质粒和对照质粒（pCMV-EGFP）分别与SCN1A基因表达质粒（pCMV-SCN1A）共转染HEK293细胞株,采用半定量RT-PCR及双荧光共定位法鉴定SCN1A基因的表达情况。结果与对照相比较,shRNA表达质粒转染的培养细胞中SCN1A基因mR-NA表达量下调90%;双荧光共定位显示实验组阳性细胞中只检测到GFP蛋白,未能检测到Nav1.1,而对照组阳性细胞中能同时检测到GFP蛋白和Nav1.1。结论shRNA表达质粒在培养细胞中能有效地抑制SCN1A基因的表达。该质粒可进一步改造成腺病毒表达载体,在动物脑组织中进行永久性表达,建立癫痫等神经系统疾病的动物模型,可望成为致病机理研究和开发新治疗途径的工具。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.     

重组人Grn的克隆与表达

目的 :构建人Grn基因原核表达载体并观察其表达。方法 :从人单核细胞系THP-1细胞c DNA中扩增出Grn片段,通过酶切与连接,将Grn片段构建到p GEX-4T-2质粒载体上,再转化入感受态细胞TOP10,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析,测序正确的重组质粒再转化入感受态细胞DE3中表达蛋白,用Western blot鉴定结果。结果 :构建的p GEX-4T-2表达载体作PCR和双酶切鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与Grn序列设计完全一致,将其转化入DE3中,Western blot结果表明在细菌裂解上清有分子质量为91KD的融合蛋白。结论 :重组人Grn的克隆与表达成功,为进一步研究Grn的功能奠定了基础。     

人IL-4cDNA的克隆和在COS细胞的表达

将PHA活化的人外周血白细胞cDNA文库同人工合成的人IL-4探针杂交,解离了一段cDNA序列,将它插入πH3M质粒并导入COS猿猴细胞。经FACS测定证实细胞的培养上清中具有人IL-4的生物学活性。