非病毒载体介导pBMP-2转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化研究

目的 :探讨非病毒载体Gen Escort TM II介导质粒骨形态发生蛋白2(p BMP-2)转染对MC3T3-E1细胞增殖和体外成骨分化的影响。方法:以非病毒载体Gen Escort TM II介导报告基因质粒增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)转染MC3T3-E1细胞,优化转染条件,荧光显微镜和流式细胞仪评价转染效率。p BMP-2转染MC3T3-E1细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,染色法检测碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)的表达,Real-time PCR分析成骨细胞标志基因ALP、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果 :Gen Escort TM II介导p EGFP转染MC3T3-E1细胞后,转染效率达35.02±4.42,MTT结果示基因转染对细胞增殖无影响(P>0.05)。p BMP-2转染组的ALP、ARS表达较p EGFP转染组和未转染组显著,同时Real-time PCR检测结果示,转染后6 d,p EGFP转染组和未转染组相比,p BMP-2转染组的成骨基因ALP、BSP、Runx2、OCN、OPN的表达量差异有显著性意义(P<0.05)。结论:非病毒载体Gen Escort TM II介导BMP-2转染MC3T3-E1细胞可诱导其向成骨方向分化。     

Smad7反义寡核苷酸对TGF-β1调控人牙髓细胞生长和分化的影响

目的 :观察Smad7反义寡核苷酸对转化生长因子 β1(transforminggrowthfactor -β ,TGF -β1)调控人牙髓细胞生长和分化的影响。方法 :细胞培养 ,细胞转染 ,MTT比色测定法和碱性磷酸酶活性测定法。结果 :Smad7反义寡核苷酸促进TGF -β1对人牙髓细胞增殖的诱导作用和对碱性磷酸酶活性的抑制作用。 结论 :Smad7参与介导TGF -β1对人牙髓细胞增殖和ALP活性的调控 ,提示TGF -β1调控人牙髓细胞生长和分化可能是通过Smad信号途径发生的     

FGF2基因转染对人牙周膜细胞生物学性状的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor 2,FGF2)基因转染对人牙周膜细胞(Periodontalligament cells,PDLCs)生物学性状的影响.方法:将FGF2基因转入PDLCs,通过免疫组化SABC及免疫印记法检测其稳定表达,并检测转基因细胞增殖活力及碱性磷酸酶合成情况.结果:免疫细胞化学证实转染与未转染细胞均在胞浆内表达FGF2,但转染FGF2细胞较未转染组染色深,免疫印迹杂交结果显示转染前后均表达17KD FGF2,但转染后表达量增高.FGF2基因转染可增强细胞增殖能力,但碱性磷酸酶活性未见明显变化(P＞0.05).结论:FGF2基因能被转入PDLCs并得到稳定表达,转基因细胞增殖与合成明显增强,但转染FGF2基因不能促进细胞分化.     

HOXC6同型蛋白2对根尖牙乳头干细胞成骨/成牙分化功能的影响

目的 探讨同源盒基因C6同型蛋白2对牙源性间充质细胞成骨/成牙分化的影响.方法 成骨诱导培养基诱导人根尖牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化;逆转录病毒转染构建过表达HOXC6-ISO2稳定转染牙乳头干细胞进行HOXC6-ISO2获得性功能研究;碱性磷酸酶活性实验检测成骨/成牙早期分化指标-碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR检测成骨/成牙分化相关基因-Sp7转录因子、Runt相关转录因子2和骨钙素及同源盒基因C6下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结果 结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞的碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR显示过表达同源盒基因C6同型蛋白明显抑制骨钙素的表达,并且抑制下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结论 同源盒基因C6同型蛋白2通过抑制下游基因胰岛素结合蛋白5抑制牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化的功能.     

TiO2纳米管负载BMP-2指节肽对骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响

目的 检测负载骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)指节肽的二氧化钛(TiO2)纳米管复合结构对骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响.方法 通过阳极氧化法在钛片表面制备TiO2纳米管阵列.全骨髓差速贴壁法分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞.实验组负载BMP-2指节肽TiO2纳米管;对照组只采用TiO2纳米管.2组纳米管钛片接种间充质干细胞培养,测定细胞增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)RNA表达,并进行统计学分析.结果 2组细胞培养1、3、5天,细胞增殖实验组>对照组(P<0.05);2组细胞培养7、10、15天,碱性磷酸酶活性实验组>对照组(P<0.01);2组细胞培养21天后,骨钙素和骨桥蛋白的差异倍数(fold change)显示为实验组>对照组.结论 TiO2纳米管负载BMP-2指节肽对骨髓间充质干细胞增殖和早期成骨分化的促进作用强于单纯TiO2纳米管结构.     

血管内皮细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞生物学效应的研究

目的:体外研究腺病毒AdCMV转染VEGF基因对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及功能分化的影响.方法:体外培养扩增大鼠BMSCs,AdCMV-EGFP转染BMSCs,确定重组腺病毒的最适MOI,应用MTT法检测转染AdCMV-VEGF对大鼠BMSCs增殖的影响.采用RT-PCR方法检测转染后细胞VEGF的表达,通过检测成骨条件培养液诱导培养后细胞的碱性磷酸酶活性评价BMSCs向成骨细胞分化的能力.结果:AdCMV-EGFP在400particle/cell时转染效率最高,且对细胞无毒副作用,未转染细胞、AdCMV-EGFP转染细胞与AdCMV-VEGF转染细胞光吸收(A)值在转染后第3天存在明显差异(P<0.05).RT-PCR检测AdCMV-VEGF转染细胞有VEGF基因的表达,未转染AdCMV-VEGF细胞组未见VEGF基因mRNA的表达.通过成骨诱导后AdCMV-VEGF转染细胞碱性磷酸酶活性明显高于未转染AdCMV-VEGF细胞(P＜0.05).结论:在体外AdCMV-VEGF能够成功转染大鼠BMSCs,能够促进BMSCs的增殖和向成骨细胞的分化.     

壳聚糖纳米粒介导BMP-2基因转染骨髓基质干细胞的基因表达

目的旨在对壳聚糖纳米粒介导BMP-2基因转染骨髓基质干细胞向成骨样细胞分化的基因表达作一研究。方法根据不同浓度的壳聚糖纳米粒介导的BMP-2(pBMP-2),试验组分为CPB50组(50μg/mL pBMP-2),CPB100组(100μg/mL pBMP-2)和CPB200组(200μg/mL pBMP-2)。骨髓基质干细胞在壳聚糖纳米粒介导的BMP-2基因转染分化后,检测和分析成骨样细胞的特征性分子(碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、护骨素(Osteoprotegerin,OPG)、骨钙素(Osteocalcin,OC)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN))的表达水平。结果基因转染后细胞中的ALP、OPG、OC和OPN基因呈现高表达,尤其是CPB200组最高。结论壳聚糖纳米粒介导BMP-2基因转染骨髓基质干细胞后能促进细胞中成骨样细胞特征性分子的高表达。     

组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响.方法 成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化.逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究.碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性.茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力.实时定量RT-PCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达.结果 成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达.过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达.结论 组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.     

组蛋白去甲基化酶KDM6A促进骨髓间充质干细胞成骨分化研究

目的研究组蛋白去甲基化酶KDM6A对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法构建Flag-KDM6A慢病毒表达质粒。利用慢病毒转染构建稳定过表达KDM6A的骨髓间充质干细胞。碱性磷酸酶活性实验检测成骨分化早期指标-碱性磷酸酶活性。茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力。实时：毫量RT-PCR检测成骨分化相关基因．骨桥蛋白和骨钙素的表达。结果过表达KDM6A促进骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性、骨髓间充质干细胞体外矿化能力以及骨桥蛋白和骨钙素的表达。结论组蛋白去甲基化酶KDM6A具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的潜能,可以作为一个候选的靶基因用于骨组织工程技术,促进骨组织再生。．     

人牙本质涎蛋白对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

目的 :观察人牙本质涎蛋白对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。方法 :分对照组和实验组 ,对照组是转染不含目的基因的空白质粒 pcDNA3的培养上清 ,实验组是转染pcDNA3 -hDSP重组质粒的培养上清。取第 5代人牙乳头间充质细胞 ,接种于 96孔板 ,对照组 6孔 ,实验组 10孔 ,用MTT法检测hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖的影响 ,用碱性磷酸酶检测试剂盒检测hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞碱性磷酸酶活性的影响。结果 :hDSP能明显抑制体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖 (P <0 .0 1) ,但能促进细胞内和培养上清中碱性磷酸酶的分泌 (P <0 .0 1)。结论 :hDSP能促进人牙乳头间充质细胞的分化和矿化     

持续性静压力对成骨样细胞MC3T3-E1生物学特性的影响

目的 :研究持续性静压力对成骨样细胞MC3T3 -E1生物学特性的影响。方法 :利用已建立的细胞体外加力装置 ,给MC3T3 -E1细胞施加 2atm的持续性静压力 ,应用细胞计数 ,生化分析和放射免疫等方法 ,观察受力后不同时间细胞增殖、碱性磷酸酶活性以及骨钙素表达量等方面的变化。结果 :加力组细胞增殖速度减缓 ,实验组和对照组的细胞群体倍增时间分别为 72 .96h和 63 .3 6h ;随着培养时间的延长 ,细胞碱性磷酸酶活性增强 ,但加力组和对照组无明显差异 (P >0 .0 5 ) ;持续性静压力作用 2 4h后 ,与对照组相比 ,加力组骨钙素分泌的增加有显著差异 (P <0 .0 5 )。结论 :一定大小的持续性静压力在抑制MC3T3 -E1细胞生长的同时促进其分化成熟。     

脑源性神经营养因子在人牙髓干细胞中的表达及其对细胞增殖分化的影响

目的:检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurtrophie factor,BDNF)在人牙髓干细胞中的表达,初步观察其对细胞增殖和分化的影响.方法:采用酶消化法分离培养人牙髓干细胞;RT-PCR检测细胞中BDNF mRNA表达;MTT和碱性磷酸酶活性检测观察其对细胞增殖分化的影响.结果:RT-PCR反应扩增出BDNF mRNA阳性产物;与对照组相比,25 ng/mL BDNF可显著促进牙髓干细胞的增殖(P<0.05);100 ng/mL时可显著提高碱性磷酸酶活性(P<0.05).结论:BDNF可表达于人牙髓于细胞,对细胞增殖分化有一定促进作用.     

骨形态发生蛋白6对张应力下大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白-6(BMP-6)对张应力作用下大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成骨向分化的影响。方法:应用四点弯曲加力系统对体外分离培养大鼠BMMSCs施加不同大小的周期单一张应力60 min,2 h后检测检测内源性BMP-6的表达量,同时检测碱性磷酸酶、骨钙素表达量和进行成骨细胞转录因子-2mRNA定量分析。然后对体外分离培养转染人BMP-6复制缺陷型病毒的大鼠BMMSCs施加4000μstrain的周期单一张应力60 min,2 h后检测成骨标志表达。结果:随着张应力的增大,BMP-6的表达逐渐增强,同时成骨能力亦增强,但2000 μstrain以后BMP-6的表达与成骨能力均下降。4000 μstrain条件下2 h后转染人BMP-6基因的大鼠BMMSCs各项成骨标志因子的检测明显强于转染空白病毒。结论:适当的张应力可促进BMP-6表达上调和BMMSCs骨向分化,上调BMP-6的表达可以恢复过大张应力所致的成骨能力下降。     

hBMP2基因转染对人牙龈成纤维细胞生物学特性的影响

目的分析hBMP2基因转染人牙龈成纤维细胞的生物学特性.方法用脂质体转染法将hBMP2基因转入人牙龈成纤维细胞内,经G418筛选后,获得阳性克隆.以原位杂交和免疫组化对转染细胞进行鉴定;进一步观察细胞形态、生长特性、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成以及体外形成矿化结节的能力.结果hBMP2基因转染后,人牙龈成纤维细胞有hBMP2 mRNA的转录和蛋白表达;部分细胞由原来的长梭形转化为多角形,碱性磷酸酶活性和骨钙素合成均明显高于对照组(两组均P＜0.01);在矿化液作用下,能形成体外矿化结节.但细胞的增殖特性无明显变化.结论外源性hBMP2基因能够在人牙龈成纤维细胞表达,并促进其向成骨细胞方向转化,而对细胞的生长特性无明显影响.     

BMP受体在大鼠骨髓间充质细胞成骨中的作用

目的:研究骨形成蛋白受体(BMP-R)在大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)成骨中的作用机制。方法:分离大鼠BMSCs,将原代细胞分为4组,分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)、骨形成蛋白-2(BMP-2)和OM+BMP-2诱导培养基培养。应用碱性磷酸酶(ALPase)活性和钙结节染色(Von Kossa法)检测成骨分化程度,RT-PCR检测骨形成蛋白受体(BMP-R)的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果:OM可诱导BMSCs成骨分化,表现出高碱性磷酸酶活性和基质矿化能力。BMP-2可提高OM诱导BMSCs成骨分化的能力;OM在早期即可诱导BMP-RⅠA和BMP-RⅡ的表达,而BMP-2诱导BMP-R较迟。结论:BMP-2可提高OM诱导BM-SCs分化成骨的能力,BMP-R在BMSCs分化成骨中起重要作用。     

壳聚糖修饰的羟基磷灰石纳米粒载体介导BMP-2转染成骨细胞的研究

目的:研究壳聚糖(chitosan,CS)修饰的羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)纳米粒载体携带骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein2,BMP2)基因转染成骨细胞,及转染后对细胞增殖与分化的影响。方法:采用MTT法检测HA-CS纳米粒载体对成骨细胞的毒性反应;用HA-CS纳米粒载体转染技术,将BMP-2目的基因导入成骨细胞,评估转染效率;检测细胞增殖情况及碱性磷酸酶(alkaline phoaphatase,ALP)活性。结果:MTT结果提示HA-CS纳米粒混悬液浓度在500mg/L以下对成骨细胞无毒性作用;其转染效率优于没经修饰的HA;转染后促进成骨细胞增殖并增加了ALP活性。结论:HA-CS纳米粒在一定浓度下对成骨细胞无毒性作用,作为输送载体可以安全地将目的基因BMP-2导入成骨细胞,并促进了成骨细胞的增殖与分化。     

TGF β1和bFGF对鼠口腔黏膜固有层前体细胞的影响

目的探讨转化生长因子B1（TGF-β1）和碱性成纤维细胞因子（bFGF）对大鼠口腔黏膜固有层前体细胞（OMLPPC）的增殖及碱性磷酸酶活性的影响。方法体外扩增培养OMLPPC,利用5ng／mLTGF-β1、10ng／mlbFGF单独及联合作用于OMLPPC,利用MTT方法检测OMLPPC的增殖,利用试剂盒检测其碱性磷酸酶活性,以RT．PCR方法检测各组矿化基因骨钙素（OCN）的表达。结果对细胞的增殖,3d时各组间未见显著性差异;7、14d,bFGF单独作用明显促进细胞的增殖（P〈0．05）,TGF-β1单独作用抑制细胞的增殖（P〈0．05）。TGF-β1＋bFGF组7d时增殖不受影响,14d时增殖变缓。碱性磷酸酶活性检测,对照组及bFGF组各时间点增加均无显著性差异。TGF．131组间7、14d比3d时ALP活性有显著性差异（P〈0．05）。TGF-131＋bFGF组14d时ALP活性显著增强（P〈0．05）。RT—PCR检测OCN结果显示,各组培养14d后,TGF-131组、TGF-β1＋bFGF组表达OCN,对照组、bFGF组未见表达。结论一定浓度的bFGF和TGF-131联合作用,不仅可保证OMLPPCs的增殖,而且能诱导并促进其向矿化方向的分化。