辛德毕斯病毒荧光PCR检测方法的建立

目的建立辛德毕斯病毒核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法。方法根据辛德毕斯病毒基因组核苷酸序列特性设计引物。病毒在BHK21细胞上繁殖扩增后提取RNA和逆转录。以病毒cDNA为模板分别进行SYBRGREENΙ荧光PCR和常规RTPCR扩增,并对SYBRGREENΙPCR法的灵敏性、特异性、重复性等进行分析。结果最适退火温度为55℃,最适引物浓度为0.5μmol/L。用该方法检测2株SIN病毒株YN87448和XJ160结果均为阳性,而对其他虫媒病毒如甲病毒属Geta病毒、乙脑病毒、Batai病毒、Banna病毒、环状病毒及西方马脑炎病毒合成模板检测时结果均为阴性。根据病毒空斑形成实验结果,将YN87448病毒悬液进行连续10倍稀释后分别用常规PCR和SYBRGREENΙ荧光PCR方法进行检测。结果SYBRGREENΙ荧光PCR检测敏感性比常规PCR方法要高近100倍,检出下限可达0.1PFU/ml。对模拟感染的人血清标本检测结果表明人血清中成分对检测体系无明显影响。对151份不明原因发热和病毒性脑炎患者的血清或脑脊液标本进行检测,结果检测到6份标本阳性。结论本实验建立了辛德毕斯病毒特异性核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法,实验结果显示了较好的特异性、广谱性,初步证实可应用于临床标本的检测,为将来用于临床和调查辛德毕斯病毒在我国的流行情况提供了新的技术手段。     

扎伊尔型埃博拉病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的 建立扎伊尔型埃博拉病毒的核酸检测方法,以期用于埃博拉出血热临床标本的检测.方法 针对扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白和糖蛋白基因设计引物和探针,建立单重和双重实时荧光RT-PCR检测方法,利用体外转录病毒RNA和埃博拉病毒系列参考品RNA评价其敏感性,利用马尔堡病毒、健康人、登革热患者和发热伴血小板减少综合征患者血清评价其特异性.结果 所建立的实时荧光RT-PCR检测方法扩增效率在95％～105％,可特异性地检测扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白和糖蛋白基因,与马尔堡病毒、登革热和发热伴血小板减少综合征病毒均无交叉反应,体外转录的病毒RNA可检出10～100拷贝/μl.双重检测方法通过细胞培养的扎伊尔型埃博拉病毒RNA验证,可检出100 pfu/ml病毒.结论 本研究建立的检测扎伊尔型埃博拉病毒的实时荧光RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于埃博拉出血热临床标本的检测.     

狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立和阳性对照的制备

目的 建立狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法,制备狂犬病病毒(rabies virus,RV)的假病毒颗粒阳性对照.方法 在RV的N基因保守区设计引物和探针,建立反转录实时荧光定量PCR检测方法,克隆得到噬菌体MS2的装配蛋白和壳蛋白基因(MS2),将其重组到质粒pET-28b(+)中,再将RV的N基因片段重组到MS2下游,经原核表达得到RV假病毒颗粒.结果 实时荧光定量PCR检测RV重组质粒最低检测限为15拷贝/μl,重组表达质粒经原核表达可形成耐RNase的RV病毒样颗粒.结论 建立了反转录实时荧光定量PCR检测RV核酸的方法,成功构建了可耐受RNase且无传染性的RV阳性对照.     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的在传统产物增强性反转录酶（PERT）活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶（1×10-1～1×10-9U/μl）标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性。同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度。结果将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl。结论成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标。     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的 在传统产物增强性反转录酶(PERT)活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法.方法 以噬菌体MS2 RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶(1×10-1～1×10-9 U/μl)标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA.采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性.同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度.结果 将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值.不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7 U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112 bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl.结论 成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标.     

双色荧光定量PCR快速分型、定量高危型人乳头状瘤病毒

目的针对高危型人乳头状瘤病毒（humanpapillomavims，HPV）亚型的多样性以及感染病毒载量的高低，旨在建立高危型HPV的定量与分型的快速检测方法，为HPV筛查与治疗提供依据。方法利用2种荧光染料分别标记HPV-16、HPV-33／52／58／67和HPV-18／45、HPV-31探针，同时以B球蛋白基因作为内对照，对120份疑为HPV感染的宫颈脱落细胞样本进行I{I＇V分型与定量，定量范围为5×10^1-5×10^7拷贝/ml，以HC-2杂交捕获法作为“金标准”，评价该方法的特异性与灵敏度。结果荧光定量PCR阳性检出率为52．5％（631120），其中HPV-16、HPV-18／45、HPV-31和m．V-33，52，58，67阳性率分别为36．51％（23／63）、11．11％（7／63）、12．70％（8／63）、58．73％（37／63）；HPV感染的平均病毒载量为1．08×10^7拷贝/ml。荧光定量PCR的特异性为100％，灵敏度为81．82％。结论双色荧光定量PCR能快速分型、定量高危型HPV，可用于HPV感染的筛查与宫颈病变程度预测以及疗效观察。     

建立人微小病毒B19的PCR检测方法

人微小病毒Ｂ１９是微小病毒科中唯一能感染人的病毒。能够提供Ｂ１９抗原的病毒体外培养系统尚未建成，因此限制了血清学实验的开发和普及。为此作者建立起Ｂ１９病毒的ＰＣＲ检测方法。设计引物在表达外壳蛋白ＶＰ１基因区，扩增长度为４００ｂｐ。     

鼠艾滋病病毒荧光定量PCR标准品RNA的构建

目的合成构建鼠艾滋病病毒（FLV）荧光定量检测标准品,明确核糖核酸（RNA）标准品体外合成的基本原则。方法通过序列对比,找到FLV最为保守的区段作为RNA标准品的合成目标,进行逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增,克隆于T载体,测序,设计带有T7启动子的引物,PCR扩增,将所得的PCR产物凝胶回收纯化,用T7RNA聚合酶进行体外合成RNA,最后用PCR和电泳检测验证。结果成功合成了FLV荧光定量PCR标准品。结论FLV荧光定量标准品的成功合成必须遵守以下4条基本原则：①选择保守序列;②设计引物时将潜在的终止密码或起始密码排除在PCR目标产物之外;③将启动子（如T7启动子）挂在适当的引物上,保证所合成的RNA模板与所要定量检测的RNA模板一致,而不是互补;④合成RNA后必须检测,以保证不含其他RNA或者未消化完的DNA。     

荧光定量PCR检测活检组织EB病毒感染的临床意义

目的　建立检测EBV感染的新方法并观察EBV与鼻咽癌的关系。方法　鼻咽部活检组织和石蜡包埋标本6 6例 ,采用荧光定量聚合酶链反应 (FQ -PCR)和原位杂交 (ISH)两种方法检测EBV ,其检测结果与病理诊断对照。结果 :FQ-PCR检测EBV -DNA阴性 5 2例 ,其中 5 1例为炎性病变 ,另 1例为腺癌 ;EBV -DNA阳性 14例 ,其中 13例为鳞状细胞癌 ,另 1例虽为炎症。但部分上皮细胞呈不典型增生。ISH检测EBV阳性 4 9例 ,其中 4 7例为炎性病变 2例为癌。EBV阳性 17例 ,其中 12例为癌 ,5例为炎性病变。FQ -PCR和ISH检测EBV结果 ,经卡方检测差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　EBV感染与鼻咽癌有高度相关性。FQ -PCR检测EBV具有方法简单、快速、定量准确等优点。     

人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立

建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人线粒体DNA的方法。选取人线粒体DNA高度保守基因片段,将该基因片段与pCF-T载体连接后,转化入E.coli DH5α,提取重组质粒PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果表明:构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含101~108拷贝时,扩增反应CT值与拷贝数的对数成线性关系),相关系数为0.997。批内和批间重复性测定的变异系数分别为1.23%~3.29%以及3.10%~5.21%。我们成功建立了实时荧光定量PCR检测人线粒体DNA的方法,该方法可作为进一步研究线粒体DNA的方法,在相关疾病诊断和监测中具有一定的应用前景。     

A hemi-nested PCR assay for the detection and identification of vesicular stomatitis virus nucleic acid

This paper is the first to describe the development of a hemi-nested PCR assay for the detection of vesicular stomatitis virus (VSV) nucleic acid. This assay was developed as it combines high sensitivity for virus genome detection with the identification of the external amplification product in the reamplification step, thus confirming the specificity of the reaction. The assay did not depend on the presence of infectious virus in samples, as demonstrated by its detection of VSV in blood samples which were non-infectious in tissue culture. One further advantage was that the VSV-New Jersey and VSV-Indiana serotypes could be differentiated through the selective use of the appropriate hemi-nested primer. This assay is ideal for the study of VSV pathogenesis and persistence.     

荧光RT—PCR法及两种培养法检测流感病毒的比较分析

目的通过2009年下半年深圳市流感监测数据,对荧光RT—PCR,细胞培养法和鸡胚培养法进行分析比较。方法对2009年下半年的1092份咽试子样本采用荧光RT-PCR,细胞培养法和鸡胚培养法三种方法进行检测,对检测结果用统计学方法进行分析。结果荧光RT—PCR,细胞培养法和鸡胚培养法的阳性率分别为54．21％、27．11％和16．21％,灵敏度分别为100％,50％和29．9％。荧光RT—PCR的检出限为10^-2 TCID 50／ml。结论荧光RT-PCR的灵敏度要明显高于培养法,而且同样具有非常高的特异度,其在流感的应急检测应用中要明显优于两种培养法。细胞培养法对H3N2亚型的敏感性高,而鸡胚培养法对B型流感的敏感性高。     

Re-examination of feline leukemia virus: host relationships using real-time PCR

The mechanisms responsible for effective vs. ineffective viral containment are central to immunoprevention and therapies of retroviral infections. Feline leukemia virus (FeLV) infection is unique as a naturally occurring, diametric example of effective vs. ineffective retroviral containment by the host. We developed a sensitive quantitative real-time DNA PCR assay specific for exogenous FeLV to further explore the FeLV-host relationship. By assaying p27 capsid antigen in blood and FeLV DNA in blood and tissues of successfully vaccinated, unsuccessfully vaccinated, and unvaccinated pathogen-free cats, we defined four statistically separable classes of FeLV infection, provisionally designated as abortive, regressive, latent, and progressive. These host-virus relationships were established by 8 weeks post-challenge and could be maintained for years. Real-time PCR methods offer promise in gaining deeper insight into the mechanisms of FeLV infection and immunity.     

B型流感病毒Yamagata系和Victoria系双重荧光PCR诊断方法的建立与应用

目的 建立一种新型的双重荧光PCR诊断方法,用于B型流感病毒By (B/Yamagata)和Bv(B/Victoria)亚系的准确分子分型.方法 从GenBank随机下载By和By HA(hemagglutinin)基因各50条序列,通过MEGA分析,利用Primer Primer软件设计亚系特异性引物和通用探针,建立双重荧光PCR诊断方法.用HAI(hemagglutination inhibition)实验确认的B型流感病毒亚系分离毒株和A型流感病毒进行特异性验证,用体外转录核酸拷贝数进行灵敏度实验.结果 2006-2010流感监测年份,对17 765份流感样病例咽拭标本中分离到B型流感病毒793株,本方法鉴定有152株By和641株Bv病毒,与HAI鉴定结果一致.本诊断方法的检测特异性达100％,灵敏度达102拷贝/μl,重复性变异系数＜3.5％.结论 本研究所建立的荧光PCR方法为流感实时监测提供了有力的技术支撑,适合于流感监测实验室对流感病毒的快速分子诊断.     

流感病毒型别及亚型的多重RT-PCR方法快速检测

目的为适应流感疫情监测中快速诊断的需要,建立敏感特异的流感病毒多重逆转录PCR(MRTPCR)检测方法。方法对甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)、乙型流感病毒的血凝素(HA)基因保守区域分别设计引物进行MRTPCR。另设计了两对引物对H1N1和H3N2亚型流感病毒的神经氨酸酶(NA)N1、N2作亚型判断。结果MRTPCR可特异性检测出各型流感病毒的目的片段,相互间无交叉反应。二次PCR反应后对H1N1、H3N2流感病毒的检测灵敏度可达0.10TCID50/50μl以下,对乙型流感病毒的检测灵敏度可达0.01TCID50/50μl以下。应用此方法也可特异性地检测出H1N1和H3N2流感病毒的NA基因。结论用MRTPCR从临床患者含漱液标本中检出相关流感病毒的灵敏度要高于用狗肾传代细胞(MDCK)或鸡胚分离的灵敏度,达到了快速、敏感、正确检测流感病毒及其亚型的目的。     

人类疱疹病毒6型荧光定量PCR检测方法的建立和应用

目的 建立人类疱疹病毒6型(HHV-6)荧光定量PCR检测方法,并检测临床样本.方法 根据文献合成HHV-6 U65-66基因片段的特异性引物和TaqMan探针,构建质粒制备标准品,评估该方法的特异性、灵敏度和重复性;并用该方法检测93份临床诊断为病毒性脑炎的脑脊液标本.结果 本实验检测HHV-6的灵敏度为3×10(0)拷贝/μl;标准曲线间线性关系(R2)为0.999,扩增效率为97.9％;同一样本重复检测3次,组内Ct值的变异系数最大为0.61％,组间为3.13％;特异性检测中只有HHV-6阳性标本出现扩增曲线.93份临床标本中检出HHV-6阳性2例,检出率为2.15％.结论 本实验所建立的荧光定量PCR检测HHV-6的方法特异强、灵敏高、重复性好,具有应用于临床检测的潜在价值.     

双重荧光定量RT—PCR在快速检测A、B型流感病毒上的应用

目的 建立双重荧光定量RT-PCR技术同时快速检测A、B型流感病毒,并应用于临床样本的检测.方法 在A型流感病毒M基因和B型流感病毒HA基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化双重荧光RT-PCR反应体系,评价所建双重RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于疑似流感含漱液标本检测.结果 该方法对A、B型流感病毒检测具有高度特异性,检出限分别为0.1TCID50和0.01TCID50,具有较好的稳定性.可从疑似流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸.结论 本研究建立的双重荧光定量RT-PCR可以同时准确分型A、B型流感病毒,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测流感病毒的新方法.     

应用单一和双重荧光定量PCR法快速检测军团菌

目的 建立单一和双重荧光定量PCR方法分别和同时进行军团菌属及嗜肺军团菌的检测.方法 利用军团菌属16 S rRNA基因和嗜肺军团菌mip基因设计引物和探针,两条基因探针分别标记FAM和HEX,并将相关反应体系和条件进行优化.分别应用单一基因探针(单一荧光定量PCR)和双重基因探针(双重荧光定量PCR)对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及非军团菌进行检测,并验证两种方法的特异度、敏感度.应用双重荧光定量PCR检测空调水样滤膜样品和DNA提取样品,比较两者结果的一致性.结果 针对军团菌属及嗜肺军团菌,应用荧光定量PCR,16 S rRNA基因和mip基因均能较好的检出,16S rRNA和mip的最低检出限分别为8和10个拷贝.经优化得到了最佳反应体系.单一荧光定量PCR方法所检的8株嗜肺军用菌及4株非嗜肺军团菌16 S rRNA基因均为阳性,嗜肺军团菌mip基因阳性,非嗜肺军团菌mip基因阴性.双重荧光定量PCR方法所检的23株嗜肺军团菌中有2株为假阴性,9株非嗜肺军团菌和非军团菌属中有1株为假阳性.49份空调水样滤膜直接检测和提取DNA后检测的结果一致,其中26份水样军团菌阳性,20份为嗜肺军团菌,6份为非嗜肺军团菌;1份弗朗西斯菌检测HEX阳性(假阳性),占实际培养分离的1/26.结论 单一及双重荧光定量PCR法特异、快速、敏感,一次同时检测嗜肺与非嗜肺军团菌,满足对空调和环境水样军团菌监测的要求.