rhBMP-2、bFGF双基因共转染兔骨髓间充质干细胞复合nHA/RHLC/PLA支架及其体内外成骨分化研究

[目的]探讨rhBMP-2、bFGF双基因共转染兔骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)复合nHA/RHLC/PLA支架及其体内异位成骨研究.[方法]构建携带rhBMP-2及bFGF基因片段的双基因表达载体prhBMP-2-IRES-bFGF并转染兔BMSCs,免疫细胞化学检测目的基因表达,进而与nHA/RHLC/PLA支架复合构建骨组织工程复合体.rhBMP-2及bFGF单独转染组、未干预BMSCs组设为对照.实时定量RT-PCR检测成骨相关基因(Ⅰ型胶原、骨连蛋白、骨桥蛋白)表达,扫描电镜观察细胞/材料复合情况.体外培养7 d后埋于自体股部肌袋,4周后取材,放射学及组织学方法检测成骨情况.[结果]转染后BMSCs的rhBMP-2及bFGF蛋白表达均呈阳性.复合材料后,其成骨相关基因表达明显高于rhBMP-2及bFGF单独转染组、未干预BMSCs组(P＜0.05,n=3),放射学及组织学检测也证实其异位成骨明显.[结论]采用rhBMP-2及bFGF双基因转染技术能够有效促进BMSCs成骨分化,与新型材料nHA/RHLC/PLA支架复合所构建的骨组织工程复合体,体现出良好的体内外成骨活力,进一步研究将探讨其针对大段骨缺损的修复效能.     

骨髓基质干细胞复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸构建组织工程骨

目的：了解骨髓基质干细胞（MSCs）复合纳米羟基磷灰石／聚乳酸（n-HA／PLA）构建组织工程骨的异位成骨作用。方法：选择6只新西兰白兔，实验组于动物脊柱左侧肌肉内植入MSCs复合n-HA／PLA构建的组织工程骨，对照组于右侧植入n-HA／PLA生物材料。术后4、8周取材，行溴脱氧尿嘧啶（Brdu）标记细胞检测和组织学观察。结果：术后4周，实验组材料边缘均可检测到Brdu标记的MSCs。术后4、8周，实验组材料内部有新骨形成，随着时间推移，新骨量增多，编织骨向板层骨过渡。对照组材料未见新骨形成。结论：MSCs复合n-HA／PLA构建的组织工程骨具有很好的异位成骨作用。     

在体种植后骨髓基质干细胞(BMSCs)的定位及成骨效应研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)与支架材料复合，并种植到动物体内后的定位及成骨情况。方法 分离培养绿色荧光蛋白(GFP)小鼠BMSCs，体外扩增后与猪脱细胞骨基质材料复合，植入裸鼠背部作为实验组，并以单纯材料植入作为对照组，8周后进行大体观察、常规组织学检查及荧光检测、结果 实验组移植物周围部成骨明显，GFP阳性细胞较多；中央部材料降解吸收，GFP阳性细胞少见。对照组成骨较少。结论 BMSCs作为种子细胞参与了骨重建，同时GFP示踪是观测BMSCs的一种较好方法。     

自体骨髓基质干细胞复合珊瑚修复犬下颌骨节段缺损的初步研究

目的应用自体骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)复合珊瑚构建组织工程化骨,修复犬下颌骨节段性缺损。方法体外扩增培养、成骨诱导犬BMSCs。将第二代细胞复合珊瑚后修复犬自体右侧3cm的下颌骨节段缺损(n=6);以单纯珊瑚植入缺损处为对照(n=6),术后12、32周分别通过影像学,大体形态观察,组织学和生物力学的方法检测骨缺损的修复效果。结果成骨诱导的BMSCs在珊瑚支架上生长良好。X线片显示12周时实验组骨痂较多,对照组材料明显吸收;32周时CT、X线片和大体观察显示术后实验组骨愈合良好,对照组为骨不连;骨密度检测示实验组显著高于对照组(P<0.05);组织学示实验组有较多成熟骨呈骨性愈合,对照组为纤维性愈合;生物力学测试实验组与正常下颌骨力学强度差异无统计学意义(P>0.05)。结论自体成骨诱导BMSCs复合珊瑚形成的组织工程化骨可修复犬下颌骨节段缺损。     

骨髓基质干细胞复合小肠黏膜下层体内异位成骨的研究

目的 观察骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建组织工程骨膜的异位成骨能力.方法 将常规方法培养的BMSCs与SIS复合(M1组)及进行成骨诱导培养BMSCs与SIS复合(M2组)植入兔(n=8)背部肌袋内作为实验组,以单纯SIS作为阴性对照.术后4、8、12周观察其成骨情况.结果 BMSCs在SIS支架上黏附、生长良好.植入体内4、8、12周,M2、M1、SIS组成骨量分别为(25.08±0.79)%、(18.81±0.42)%和(13.98±1.86)%,各指标M2组高于M1或SIS组(P<0.05),M1组高于SIS组(P<0.05).随着时间的延长,两实验组成骨量逐渐增加(P<0.05),SIS组的成骨量变化不明显(P>0.05). 结论 BMSCs与SIS复合构建组织工程骨膜在体内有异位成骨作用,而且经过成骨诱导的组织工程骨膜成骨作用更加明显.     

淫羊藿苷对BMSCs复合冻干骨支架体内异位成骨的效果

目的:探讨淫羊藿苷作用后的骨髓基质细胞(BMSCs)复合冻干骨支架的体内成骨能力。方法:取实验犬第三代BMSCs,将浓度为50ng/ml的淫羊藿苷添加到培养液中,设立空白对照组、阳性对照组(50ng/ml BMP-2)。将各实验组BMSCs与猪冻干脱钙骨支架复合培养7天后回植到裸鼠皮下,8周后取材,通过HE染色、X线灰度分析和标本钙磷含量的测定来评价其体内成骨情况。结果:大体标本看见个实验组细胞支架复合物均可见支架孔隙内有有软、硬组织长入;HE染色显示个实验组均可观察到新生组织为骨小梁样结构;影像学分析淫羊藿苷和BMP-2两组细胞支架复合物灰度值高于DMSO组更高于对照组,差别有统计学意义;淫羊藿苷组和BMP-2组细胞支架复合物的钙、磷离子含量高于其他3个实验组,差异有统计学意义,且各组中的磷、钙比值接近一个固定值。结论:淫羊藿苷可以有效的增强骨髓基质细胞(BMSCs)和冻干骨支架复合物在裸鼠体内的成骨能力。     

珍珠层聚乳酸人工骨复合成骨细胞体内异位成骨研究

目的探讨珍珠层聚乳酸(nacre／polylactic acid，N／P)人工骨与同种异体成骨细胞复合，植入体内后异位成骨的作用机制，以及作为骨组织工程支架材料的可行性。方法成年雄性新西兰大白兔18只，按2、4和8周3个时间点随机分成3组，每组6只。将体外培养的同种异体新西兰大白兔成骨细胞，种植到N／P人工骨材料上，并植入每只兔左侧背部皮下为实验组；以不复合成骨细胞的N／P人工骨材料植入右侧背部皮下作对照，分别于植入后不同时间点取材，经大体观察、组织学检查和免疫组织化学方法检测。结果实验组2周时材料周围有少许炎性细胞聚集，4周时有类骨质形成，8周时有成熟骨组织形成，其中可见骨髓腔；对照组2、4周时仅见大量纤维组织长入材料内，8周时材料内纤维组织增多，但无成骨发生。结论N／P人工骨可作为理想的骨组织工程支架材料。     

核心结合因子a1基因转染的骨髓基质干细胞复合生物衍生骨支架诱导异位成骨的研究

目的 观察核心结合因子a1（Cbfal）基因转染的人骨髓基质干细胞（hBMSCs）复合生物衍生骨支架异位成骨的效果。方法 雌性BALB／C裸鼠18只，随机分为3组：转染Cbfal基因的hBMSCs复合支架（A）、未转染细胞复合支架（B）和单纯支架组（C），每组6只。分别将各组人工骨植入裸鼠背部皮下，于术后4、8周行组织学、免疫组织化学和荧光原位杂交等检测。结果 Cbfal基因转染后，可诱导BMSCs骨钙素、Ⅰ型胶原呈阳性表达。体内植入后，A组成骨速度及成骨质量均明显优于其他组；植入细胞及宿主间质细胞呈骨钙素、骨形态发生蛋白2阳性表达；4周时，Y染色体阳性细胞数明显高于B组。结论 Cbfal基因转染BMSCs，能够诱导其向成骨细胞分化、上调骨形态发生蛋白2基因表达并提高移植细胞的生存率，明显促进异位成骨能力。     

脱细胞真皮支架复合骨髓基质干细胞构建前交叉韧带的实验研究

[目的]研究骨髓基质干细胞(BMSCs)复合脱细胞真皮(ADM)构建组织工程膝前交叉韧带(ACL),以及特定浓度转化生长因子TGF-β1和碱性成纤维细胞因子bFGF对骨髓基质干细胞生长、粘附及分化的影响.[方法]用ADM制备4股编织柱形及4股束形支架材料,将兔BMSCs接种于ADM支架上,分别用普通培养液(对照组)及含有特定浓度的TGF-β1和bFGF因子培养液(实验组)培养,通过绘制细胞增殖MTT曲线,碱性磷酸酶ALP测定,荧光显微镜及激光共聚焦扫描显微镜观察,分析ADM支架力学性能,细胞在支架材料中的生长增殖情况,以及其在ADM上的粘附情况.[结果]ADM的一般力学性能符合ACL要求,实验组BMSCs在ADM上生长数量及粘附效果明显优于对照组(P＜0.05),实验组相对于对照组细胞能够分泌更多的ALP (P ＜0.05).[结论] BMSCs复合ADM支架可能成为组织工程ACL材料替代移植材料,本浓度的TGF-β1及bFGF因子培养液对骨髓基质干细胞在ADM上的生长、粘附及分化有明显的刺激增强效果.     

涂层双相陶瓷复合BMSC修复骨缺损的实验观察

目的比较双相陶瓷（Biphasie calcium phosphate，BCP）经低结晶羟基磷灰石（Low crystalline hydroxyapatite，LcHA）涂覆改性后构建的组织工程化骨（LcBCP）与单纯BCP复合骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）修复兔桡骨节段性缺损的成骨差异。方法BMSCs复合LcBCP（实验组）修复12只兔左侧桡骨15mm缺损；BMSCs复合BCP（对照组）植入右侧桡骨同样大小缺损，植入后第4、8和12周取材，通过大体形态、组织学、影像学和生物力学检测骨缺损修复效果。结果BMSCs—LcBCP复合物在体内骨缺损处生长良好。X线检测显示实验组连接处骨痂形成，对照组连接处在各个时间点愈合稍差。12周时，实验组骨修复良好，髓腔再通，组织学显示板层骨形成，连接处骨性愈合；对照组连接处尚有较多编织骨形成。实验组和对照组生物力学检测有统计学差异。结论BMSCs—LcBCP复合物可修复兔桡骨节段性缺损，低品态羟基磷灰石涂层有助于增强双相陶瓷的成骨能力。     

玉米醇溶蛋白仿生组织工程支架材料体内外诱导成骨的实验研究

目的 检测玉米醇溶蛋白(zein)仿生三维多孔支架材料的生物相容性、骨诱导性和生物可降解性. 方法 将人骨髓基质干细胞(BMSCs)载人海藻酸钠或zein制成复合物.通过扫描电镜观察、噻唑蓝分析法以及碱性磷酸酶染色与定量检测,分别比较zein和海藻酸钠对BMSCs体外黏附、增殖和分化的影响.取24只8周龄裸鼠,随机分为两组,制成肌袋植入异位成骨模型.对照组单纯植入zein,实验组植入zein与兔BMSCs复合物.术后2、4、8和12周取材进行影像学和组织学观察. 结果 与海藻酸钠相比,zein在任何时间段均能够更好地促进兔BMSCs的体外增殖和分化,差异有统计学意义(P<0.05).同时,与单纯植入zein相比,BMSCs能够增强zein体内诱导成骨的作用. 结论 zein具有良好的生物相容性、骨诱导性和生物可降解性.     

Evaluation of Partially Demineralized Osteoporotic Cancellous Bone Matrix Combined with Human Bone Marrow Stromal Cells for Tissue Engineering: An In Vitro and In Vivo Study

Allogenous demineralized bone matrix (DBM) represents a potential scaffold for bone tissue engineering due to its close relation in structure and function with autologous bone, but its supply is often restricted by donor availability. Thus, an expanded source of human bone is needed. The aim of this study was to evaluate the capacity of partially DBM scaffolds derived from allogenous cancellous bone of osteoporotic femurs to support osteogenesis of human bone marrow stromal cells (BMSCs) in vitro and in vivo in order to assess their potential use in bone tissue-engineering strategies. Human BMSCs of passage 2 were seeded either on osteoporotic bone–derived DBM scaffolds or on normal bone–derived scaffolds and cultured in osteogenic medium for 14 days. To assess the in vitro proliferation potential and osteogenic differentiation of BMSCs on scaffolds, scanning electronic microscopy observation, DNA content assays, and measurements of alkaline phosphatase activity and osteocalcin content were applied; the results displayed no significant differences between the osteoporotic DBM group and the normal DBM group. After 2 weeks of subculture in vitro, the BMSC/DBM composites were subcutaneously implanted into athymic mice for 8 weeks to evaluate their in vivo bone-forming ability. Histological examination showed tissue-engineered bone formation in the DBM pores in both groups, and no significant differences were observed in either the extent or frequency of new bone formation between these two groups. Based on these results, it can be concluded that osteoporotic bone–derived DBM may serve as a promising scaffold for bone tissue engineering.     

自体骨髓间充质干细胞复合壳聚糖/羟基磷灰石支架修复兔膝骨软骨缺损

目的 探讨骨髓间充质干细胞(bone mesenehymal stem cells,BMSCs)复合壳聚糖(chitosan,CS)/羟基磷灰石(hydmxyapatite,HA)支架修复兔膝关节局部骨软骨缺损.方法 选健康日本大耳白兔36只,2～3月龄,体重1.7～2.0 kg,每只抽取自体骨髓4～6ml,体外分离培养BMSCs后以2×107/ml密度植于CS/HA支架上体外培养10 h,制成BMSCs-CS/HA支架复合物.将36只实验动物手术制成右膝股骨外侧髁负重区骨缺损模型后,随机分成A、B、C 3组,每组12只.A组植入BMSCs-CS/HA复合物,B组植入单纯CS/HA支架;C组不作任何植入,为空白对照组.分别于术后6周、12周各处死6只动物,取材后进行大体、组织学观察6根据改良Wakitani评分标准进行评分,评估软骨组织的修复情况,并行成组设计方差分析.结果 A组术后6周即可重建关节软骨缺损;修复软骨在观察期内逐渐变厚,软骨下骨有少量骨修复;术后12周透明软骨样修复,表面光整,与周围软骨色泽相近,软骨下骨有部分修复.而B组和C组12周时缺损区仍为纤维软骨样纤维组织修复,色泽浅黄.术后6、12周各组组织学半定量评分显示:股骨髁负重区修复A组评分明显优于B、C组(F=27.26,P＜0.05).结论 自体BMSCs复合CS/HA支架在体内环境下可形成透明软骨修复兔膝关节负重区骨软骨缺损.     

异种脱蛋白骨复合物修复大段骨缺损的血管化观察

[目的]探讨异种脱蛋白骨(heterogeneous deprotein bone,HDPB)复合物修复胫骨大段骨缺损过程中的血管化实验研究,为异种脱蛋白骨的临床应用提供实验依据。[方法]山羊24只,在右侧胫骨中下段截除胫骨总长度20%形成节段性骨缺损,实验组18只,植入异种DPB 自体MSCs rhBMP2,用半环槽式外固定器固定。于术后每隔4周对3只进行股动脉墨汁灌注后处死,取新骨组织制成厚切片观察血管化情况,以另6只植入自体骨为对照。[结果]术后4~24周,实验组与对照组血管表现数目逐渐增多,排列渐趋规则,血管大小、分布区域趋向均匀。测量血管数目和面积,结果显示4~24周2组血管数目和面积统计学分析差异无显著性意义(P>0.05)。[结论]异种脱蛋白骨复合物修复大动物大块骨缺损过程中血管化程度与自体骨相当,可以作为组织工程支架材料,并对其免疫原性和成骨能力等性能进行进一步研究。     

Quantitative assessment of scaffold and growth factor-mediated repair of critically sized bone defects.

An 8-mm rat segmental defect model was used to evaluate quantitatively the ability of longitudinally oriented poly(L-lactide-co-D,L-lactide) scaffolds with or without growth factors to promote bone healing. BMP-2 and TGF-beta3, combined with RGD-alginate hydrogel, were co-delivered to femoral defects within the polymer scaffolds at a dose previously shown to synergistically induce ectopic mineralization. A novel modular composite implant design was used to achieve reproducible stable fixation, provide a window for longitudinal in vivo micro-CT monitoring of 3D bone ingrowth, and allow torsional biomechanical testing of functional integration. Sequential micro-CT analysis showed that bone ingrowth increased significantly between 4 and 16 weeks for the scaffold-treated defects with or without growth factors, but no increase with time was observed in empty defect controls. Treatment with scaffold alone improved defect stability at 16 weeks compared to nontreatment, but did not achieve bone union or restoration of mechanical function. Augmentation of scaffolds with BMP-2 and TGF-beta3 significantly increased bone formation at both 4 and 16 weeks compared to nontreatment, but only produced bone bridging of the defect region in two of six cases. Histological evaluation indicated that bone formed first at the periphery of the scaffolds, followed by more limited mineral deposition within the scaffold interior, suggesting that the cells participating in the initial healing response were primarily derived from periosteum. This study introduces a challenging segmental defect model that facilitates quantitative evaluation of strategies to repair critically sized bone defects. Healing of the defect region was improved by implanting structural polymeric scaffolds infused with growth factors incorporated within RGD-alginate. However, functional integration of the constructs appeared limited by continued presence of slow-degrading scaffolds and suboptimal dose or delivery of osteoinductive signals.     

不同孔径多孔CPC材料修复兔大段骨缺损的实验研究

[目的]探讨孔径大小对多孔磷酸钙骨水泥(CPC)修复骨缺损能力的影响.[方法]用盐析法制备三种不同孔径(200 ～ 300 μm、300 ～ 450 μm、450 ～ 600 μm)但孔隙率相同(68.3±3.3)％的多孔CPC材料,将材料植入兔大段桡骨缺损模型,术后4、12周进行大体观察、X线检查、血清骨源性碱性磷酸酶(BALP)检测、组织学观察和生物力学检测.[结果]术后4、12周X线检查可见200～300 μm孔径材料骨缺损区愈合相对较好;4周时BALP检测200 ～ 300 μm组高于其他组,差异具有统计学意义(P＜0.05),12周BALP检测三组差异无统计学意义;12周组织形态计量学分析显示200 ～ 300μm材料组新生骨面积百分比最多,差异有统计学意义(P＜0.05);力学结果显示200 ～ 300 μm组材料的最大压缩载荷和弹性模量均好于其他两组,差异具有统计学意义(P＜0.05).[结论]孔径的大小可以影响骨生物材料在体内的成骨能力,本研究中较小孔径材料成骨能力更好,且更易达到成骨性能和力学性能的统一.     

万古霉素阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡甘聚糖治疗兔慢性感染性骨缺损

目的检验阳离子脂质体包封万古霉素复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡甘聚糖(nanohydroxyapatite/chitosan/koniac glucomannan,n-HA/CS/KGM)支架体内抗感染及骨修复活性。方法取6月龄健康新西兰大白兔51只,体重1.5～3.0kg,用金黄色葡萄球菌制备慢性感染性双侧胫骨骨缺损模型。将造模后4周存活的48只兔随机分为4组,每组12只。根据以下分组方法,分别于双侧骨缺损处植入相应支架。A组;清创后不作任何处理;B组:n-HA/CS/KGM空白支架组;C组:万古霉素复合n-HA/CS/KGM支架组;D组:万古霉素阳离子脂质体复合n-HA/CS/KGM支架组。治疗后8周行大体、骨缺损修复、组织学观察以及X线片、细菌学检查。结果实验动物造模后4周X线片显示明显骨质缺损、低密度影及软组织肿胀影,Norden评分均>3分,为(3.83±0.52)分。治疗后8周大体观察:C、D组窦道已愈合,A、B组仍有窦道;大体观察病理评分C、D组明显优于A、B组(P<0.05)。骨缺损修复观察:D组骨缺损已修复,骨缺损最长径显著优于A、B、C组(P<0.05)。X线片检查:C、D组可见新骨形成,A、B组可见骨膜反应及髓腔低密度影;Norden评分D组明显小于A、B、C组(P<0.05)。组织学观察:HE染色示C、D组可见大量骨小梁形成,纤维增生,未见明显感染迹象,A、B组仍可见中性粒细胞积聚;Smeltzer评分C、D组明显优于A、B组(P<0.05)。细菌学检查:C、D组阴性率明显高于A、B组(P<0.05)。结论万古霉素阳离子脂质体复合n-HA/CS/KGM支架可很好治疗兔慢性感染性胫骨骨缺损,为临床上治疗慢性感染性骨缺损提供了新思路。     

钛板固定的BMSC/松质骨基质复合物修复兔股骨缺损

目的: 观察钛板加强固定的骨髓基质细胞 (BMSC) /松质骨基质复合物修复股骨缺损的能力。方法: 体外培养兔BMSC经扩增, 诱导分化后复合同种异体松质骨基质, 植入自体股骨缺损区, 修复骨缺损, 钛板固定和加强, 植入 6、12周后经大体观察, 组织学检查, 骨磨片观察骨形成情况。结果: BMSC/松质骨基质复合物有很强的成骨作用, 实验组X线观察有骨形成, 组织学染色证实有新骨形成, 骨磨片显示钛板和新骨获得良好的结合。结论: 钛板加强的BMSC/松质骨基质可诱导修复兔股骨缺损, 为组织工程方法修复骨缺损提供了新的思路。